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Immunology and Infection

Chimeric माउस मॉडल में संयोजक फ्लू के टीके की intranasal प्रशासन mucosal प्रतिरक्षण अध्ययन करने के लिए

Published: June 25, 2015 doi: 10.3791/52803
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Emerging Viruses, Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology

Introduction

रोग के अभाव में प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति की पीढ़ी कुशल टीकाकरण 1 की शारीरिक आधार है। हाल ही में, सिस्टम जीव विज्ञान आधारित दृष्टिकोण ऐसी पीत ज्वर के टीके के रूप में सफल टीके, बारी में, सीसा antigen- की सक्रियता multilineage को जो सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs), के कई कैंपेन्स की सक्रियता का एक मजबूत प्रेरण प्रेरित पता चला है कि विशेष टी कोशिकाओं 2,3। DCs विशिष्ट प्रतिजन भोले टी कोशिकाओं 4 को सक्रिय करने की क्षमता के साथ ही प्रतिरक्षा सेल की आबादी रहे हैं, टीकाकरण के दौरान उनकी कार्यप्रणाली के अध्ययन के टीके के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने के लिए चुनौती है और रोगजनकों के खिलाफ भविष्य की रणनीति डिजाइन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

टीके के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान विभिन्न DCs कैंपेन्स की ट्रेसिंग अनुमति प्रणाली प्रदान करने के लिए इसलिए ल्य्म्फोइड ऊतकों को डीसी प्रवास का सही कैनेटीक्स स्थापित करने के लिए वांछनीय होगा, औरटीका-विशिष्ट अनुकूली उन्मुक्ति की दीक्षा के लिए जिम्मेदार शारीरिक तंत्र में अंतर्दृष्टि। आनुवंशिकी के आधार पर उल्टा दृष्टिकोण, संभावना संशोधित उत्पन्न करने के लिए इस उद्देश्य के साथ प्रयोगात्मक इस्तेमाल किया जा सकता है कि जी-तनु टीके प्रदान करते हैं। इन्फ्लूएंजा अनुसंधान पर इसके कार्यान्वयन के बाद से, प्लाज्मिड आधारित रिवर्स आनुवंशिकी व्यापक रूप से LAIVs सहित पुनः संयोजक इन्फ्लूएंजा उपभेदों उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया गया है। मानक प्रोटोकॉल (पुनः संयोजक इन्फ्लूएंजा वायरस ऐसे Madin-डार्बी कुत्ते गुर्दे के रूप में एक अनुमोदक प्रणाली में प्रवर्धन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आठ इन्फ्लूएंजा वायरल खंडों युक्त ambisense plasmids के साथ अत्यधिक transfectable सेल लाइनों (सकारात्मक और नकारात्मक भावना शाही सेना दोनों के उत्पादन) के बहु-अभिकर्मक की आवश्यकता को बचाने के लिए MDCK) कोशिकाओं और / या चिकन embryonated अंडे 5। हालांकि, टीकाकरण का प्रतिरक्षा तंत्र का अध्ययन करने के क्रम में आणविक उपकरणों उत्पन्न करने के लिए रिवर्स आनुवंशिकी के आवेदन बेरोज़गार बना रहता है।

