Introduction
הדור של זיכרון חיסוני בהעדר המחלה הוא הבסיס הפיזיולוגי של חיסון יעיל 1. לאחרונה, מערכות גישות מבוססות ביולוגיה חשפו כי חיסונים מוצלחים כגון חיסון הקדחת הצהוב, לגרום לאינדוקציה חזקה של תגובות חיסוניות מולדים והפעלה של מספר תת קבוצות של תאים דנדריטים (DCS), אשר בתורו, להוביל לmultilineage הפעלה של אנטיגן תאי T ספציפיים 2,3. מאז DCs הוא אוכלוסיית תאים חיסונית רק עם היכולת להפעיל תאי T הנאיביים אנטיגן ספציפי 4, חקר תפקודם במהלך החיסון הוא קריטי להבנת תגובות חיסוניות לחיסונים ולעצב אסטרטגיות עתידיות נגד פתוגנים מאתגרים.
מערכת מאפשרת מעקב של תת DCs שונה במהלך תגובה חיסונית לחיסונים תהיה רצויה כדי להקים קינטיקה מדויקת של הגירת DC לרקמות הלימפה, ולכן כדי לספקתובנה המנגנונים הפיסיולוגיים אחראים על הייזום של חסינות אדפטיבית חיסון ספציפי. הפוך גנטיקה מבוססת גישות מציעות האפשרות ליצירת שינוי, חיסונים-מוחלש חיים, שניתן להשתמש בניסוי עם מטרה זו. מאז יישומה על מחקר שפעת, גנטיקה הפוכה מבוסס פלסמיד הועסקה נרחבת כדי ליצור זני שפעת רקומביננטי כולל LAIVs. פרוטוקולים סטנדרטיים להצלת נגיפי שפעת רקומביננטי דורשים רב-transfection של קווי transfectable מאוד תא עם פלסמידים ambisense (הפקת שני RNA תחושה חיובי והשלילי) המכילים את הקטעים נגיפיים שפעת שמונה, כמו גם הגברה במערכת מתירנית כגון כליות כלבי מדין-דארבי ( תאי MDCK) ו / או ביצי תרנגולת embryonated 5. עם זאת, היישום של גנטיקה הפוכה כדי ליצור כלים מולקולריים כדי ללמוד את מנגנוני החיסון של חיסון נשאר נחקר.
הדורמודלים עכבר חדשים המאפשרים דלדול ספציפי של תת תא חיסון, כולל DCS, פתח אפשרויות חדשות כדי להבין את מנגנוני חיסון הבסיסיים שבבסיס הגנה-שהושרו חיסון. ההשוואה בין פונקציות משנה DC בעכברים ובבני האדם גילתה כי, במידה רבה, עכבר וDCs האנושי הם פונקציונלי הומולוגי 6,7, ממצאים אלה, ממליץ בחום שפיתוח המודלים עכבר מאפשר דלדול ספציפי של DCs במצב היציב ובמהלך המצבים דלקתיים, יכול לשמש כדי להבין את הפיסיולוגיה של תגובות DC בבני אדם. בשנים האחרונות מספר המודלים עכבר כבר נוצר נושא transgenes מבטא את הקולטן רעלן דיפתריה הקופי (DT) (DTR) תחת שליטתו של אזור האמרגן של גן של 8,9 עניין. מאז רקמות עכבר לא באופן טבעי להביע DTR, מודלים אלה מאפשרים דלדול מותנה של תת תא נושא את הגן הממוקד של עניין על חיסון עכבר עם DT. לפיכך, abili שלנוטאי לרוקן DCs הספציפי ולויקוציטים האחר in vivo בתהליכים פיסיולוגיים, שופר באופן משמעותי על ידי הפיתוח של ro מבוסס DTR. עם זאת, בעוד שדגמי העכבר מהונדסים אלה היו בשימוש נרחב כדי להבין את ontogeny של מערכת החיסון, היישום שלהם לפיתוח חיסון נבדק בקושי. כאן, על ידי שילוב של גנטיקה הפוכה שפעת ומפלצות מח עצם תחרותיות מבוססות DTR, אנו מציעים שיטה ללמוד קינטיקה של חסינות חיסון, כמו גם תפקוד גן בודד במהלך תגובה חיסונית לחיסוני in vivo. היישום של טכנולוגיה זו להערכה פרה-קלינית של חיסונים חדשים כנגד מחלות זיהומיות מאתגרות יכול לעזור לתרץ עיצוב חיסון ולבחון מועמדי חיסון in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים נערכו על פי פרוטוקולים שאושרו ובהתאם להנחיותיו של חוק ההגנה על בעלי חיים הגרמני. כל צוות ביצוע ניסויים בבעלי החיים עבר הכשרות על פי הקטגוריה B או C של הפדרציה של איגודים אירופיים מדע בעלי חיים מעבדה.
1. דור של רקומביננטי חי מוחלש שפעת חיסונים על ידי היפוך גנטיקה
הערה: הפרוטוקול מפורט עבור הדור של נגיפי שפעת רקומביננטי על ידי גנטיקה הפוכה שתוארה על ידי מחקרים קודמים 5 ונמצאת מחוץ להיקף של דו"ח זה. בקצרה, הצלה של חיסונים מותאמים קרים שפעת (CAV) נעשה בממשלה בכיתה השנייה בטיחות ביולוגית ברמת בטיחות ביולוגית 2 בלימה (BSL2), וכרוכה בצעדים שיפורטו להלן. פרוטוקול transfection והזיהום נובע כי ב מרטינז-Sobrido et al. 5.
- צור שפעת מותאמת קרה reassortantחיסון באמצעות כרקע המתח / אן ארבור מותאם הקר / 6/60 (H2N2), כמו גם את hemagglutinin (HA) וneuraminidase שונה (NA) של יחסי הציבור / 8/34 הזן / (H1N1) ( איור 1 א). השינוי בגן NA מורכב של החלפת PCR מבוססת של רצף נשמר בגבעול החלבון (שאריות 65-72) על ידי רצף cDNA קצר קידוד ovalbumin עוף (OVA) פפטיד -derived SIINFEKL (איור 1). פפטיד SIINFEKL הוא פפטיד immunodominant רב בהקשר של מעמד MHC H-2B-מוגבל אני תגובה של עכברי C57BL / 6 12.
- צלחת 10 6 293T תאים לכל גם ב6-גם צלחות באמצעות סרום 10% DMEM שור עוברי (FBS) בתוספת 1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / E).
- הכן תערובת transfection פלסמיד: הוסף 1 מיקרוגרם של כל אחד מפלסמידים קידוד cDNAs לPB2, PB1, הרשות הפלסטינית, NP, M, NS משפעת A / אן ארבור / 6 זן / 60 ו 1 מיקרוגרם של פלסמידים קידוד לNA -SIINFEKL וHA מ/ יחסי ציבור שפעת / 8/34. הוסף חימם מראש OptiMEM (15 μl עבור נפח סופי של 100 μl / טוב).
- דגירה תערובת transfection למשך 30 דקות ב RT.
- הוספת 100 μl של תערובת transfection / היטב דגירה במשך 16 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- שינוי תקשורת סלולארי על ידי DMEM 0.3% BSA 1% P / E ב33 ° C ו 5% CO 2 למשך 5 שעות.
- להוסיף תאי MDCK מתירנית 10 6 שפעת בDMSO המכיל 1 מיקרוגרם / מיליליטר של טריפסין מלבלב שור שטופל בקיטון chloromethyl L-1-Tosylamide-2-phenylethyl (TPCK-טריפסין). לשמור על שיתוף תרבויות 293T-MDCK עבור 2 - 3 ימים ב 33 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאסוף supernatants של שיתוף תרביות תאי MDCK-293T וברור על ידי צנטריפוגה ב 260 XG במשך 5 דקות.