पीढ़ीDCs सहित प्रतिरक्षा सेल सबसेट के विशिष्ट कमी की अनुमति के नए माउस मॉडल की, टीका-हासिल संरक्षण अंतर्निहित बुनियादी प्रतिरक्षा तंत्र को समझने के लिए नई संभावनाएं खोल दिया है। चूहों और इंसानों में डीसी सबसेट कार्यों के बीच तुलना में एक हद तक, माउस और मानव DCs दृढ़ता, मुताबिक़ कार्यात्मक इन निष्कर्षों 6,7 हैं माउस मॉडल का विकास स्थिर अवस्था में DCs के विशिष्ट कमी की इजाजत देने का सुझाव है कि, पता चला है कि और भड़काऊ शर्तों के दौरान, मानव में डीसी प्रतिक्रियाओं के शरीर क्रिया विज्ञान को समझने के लिए सेवा कर सकता है। हाल के वर्षों में माउस मॉडल की एक संख्या ब्याज 8,9 की एक जीन के प्रमोटर क्षेत्र के नियंत्रण में बंदर का डिप्थीरिया विष (डीटी) रिसेप्टर (डीटीआर) व्यक्त ट्रांसजीन ले जाने उत्पन्न किया गया है। माउस ऊतकों स्वाभाविक रूप से डीटीआर व्यक्त नहीं करते हैं, इन मॉडलों डीटी के साथ माउस टीका पर ब्याज की लक्षित जीन ले जाने सेल सबसेट की सशर्त कमी अनुमति देते हैं। इस प्रकार, अपने abiliशारीरिक प्रक्रियाओं के दौरान vivo में विशिष्ट DCS और अन्य ल्यूकोसाइट्स व्यय करना Ty, बहुत डीटीआर आधारित भूमिका के विकास के द्वारा बढ़ाया गया है। इन ट्रांसजेनिक माउस मॉडल प्रतिरक्षा प्रणाली के व्यक्तिवृत्त को समझने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है हालांकि, जबकि, वैक्सीन के विकास के लिए अपने आवेदन पत्र शायद ही परीक्षण किया गया है। इधर, इन्फ्लूएंजा रिवर्स आनुवंशिकी और डीटीआर आधारित प्रतिस्पर्धी अस्थि मज्जा काइमेरा संयोजन से, हम vivo में टीके के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान टीका उन्मुक्ति के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत जीन समारोह के कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए एक विधि का प्रस्ताव। चुनौतीपूर्ण संक्रामक रोगों के खिलाफ नए टीकों के पूर्व नैदानिक ​​मूल्यांकन के लिए इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग वैक्सीन डिजाइन युक्तिसंगत बनाने के लिए और इन विवो में वैक्सीन उम्मीदवारों का परीक्षण करने में मदद कर सकता है।

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Protocol

पशु प्रयोगों को मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल के लिए और जर्मन पशु संरक्षण कानून के दिशा निर्देशों का पालन अनुसार आयोजित की गई। पशु प्रयोगों से बाहर ले जाने सभी कर्मचारियों को वर्ग बी या यूरोपीय प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघों के महासंघ के सी के अनुसार प्रशिक्षण कार्यक्रम पारित कर दिया।

रिवर्स आनुवंशिकी द्वारा पुनः संयोजक लाइव तनु फ्लू के टीके के 1. पीढ़ी

नोट: रिवर्स आनुवंशिकी द्वारा पुनः संयोजक इन्फ्लूएंजा वायरस की पीढ़ी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल पिछले अध्ययनों 5 से वर्णित है और इस रिपोर्ट के दायरे से बाहर कर दिया गया है। संक्षेप में, ठंड में रूपांतरित फ्लू के टीके (CAV) का बचाव जैव सुरक्षा स्तर के नीचे एक जैव सुरक्षा वर्ग द्वितीय कैबिनेट में 2 (BSL2) रोकथाम किया है, और नीचे विस्तृत कदम शामिल है। अभिकर्मक और संक्रमण प्रोटोकॉल की है कि इस प्रकार है मार्टिनेज-Sobrido एट अल। 5।

  1. एक reassortant ठंड में रूपांतरित इन्फ्लूएंजा उत्पन्नपृष्ठभूमि के रूप में ठंड में रूपांतरित तनाव ए / एन आर्बर / 6/60 (H2N2), साथ ही hemagglutinin (हेक्टेयर) और एक संशोधित neuraminidase (एनए) ए / पीआर / 8/34 (H1N1) के तनाव के (का उपयोग टीका चित्रा 1 ए)। एनए जीन में संशोधन चिकन ovalbumin (ओवीए) व्युत्पन्न पेप्टाइड SIINFEKL (चित्रा 1 बी) एन्कोडिंग एक छोटी सीडीएनए अनुक्रम द्वारा प्रोटीन डंठल (अवशेषों 65-72) में संरक्षित अनुक्रम का एक पीसीआर आधारित प्रतिस्थापन के होते हैं। SIINFEKL पेप्टाइड C57BL / 6 चूहों 12 की प्रतिक्रिया मैं-प्रतिबंधित एच -2 बी MHC वर्ग के संदर्भ में एक अत्यधिक immunodominant पेप्टाइड है।
  2. 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / ई) के साथ पूरक DMEM के 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) का उपयोग 6 अच्छी तरह प्लेटें में अच्छी तरह से प्रति प्लेट 10 6 293T कोशिकाओं।
  3. प्लाज्मिड अभिकर्मक मिश्रण तैयार: जोड़ें एनए के लिए एन्कोडिंग PB2, PB1, पीए, एन पी, एम, एन एस फ्लू से ए / एन आर्बर / 6/60 तनाव के लिए cDNAs और plasmids के 1 माइक्रोग्राम एन्कोडिंग plasmids में से हर एक के 1 माइक्रोग्राम -SIINFEKL औरइन्फ्लूएंजा ए / पीआर / 8/34 से हा। (/ अच्छी तरह से 100 μl के अंतिम मात्रा के लिए 15 μl) OptiMEM पूर्व गर्म जोड़ें।
  4. आरटी पर 30 मिनट के लिए अभिकर्मक मिश्रण सेते हैं।
  5. अच्छी तरह से / अभिकर्मक मिश्रण के 100 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
  6. 5 घंटा के लिए सीओ 2 33 डिग्री सेल्सियस पर DMEM 0.3% बीएसए 1% पी / ई से सेल मीडिया को बदलें और 5%।
  7. एल-1-Tosylamide-2-phenylethyl chloromethyl कीटोन (TPCK-ट्रिप्सिन) के साथ इलाज गोजातीय अग्न्याशय से trypsin के 1 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर युक्त DMSO में 10 6 इन्फ्लूएंजा अनुमोदक MDCK कोशिकाओं जोड़ें। 33 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिन और 5% सीओ 2 - 2 के लिए 293T-MDCK सह संस्कृतियों को बनाए रखें।
  8. 5 मिनट के लिए 260 XG पर centrifugation द्वारा MDCK-293T सेल सह संस्कृतियों की supernatants और स्पष्ट लीजिए।
  9. बाँझ परिस्थितियों में 10 दिन पुरानी चिकन embryonated अंडे - 9 टीका लगाना। मार्टिनेज-Sobrido एट अल द्वारा संकेत के रूप में ऐसा करने के लिए, eggshell के शीर्ष पर एक छेद बना। 5।
  10. खोल बुद्धि कवरज एक कपास झाड़ू का उपयोग करते हुए और 33 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए टीका चिकन अंडे सेते मोम पिघल गए।
  11. संक्रमित embryonated अंडे से द्रव्य हार्वेस्ट: 70% इथेनॉल के साथ अनावश्यक कार्य धो लें। बहुत धीरे ऊपरी भाग में दरार और बाँझ संदंश का उपयोग allantoic झिल्ली को हटा दें एक साथ अंडा खोलें। (- 10 मिलीलीटर आम तौर पर 6) के रूप में संभव के रूप में ज्यादा तरल पदार्थ इकट्ठा करने के लिए एक 10 एमएल पिपेट का प्रयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 260 XG पर अपकेंद्रित्र और नए ट्यूबों के लिए allantoic को मंजूरी दे दी द्रव स्थानांतरण।