- לחסן 9 - ביצי embryonated עוף 10 יום-ישן בתנאים סטריליים. כדי לעשות זאת, לעשות חור בחלק העליון של קליפת הביצה כפי שצוין על ידי אח מרטינז-Sobrido אל. 5.
- מכסה את שנינות קליפת הביצהh נמס שעווה באמצעות מקלון צמר גפן ולדגור על ביצי העוף מחוסנת במשך 3 ימים ב 33 מעלות צלזיוס.
- לקצור את נוזל allantoic מהנגוע ביצי embryonated: לשטוף את קליפות ביצים עם אתנול 70%. פתח את הביצה עם הסדק מאוד בעדינות בחלק העליון ולהסיר את קרום allantoic באמצעות מלקחיים סטרילית. השתמש פיפטה 10 מיליליטר לאסוף כמה שיותר נוזלים ככל האפשר (בדרך כלל 6 - 10 מיליליטר). צנטריפוגה ב 260 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את נוזל allantoic פינה לצינורות חדשים.
חסינות 2. מעקב חיסון ספציפית
- איתור של תאים דנדריטים נושאות פפטיד (DCS)
- לחיסון עכבר, להרדים עכברים עם isoflurane 5% בחמצן באמצעות אידוי דיוק. השתמש פיפטה 200 μl לנהל 50 μl של PBS המכיל 10 יחידות 3 יוצרי פלאק (pfu) של החיסון המבטא את הפפטיד SIINFEKL באמצעות טיפות ישירות לנחירי העכבר.
- שלושה ימים לאחר חיסון-, euthanizעכברי דואר באמצעות ההרדמה isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם.
- הרם את עור העכבר על קו האמצע ממש מתחת לבית החזה עם מלקחיים ולחתוך חתך קטן דרך העור עם מספריים. מנקודת החתך, לעשות 3-5 סנטימטר לחתוך ארוך דרך העור לשני את הראש וזנב, אז שני חתכים 2 סנטימטר מקו האמצע רוחבי מכל קצה. לקלף את העור כדי לחשוף את חללי הצפק ובית חזה. בזהירות לחתוך דרך הקרומים המקיפים את הצפק לחשוף את בית החזה.
- כדי לגשת למדיאסטינום לחתוך diafragma והחלק התחתון של צלעות הכלוב. מצא ולהסיר 2 בלוטות לימפה mediastinal (mLNs), מעט גב ורוחבי בסמוך לבלוטת התימוס, מדיאלית סמוכה לעורק brachiocephalic, ליד הצד הגחוני של קנה הנשימה.
- למסוק mLNs להשתמש במלקחיים מעוקלים. מניחים מלקחיים מתחת לבלוטות הלימפה ולמשוך אותם בעדינות. הנח בלוטות לימפה בצלחת 6 היטב המכילה 1 מיליליטר של DMEM ולהסיר כל connectiיש או רקמת שומן המקיפה את הצומת.
- להקניט כל דגימה ביסודיות עם שתי 26 מחטי G מצורפים 1 מיליליטר מזרקים. להקניט את בלוטות לימפה, להחזיק אותו למטה עם מחט אחת תוך שבירה פתוחה הבלוטה לימפה עם המחט אחרת. כאשר זה נעשה בצורה נכונה, תאים מרוכזים מתפוצצים מהבלוטה לימפה הם נצפו בקלות בתקשורת. להעביר את כל חומר הרקמה דרך מסנן ניילון 70 מיקרומטר להשיג השעיות תא בודדות.
- השעיות צנטריפוגה תא בודדות במשך 10 דקות ב 260 XG בצנטריפוגה בקירור. Resuspend התא גלולה ב 2 מיליליטר של תאי דם אדומים lysing (RBCL) מאגר לlyse תאי דם אדומים. לאפשר תמוגה כדי להמשיך במשך 3 דקות ב RT.
- לנטרל חיץ RBCL באמצעות צנטריפוגה וresuspension תא 2 מיליליטר של PBS קר כקרח.
- תאי צלחת בצורת U 96-גם צלחות בריכוז של 10 7 תאים / מיליליטר בנפח סופי של 100 μl.
- לניתוח cytometry זרימה, FC-קולטני תא לחסום באמצעות1 מיקרוגרם של נוגדני CD16 / CD32-העכבר אנטי לכל 10 6 תאים במשך 15 דקות על קרח.
- צלחות ולהשליך צנטריפוגה supernatants ידי מצליף צלחת. דגירה בארות בודדות עם שילוב נוגדן פני השטח של בחירה. בדרך כלל לזיהוי של תאים דנדריטים בבלוטות הלימפה, קוקטייל הנוגדנים צריך לכלול: 0.25 מיקרוגרם של אנטי-CD11c, 0.25 מיקרוגרם של CD11b, 0.5 מיקרוגרם של כיתת MHC II, 0.25 מיקרוגרם של CD103 ו0.15 מיקרוגרם של CD8α בנפח סופי של 100 μl.
- לgating השלילי, להוסיף 0.25 מיקרוגרם של אנטי-CD3, CD19, NK1.1 או קוקטייל שושלת (איור 2 א). ניתן למצוא אסטרטגיות gating אלטרנטיביות כמו גם פרוטוקולים לפיצוי הולם של צבעי ניאון מרובים באתר האינטרנט של פרויקט הגנום החיסוני. בנוסף לסמנים של בחירת המשטח, להוסיף 1 מיקרוגרם של נוגדנים נגד H-2K ב חייב SIINFEKL לקוקטייל. נוגדן זמין מסחרי זה יאפשר להדמיה של DCs אניn שפפטיד SIINFEKL קשור אל פני השטח I. כיתת MHC
- דגירה תאים עם נוגדני משטח למשך 30 דקות על קרח. הגן על צלחת מהאור. צלחות צנטריפוגה ב 260 XG במשך 5 דקות ולשטוף עם 2 מיליליטר של PBS פעמיים. העברת תאי cytometry זרימת צינורות לניתוח.
- הערכה של התפשטות תאי T חיסון הספציפי
- להשיג תאי T תורם מעכברי TCR-מהונדסים זמינים מסחרי (OT-עכברים) (C57BL / 6-Tg (TCR aTcrb) 1100Mjb / י) שבו כל תאי CD8 T שנוצרו הם ספציפיים לפפטיד SIINFEKL. להרדים עכברים על ידי ההרדמה isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם. קציר טחול על ידי ביצוע חתך בחלל הבטן. הנח טחול / s ב 2 מיליליטר של DMEM / טחול ולהסיר רקמת חיבור ושומן.
- צור השעיות תא בודדות מטחול בעקבות ההליך המתואר ב2.1.2 ו2.1.3.
- כדי להעשיר את ההשעיה התא בודדת על תאי T נוסף, תחול פרוטוקולי הפרדת חרוז מגנטיאו באמצעות הליכי בחירה חיוביים או שליליים 12. להבדיל מתורם תאי נמען, להשתמש בעכברי congenic כך שלמשל עכברי נמען להביע CD45.1 סמן יקוציט תוך תאי T התורם להביע 12 CD45.2.
- לתייג תאי T, דגירתם ב 1 מיליליטר של PBS המכיל 5 מיקרומטר של succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE) בצפיפות תאים אופטימלית של 5 x 10 6 תאים / מיליליטר. דגירה תאים במשך 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס מוגנות מהחשיפה לאור. לאחר דגירה, תאי צנטריפוגות ב 260 XG ל5 דקות, supernatant פסולת, ותאי resuspend ב 3 מיליליטר בסרום שור עוברי (FBS) כדי לנטרל CFSE.
- תאי צנטריפוגה ב 260 XG במהלך 10 דקות וגלולות בנפח מספק של PBS, כך שפתרון של 100 μl מכיל 2 x 10 6 תאים. להשרות עכברי congenic נמען עם 2 x 10 6 תאים / עכבר באמצעות הזרקת סינוס רטרו מסלולית 13.