2. ट्रैकिंग टीके विशिष्ट प्रतिरक्षण

  1. पेप्टाइड असर वृक्ष के समान कोशिकाओं की ट्रेसिंग (DCs)
    1. माउस टीकाकरण के लिए एक सटीक vaporizer का उपयोग ऑक्सीजन में 5% isoflurane के साथ चूहों anesthetize। माउस नाक को सीधे बूंदों के माध्यम से SIINFEKL पेप्टाइड व्यक्त वैक्सीन के 10 3 पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) युक्त पीबीएस के 50 μl प्रशासन के लिए एक 200 μl पिपेट का प्रयोग करें।
    2. बाद के टीकाकरण, euthaniz तीन दिनisoflurane संज्ञाहरण के माध्यम से ई चूहों ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पीछा किया।
    3. बस संदंश के साथ ribcage के नीचे midline पर माउस त्वचा लिफ्ट और कैंची के साथ त्वचा के माध्यम से एक छोटा सा चीरा काट दिया। 5 सेमी लंबे समय से प्रत्येक के अंत से पार्श्विक midline से तो, सिर और पूंछ दोनों ओर त्वचा के माध्यम से दो 2 सेमी चीरों में कटौती - चीरा के बिंदु से, एक 3 बनाना। पील त्वचा वापस पेरिटोनियल और वक्ष cavities को प्रकट करने के लिए। ध्यान से छाती को बेनकाब करने के लिए पेरिटोनियम झिल्ली के माध्यम से कटौती।
    4. मध्यस्थानिका diafragma और पिंजरे पसली के नीचे में कटौती का उपयोग करने के लिए। थोड़ा पृष्ठीय और श्वासनली के उदर पक्ष के पास, प्रगंडशीर्षी धमनी के लिए मध्यवर्ती आसन्न, थाइमस को laterally आसन्न, का पता लगाएं और 2 mediastinal लिम्फ नोड्स (mLNs) को हटा दें।
    5. MLNs घुमावदार संदंश का उपयोग फसल के लिए। लिम्फ नोड्स नीचे संदंश रखें और धीरे से उन्हें खींच। DMEM के 1 मिलीलीटर युक्त 6 अच्छी तरह से थाली में लिम्फ नोड्स जगह और किसी भी connecti को दूरve या वसा ऊतक नोड के आस-पास।
      1. 1 मिलीलीटर सीरिंज से जुड़ी दो 26 जी सुइयों के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक नमूना छेड़ो। अन्य सुई के साथ लिम्फ नोड खुला तोड़ने जबकि लिम्फ नोड तंग करने के लिए, एक सुई के साथ इसे नीचे पकड़। यह सही ढंग से किया जाता है, लिम्फ नोड से फटा जा रहा केंद्रित कोशिकाओं को आसानी से मीडिया में मनाया जाता है। एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए एक 70 माइक्रोन नायलॉन फिल्टर के माध्यम से सभी ऊतक सामग्री गुजरती हैं।
    6. एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में 260 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र एकल कक्ष निलंबन। लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए लाल रक्त कोशिका lysing (RBCL) बफर के 2 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend। सेल आरटी पर 3 मिनट के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति दें।
    7. ठंडा पीबीएस के 2 मिलीलीटर में centrifugation और सेल मेजबान के माध्यम से RBCL बफर बेअसर।
    8. में प्लेट कोशिकाओं 100 μl के अंतिम मात्रा में 10 7 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में 96 अच्छी तरह प्लेटें यू के आकार का।
    9. विश्लेषण, ब्लॉक सेल एफसी रिसेप्टर्स प्रवाह cytometry के लिए उपयोग करबर्फ पर 15 मिनट के लिए 10 6 कोशिकाओं प्रति विरोधी माउस CD16 / CD32 एंटीबॉडी के 1 माइक्रोग्राम।
    10. अपकेंद्रित्र प्लेटें और प्लेट flicking द्वारा supernatants त्यागें। पसंद की सतह एंटीबॉडी संयोजन के साथ अलग-अलग कुओं को सेते हैं। आमतौर पर लिम्फ नोड्स में वृक्ष के समान कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, एंटीबॉडी कॉकटेल शामिल होना चाहिए: 0.25 विरोधी CD11c की माइक्रोग्राम, CD11b के 0.25 माइक्रोग्राम, MHC वर्ग द्वितीय के 0.5 माइक्रोग्राम, CD103 के 0.25 माइक्रोग्राम और 100 के अंतिम मात्रा में CD8α की 0.15 माइक्रोग्राम μl।