- להרדים עכברי נמען ב -3 ימים, 4 ו -5 שלאחרחיסון באמצעות הרדמה isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם. קציר בלוטות לימפה mediastinal ולהכין השעיות תא בודדות לcytometry זרימה כפי שצוין ב2.1.2-2.1.5.
- לזהות תאי תורם על ידי צביעת השעיות תא בודדות מקוקטייל נוגדנים המכיל 100 μl: 0.25 מיקרוגרם של אנטי עכבר CD3, CD4 ו CD8 נוגדנים; 0.5 מיקרוגרם של אנטי עכבר CD45.1 או נוגדן CD45.2 (תלוי בהפנוטיפ של תאי תורם). השאר את ערוץ FL-1 של cytometer הזרימה הפתוח (FITC) כדי לקבוע את פרופיל הדילול של CFSE 12 (איור 2).
3. עכברים כימרי לנתח תגובות חיסון גן ספציפי
הערה: הדור של מפלצות מח עצם תחרותיות באמצעות מודלים עכבר מבוסס DTR מאפשרת האפליה של פונקציות תא ספציפי בתגובה חיסונית לחיסונים. כאן אנו מראים אסטרטגיה נוספת שבו שילוב של DTR-להביע תורם גאמות עם תאים מעכברי היתרי נוקאאוט ללמוד פונקציות ספציפיות גנים במהלך חסינות בתאי תא ספציפיים. בדוגמא שאנחנו מייצרים עכברים עם מחיקה ספציפית של קולט חיוג כמו 3 (TLR3) בLangerin + CD103 + DCs.
- הכנת תאי תורם מח העצם
- לעבוד תחת ממשלת רמת בטיחות ביולוגית השנייה. למנוע זיהום על ידי שימוש במכשירי autoclaved באופן בלעדי.
- כדי ליצור עכברי chimeric מח עצם, להשתמש CD45.1 congenic + C57BL / 6 נקבות עכברים כמקבלים, ולהשתמש TLR3 - / -, Langerin-DTR / EGFP, או עכברי WT להביע CD45.2 + כתורמים. שימוש בעכברי תורם והמקבל congenic מאפשר ההתמיינות של תאי תורם והמקבל באמצעות cytometry זרימה וזה מאפשר קליטתם כדי להיות מוערכת.
- להשיג תאי מח עצם תורם, להרדים עכברי תורם עם ההרדמה isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם. עם מספריים חדים לבצע חתכים סביב הקרסוליים כך שמ 'שרירי שבית חשופים.
- מלקחיים בוטים באמצעות למשוך עור ופרווה עכבר בעדינות מהקרסול לכיוון הירכיים כך ששרירי הרגליים גלויים.
- עם מספריים חדים לחתוך את הרגליים עכבר בגובה של הירכיים ומעל לראש של עצם הירך.
- הנח את הרגליים על צלחת פטרי ועל קרח. לעבוד מהר ולהסיר את כל השרירים כדי לחשוף את העצמות.
- עצמות ירך נפרדות וtibiae. מניחים את עצמות בפתרון של 70% אתנול למשך 5 דקות כדי להסיר חיידקים אפשריים ולמקם אותם באופן מיידי על עוד צלחת פטרי המכילה 5 מיליליטר של סרום ללא DMEM. עצם לחתוך מסתיים באמצעות מספריים חדים ולשטוף את מוח העצם לDMEM. כדי לעשות זאת, 1 מיליליטר הסומק של DMEM לתוך העצם על ידי החדרת מחט 26 G מצורפת מזרק 5 מיליליטר. ודא העצמות נראו לבנות (ריק) לאחר שטיפה.
- לאסוף את כל תאי מח עצם מעכברי תורם ב 10 מיליליטר של DMEM. צור השעיות תא בודדות מתאי מח עצם על ידי העברת הקציר דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.
- Clמתלי אוזן תא בודדים של תאי מח עצם על ידי צנטריפוגה ב 260 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה בקירור. גלולה תא הגלול ב 10 מיליליטר של PBS. רוקן תאי דם אדומים באמצעות פתרון RBCL כפי שמתואר ב2.1.3 ו2.1.4.
- ספירת תאי מח עצם או באמצעות hemocytometer או דלפק תא אוטומטי. להעריך את כדאיויות תא על ידי קביעת תאים מתים באמצעות צביעת trypan הכחולה 13. בצורה אופטימלית, תשואות חיה אחת סביב 3 x 10 7 תאי דם לבנים / עכבר עם יכולת קיום של לפחות 80%.
- במקרה של כוללת מפלצות מח עצם, להכין TLR-3 - תאים או תורם WT - /. ריכוז התא האופטימלי הוא 2 x 10 7 תאים / מיליליטר מאז 2 x 10 6 תאים בשל PBS 100 μl ישמשו להשתלה. אם לא נעשה שימוש באופן מיידי, לשמר תאי תורם ב -80 ° C תוך שימוש בטכניקות הקפאה איטיות וFBS עם 10% DMSO. למודל chimeric המעורב, לערבב תאים וLangerin-DTR-תורם TLR3 - / -
- הקרנת עכבר והשתלה
- מכשיר את נקבות עכברים בין 6-8 שבועות של גיל בirradiator מקור צסיום -137. תן עכברים שתי מנות של 550 שעות לגזרים rad 4. הקרנת פיצול ממזערת רעילות בכבד חריפה ולכן מקטינה קטלני עכבר בשל פרוטוקול ההקרנה.
- לאחר הקרנה, לשמור על עכברים תחת טיפול באנטיביוטיקה במשך שבועיים. תן אנטיביוטיקה עם מי שתייה ב2.5-5 מ"ג של Baytril / קילוגרם.
- 2 - 4 שעות לאחר ההקרנה השנייה, עכברי השתלת תאי מח עצם תורם לוריד. לבצע ההזרקה של תאי תורם באמצעות הזרקת סינוס רטרו מסלולית 13 ותחת ההרדמה isoflurane באמצעות נפח מרבי של 100 של PBS μl המכיל 2 x 10 6 תאים.
- ארבעה שבועות לאחר ההשתלה, להעריך engraftment במדגם של 100μl של דם היקפי באמצעות cytometry זרימה באמצעות מכונה מסוגלת לקרוא לפחות שני צבעים. להבחין בין התורם ומקבל תאי רדיו עמיד, להשתמש CD45.1 ונוגדנים אנטי עכבר CD45.2 באמצעות דילולים בין 1/100 ו1/200 שכותרתו fluorescently הזמינות מסחרי. engraftment האופטימלית של תאי תורם צריכה להיות לפחות 80% מתאי hematopoietic הכולל בדם היקפי.
- דלדול חיסון וממוקד
- לחסן עכברים עם חיסון שפעת מוחלש חי רקומביננטי באמצעות intranasal. לחיסון עכבר, להרדים עכברים עם isoflurane 5% בחמצן באמצעות אידוי דיוק. השתמש פיפטה 200 μl לנהל 50 μl של PBS המכיל 10 יחידות 3 יוצרי פלאק (pfu) של החיסון.