    11. नकारात्मक gating के लिए, विरोधी CD3, CD19, NK1.1 या एक वंश कॉकटेल (2A चित्रा) के 0.25 माइक्रोग्राम जोड़ें। वैकल्पिक gating रणनीतियों के साथ-साथ कई फ्लोरोसेंट रंगों के उचित मुआवजे के लिए प्रोटोकॉल रोग प्रतिरक्षण जीनोम परियोजना की वेबसाइट पर पाया जा सकता है। पसंद की सतह मार्करों के अलावा, कॉकटेल के लिए SIINFEKL करने के लिए बाध्य एच -2 k बी के खिलाफ एक एंटीबॉडी के 1 माइक्रोग्राम जोड़ें। यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी DCs मैं के दृश्य की अनुमति देगाSIINFEKL पेप्टाइड MHC वर्ग आई सतह के लिए बाध्य है, जो एन
    12. बर्फ पर 30 मिनट के लिए सतह एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। प्रकाश से थाली को सुरक्षित रखें। 260 XG पर अपकेंद्रित्र प्लेटें 5 मिनट के लिए और पीबीएस दो बार के 2 मिलीलीटर से धो लें। विश्लेषण के लिए cytometry ट्यूब प्रवाह कोशिकाओं स्थानांतरण।
  2. टीका विशेष टी सेल प्रसार का आकलन
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध TCR ट्रांसजेनिक चूहों (ओटी-मैं चूहों) से दाता टी कोशिकाओं को प्राप्त (C57BL 6 / टीजी (TCR aTcrb) 1100Mjb / जम्मू) जिसमें सभी उत्पन्न CD8 टी कोशिकाओं SIINFEKL पेप्टाइड के लिए विशिष्ट हैं। ग्रीवा अव्यवस्था के बाद isoflurane संज्ञाहरण द्वारा चूहों euthanize। उदर गुहा में एक चीरा प्रदर्शन से हार्वेस्ट तिल्ली। DMEM / तिल्ली के 2 मिलीलीटर में तिल्ली / एस प्लेस और संयोजी और वसा ऊतकों को हटा दें।
    2. 2.1.2 और 2.1.3 में वर्णित प्रक्रिया के बाद तिल्ली से एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न करता है।
    3. आगे टी कोशिकाओं पर एकल कक्ष निलंबन को समृद्ध करने के लिए, चुंबकीय मनका जुदाई प्रोटोकॉल को लागूसकारात्मक या नकारात्मक चयन प्रक्रिया 12 या तो इस्तेमाल करते हैं। प्राप्तकर्ता कोशिकाओं से दाता को अलग दाता टी कोशिकाओं CD45.2 12 व्यक्त करते हुए उदाहरण के लिए प्राप्तकर्ता चूहों ल्युकोसैट मार्कर CD45.1 व्यक्त इतना है कि congenic चूहों का उपयोग करें।
    4. टी कोशिकाओं लेबल करने के लिए, 5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक इष्टतम सेल घनत्व में Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) के 5 माइक्रोन युक्त पीबीएस के 1 मिलीलीटर में उन्हें सेते हैं। प्रकाश जोखिम से संरक्षित 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं। ऊष्मायन के बाद, 3 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) में 5 मिनट, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और resuspend कोशिकाओं के लिए 260 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं CFSE बेअसर करने के लिए।
    5. पीबीएस की पर्याप्त मात्रा में 10 मिनट और resuspend के दौरान 260 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं समाधान के 100 μl 2 एक्स 10 6 सेल शामिल हैं। 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / रेट्रो कक्षीय साइनस इंजेक्शन 13 के माध्यम से माउस के साथ प्राप्तकर्ता congenic चूहों दिखे।
    6. दिन 3, 4 और 5 के बाद में प्राप्तकर्ता चूहों Euthanizeग्रीवा अव्यवस्था के बाद isoflurane संज्ञाहरण का उपयोग कर टीकाकरण। Mediastinal लिम्फ नोड्स हार्वेस्ट और 2.1.2-2.1.5 में संकेत के रूप में प्रवाह cytometry के लिए एकल कक्ष निलंबन तैयार करते हैं।
    7. युक्त एक एंटीबॉडी कॉकटेल के 100 μl में एकल कक्ष निलंबन धुंधला द्वारा दाता कोशिकाओं की पहचान: विरोधी माउस CD3, सीडी 4 और CD8 एंटीबॉडी के 0.25 माइक्रोग्राम; विरोधी माउस CD45.1 या CD45.2 एंटीबॉडी (दाता कोशिकाओं के phenotype पर निर्भर करता है) के 0.5 माइक्रोग्राम। CFSE 12 (चित्रा 2 बी) के कमजोर पड़ने प्रोफाइल निर्धारित करने के लिए खुला (FITC) के प्रवाह के फ्लोरिडा -1 चैनल छोड़ दें।

जीन विशिष्ट वैक्सीन प्रतिक्रियाएँ काटना 3. chimeric चूहे

नोट: डीटीआर आधारित माउस मॉडल का उपयोग प्रतिस्पर्धी अस्थि मज्जा काइमेरा की पीढ़ी के टीके के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान सेल विशिष्ट कार्यों के भेदभाव की अनुमति देता है। यहाँ हम जो के संयोजन से दाता सी डीटीआर व्यक्त एक अतिरिक्त रणनीति दिखानेपीटा चूहों परमिट से कोशिकाओं के साथ एल विशेष सेल के डिब्बों में उन्मुक्ति के दौरान जीन विशिष्ट कार्यों का अध्ययन करने के लिए। उदाहरण में हम Langerin + CD103 + DCs में टोल की तरह रिसेप्टर 3 (TLR3) की विशेष विलोपन के साथ चूहों उत्पन्न करते हैं।

  1. अस्थि मज्जा दाता कोशिकाओं की तैयारी
    1. एक जैव सुरक्षा स्तर द्वितीय कैबिनेट के तहत कार्य करें। विशेष रूप से autoclaved उपकरणों का उपयोग करके संक्रमण से बचने।
    2. अस्थि मज्जा काइमेरिक चूहों उत्पन्न प्राप्तकर्ता के रूप में congenic CD45.1 + C57BL 6 / मादा चूहों का उपयोग करें, और TLR3 का उपयोग करने के लिए - / -, Langerin-डीटीआर / EGFP, या WT चूहों दाताओं के रूप में CD45.2 + व्यक्त। Congenic दाता और प्राप्तकर्ता का प्रयोग चूहों फ्लो के माध्यम से दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति देता है और इस engraftment मूल्यांकन करने की अनुमति देता है।
    3. दाता अस्थि मज्जा कोशिकाओं को प्राप्त ग्रीवा अव्यवस्था के बाद isoflurane संज्ञाहरण के साथ दाता चूहों euthanize करने के लिए। तेज कैंची एड़ियों के आसपास चीरों प्रदर्शन के साथ मीटर इतना है किouse मांसलता अवगत कराया है।
    4. कि पैर की मांसपेशियों दिखाई दे रहे हैं इसलिए का उपयोग करना कुंद संदंश कूल्हों की ओर टखने से धीरे माउस त्वचा और फर खींच।
    5. तेज कैंची के साथ कूल्हों की ऊंचाई पर और फीमर के सिर के ऊपर माउस पैर काट दिया।
    6. एक पेट्री डिश पर और बर्फ पर पैर रखें। तेजी से काम करते हैं और हड्डियों को बेनकाब करने के लिए सभी की मांसपेशियों को हटा दें।
    7. अलग femurs और tibiae। संभव बैक्टीरिया को दूर करने और सीरम मुक्त DMEM के 5 मिलीग्राम से युक्त एक और पेट्री डिश पर तुरंत उनके स्थान पर 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के समाधान में हड्डियों रखें। कट हड्डी DMEM में अस्थि मज्जा तेज कैंची का उपयोग और फ्लश समाप्त होता है। एक 5 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी एक 26 जी सुई डालने से हड्डी में है, इसलिए DMEM के फ्लश 1 मिलीलीटर ऐसा करने के लिए। हड्डियों निस्तब्धता के बाद सफेद (खाली) देखने के लिए सुनिश्चित करें।
    8. DMEM के 10 एमएल में दाता चूहों से सभी अस्थि मज्जा कोशिकाओं को इकट्ठा। एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से फसल पारित करके अस्थि मज्जा कोशिकाओं से एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न करता है।