- על מנת ליצור את מודל העכבר הסופי, טיפול בעכברים עם 50 ng של DT המדולל ב -50 μl של PBS intranasally. לנהל DT טיפה אחר טיפה ישירות לנחיריים של עכברים מורדמים, כמתואר ב3.3.1. מיל פינוקCe עם מינון יומי התחלת טיפול ביום -2 לפני החיסון עד יום 2 לאחר חיסון (איור 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דור של חיסונים לשפעת חיים-מוחלשים רקומביננטי יכול להיות מושגת על ידי transfection של פלסמידים קידוד שמונה המקטעים של נגיף שפעת בשליטת יזמים דו-כיוונית 5. חיסון נגד שפעת מותאמת קר בדרך כלל מכיל שישה מקטעים של זן מותאם קר, כמו גם את HA ו NA של זן השפעת של בחירה (למשל, H1N1) (איור 1 א). העיקרון קר-ההסתגלות מבוסס על שכפול וירוס מוגבל ב 33 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה של דרכי נשימה העליונה (אגד) בעכברים ובבני אדם 14. לכן, החיסון יכול לשכפל באגד במידה מסוימת, אבל לא יכול לגרום לדלקת ריאות בדרכי נשימה התחתונה. שימוש בטכנולוגית ה- PCR היתוך, אזור נשמרים בגזע של neuraminidase הנגיפי (NA) הוחלף לפפטיד נגזר OVA עקיב (SIINFEKL) (איור 1).
לעקוב אחר תגובות חיסון ספציפי במחקרי קינטיקה יש לנו יתרון של פפטידים נלקח למעקב נובעים מניסוח החיסון, כמו גם המודלים של עכברי chimeric. בין יום 3 ו -6 לאחר חיסון-, SIINFEKL נושאות ניתן להבחין CD103 + DCs בימפה ניקוז ריאות צמתים 12 (איור 2 א). cytometry זרימת Multiparametric מאפשר כימות של מצגת אנטיגן נגזר חיסון בזמן אמת. בנוסף, עירוי של תאי T SIINFEKL ספציפי מאפשר כימות של תגובות חיסון ספציפי CD8 T תא (איור 2).
כדי להעריך את פונקציות גן ספציפי בחיסון שפתחנו מודל עכבר שילוב טכנולוגית DTR ומפלצות תחרותיות מח עצם (איור 3 א). בעשותם כך, אובדן תפקוד הגן היה ממוקד לתאי תאים ספציפיים במהלך תגובה חיסונית לחיסון (איור 3, C).
52,803 / 52803fig1.jpg "/>
איור 1. הנדסה של LAIVs למעקב. () מגזרי שפעת משובטים בפלסמידים ambisense (עמוד השדרה pDZ כפי שתואר על ידי מרטינז-Sobrido et al. 5) הייתה transfected לתוך תאי 293T באמצעות Lipofectamine 2000. 24 שעות לאחר transfection, supernatants המתקבל מתאי 293T שמשו לתאי שפעת מתירנית מעיל כליות כלבי מדין-דארבי (MDCK) בנוכחות של 1% מטריפסין TPCK. כל הפרוטוקול בוצע על 33 מעלות צלזיוס. supernatants ויראלי מתאי MDCK היה מחוסן אז לביצי תרנגולת embryonated 9 יום בן שלושה ימים ב 33 מעלות צלזיוס. הצלת ויראלי אושרה על ידי הגברה PCR מבוססת נגיפית הגנום ורצף. (ב) כדי להכניס את הפפטיד SIINFEKL נגזר OVA לneuraminidase השפעת (NA), אזור שמור (שאריות 65-72) של גן NA של / פורטו / 8/34 (H1N1) ריקו הוחלף לcDNA קצר קידוד פפטיד SIINFEKL באמצעות היתוךPCR. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. חיסון התחקות טכניקות. () נודד DCs היו מגודר בבלוטות לימפה mediastinal (mLNs) כמעמד MHC II תאים היי CD11c תרופה. בדוגמא, CD103 + DCs הנודדים נושאי אנטיגן זוהו כCD103 + H-2 תאי B -SIINFEKL + על ידי cytometry זרימה. תאי T OT-אני-ספציפי (ב) היו חדורים לעכברים באותו היום של חיסון. ארבעה ימים לאחר מכן, תאים נאספו מבלוטות הלימפה של עכברים מחוסנים והעריכו לפרופיל התפשטותם. דילול CFSE בערוץ FL-1 שימש כמדד לחלוקת תא. CAV: חיסון מותאם קר; CAV SIINFEKL :. חיסון מותאם קר להביע פפטיד SIINFEKL נגזר OVA אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. מחקרי תפקוד גן. () סכמטי של מפלצות מח עצם (BMC) ואסטרטגיות חיסון. תוספת (-2 ו+2 מתייחסים לממשל של DT יומיים לפני או אחרי חיסון). (ב) לDT בעכברי chimeric להביע Langerin-DTR מאפשרת דלדול ספציפי של Langerin נודד + DCs coexpressing CD103 בריאות. (ג) השוואתי ניתוח של תאי T חיסון ספציפי בעכברי chimeric. איתור של NP 366-374 -specific תאי CD8 T נעשה באמצעות צביעת dextramer מסחרית."Target =" _ 803fig3large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה אנו מתארים כיצד הפוכים גנטיקה ומודלים של עכברים chimeric יכול להיות מנוצלים כדי להבהיר את המנגנונים הפיזיולוגיים ומולקולריים של חסינות שנוצר עקב חיסון. גנטיקה הפוכה שפעת הוקמה במעבדות רבות ומלאה תפקיד ראשי בהבנת הפתוגנזה שפעת, שכפול והעברה 17. נקודת מפתח בפרוטוקול שלנו היא הצלה של חיסונים לשפעת מותאם קרים להביע epitopes הזרה. בעוד האסטרטגיה של החדרת cDNAs הקצר לגבעול של neuraminidase תוארה על ידי קבוצות רבות, החוקר צריך לוודא ששום מוטציות נוספות הציגו במהלך ייצור חיסון בביצים ושהחיסון הוא מסוגל לשכפל בדרכי הנשימה ללא גרימה דלקת ריאות 5,12. מאז הן הגבעול של neuraminidase הנגיפי, כמו גם באזורים אחרים של הגנום השפעת כגון מגזר גן NS ומגזר PB1 לאפשר הקצאה של רצפי חוץ 19,20, שינויים של הפרוטוקול שלנו יכולים להיות מנוצל כדי להוסיף פפטידים זרים נוספים ל, למשל, להבין את ההיררכיות של התגובה החיסונית של תאי T כנגד נגיף שפעת, נקודת מפתח לעיצוב חיסון רציונלים.
על ידי שילוב של חיסונים למעקב ודלדול של תת DC מבוסס DTR הצלחנו למקד אובדן תפקוד גן לתת תא ספציפי. טכנולוגיה זו יושמה לפני להבהיר תגובה חיסונית לפתוגנים 21, אבל לא לנתח מסלולים אחראים להגנת חיסון. בשל הזמינות של מודלים מבוססי DTR והגמישות של הטכניקה ליצירת עכברי chimeric, טכניקה זו יכולה להיות מורחבת נוספת לאוכלוסיות נוספות לויקוציטים וגנים עם פונקציות חיסוניות. חשוב לציין כי טיפול DT עלול גם לגרום לדלדול של תת נוספים DC להביע langerin כגון CD8α + DCs ברקמות הלימפה. לכן מומלץ מאוד לperform מחקר מנה-תגובה להעריך את ההשפעות של טיפול DT. אזהרת פוטנציאל של המודל שלנו היא שהשתלת מח עצם אלוגנאית הוכחה להקטין אנטי כולל חסינות תא CD8 T 15. כך, זהירות צריכה להיות למימוש בעת השוואת נתונים בין עכברים מושתלים ושאינו מושתלים.
כמה פתוגנים אנושיים מפתח לאשר יש צורך בדחיפות חיסונים ניתן ללמוד במודלים של עכברים באמצעות פתוגנים wild-type או תחליפי עכבר. אלה כוללים נגיף שפעת, Plasmodium, ונגיף האבולה. הטכניקות המוצעות במחקר זה עשויות לסייע להבין את המנגנון הבסיסי של חיסונים ניסיוניים נגד פתוגנים אלה, ולכן, לתרץ עיצוב חיסון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