    9. सीएलएक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 260 XG पर centrifugation द्वारा अस्थि मज्जा कोशिकाओं के कान एकल कक्ष निलंबन। पीबीएस के 10 मिलीलीटर में Resuspend सेल गोली। 2.1.3 और 2.1.4 में वर्णित के रूप में RBCL समाधान का उपयोग कर लाल रक्त कोशिकाओं और गिरेगा।
    10. एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर उपयोग कर या तो अस्थि मज्जा कोशिकाओं की गणना। Trypan नीले रंग धुंधला 13 के माध्यम से मृत कोशिकाओं का दृढ़ संकल्प से सेल व्यवहार्यता का आकलन करें। बेहतर, कम से कम 80% की व्यवहार्यता के साथ एक ही पशु की पैदावार करीब 3 10 x 7 सफेद रक्त कोशिकाओं / माउस।
    11. / - - या WT दाता कोशिकाओं कुल अस्थि मज्जा काइमेरा के मामले में, TLR -3 तैयार करते हैं। पीबीएस के 100 μl में 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के बाद से इष्टतम सेल एकाग्रता 2 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल है। तुरंत इस्तेमाल नहीं करते हैं, तो 10% DMSO के साथ धीमी गति से ठंड तकनीक और FBS का उपयोग कर -80 डिग्री सेल्सियस पर दाता कोशिकाओं की रक्षा। मिश्रित काइमेरिक मॉडल के लिए, Langerin-डीटीआर-दाता कोशिकाओं और मिश्रण TLR3 - / -
  2. माउस विकिरण और प्रत्यारोपण
    1. एक सीज़ियम 137 स्रोत irradiator में उम्र के 8 सप्ताह - 6 के बीच मादा चूहों चमकाना। चूहों के अलावा 550 रेड 4 घंटे की दो खुराक दे। स्प्लिट विकिरण तीव्र यकृत विषाक्तता को कम करता है और इसलिए विकिरण प्रोटोकॉल की वजह से माउस मारक कम कर देता है।
    2. विकिरण के बाद दो सप्ताह के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज के तहत चूहों रहते हैं। Baytril / किलो की 5 मिलीग्राम - 2.5 में पीने के पानी के साथ एंटीबायोटिक दवाओं दे।
    3. 2 - दूसरा विकिरण के बाद 4 घंटा, नसों के दाता अस्थि मज्जा कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपण चूहों। 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं से युक्त पीबीएस के 100 μl की अधिकतम मात्रा का उपयोग करते हुए रेट्रो कक्षीय साइनस इंजेक्शन 13 के माध्यम से और isoflurane संज्ञाहरण के तहत दाता कोशिकाओं के इंजेक्शन प्रदर्शन।
    4. चार सप्ताह के प्रत्यारोपण के बाद, 100 के एक नमूने में engraftment का मूल्यांकनकम से कम दो रंगों को पढ़ने में सक्षम एक मशीन का उपयोग प्रवाह cytometry के माध्यम से परिधीय रक्त की μl। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध fluorescently लेबल CD45.1 और 1/100 और 1/200 के बीच dilutions का उपयोग कर CD45.2 विरोधी माउस एंटीबॉडी का उपयोग करें, दाता और रेडियो प्रतिरोधी प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के बीच भेद करने के लिए। दाता कोशिकाओं का इष्टतम engraftment परिधीय रक्त में कुल hematopoietic कोशिकाओं के कम से कम 80% होना चाहिए।
  3. टीकाकरण और लक्षित कमी
    1. Intranasal के माध्यम से पुनः संयोजक लाइव-तनु इन्फ्लूएंजा टीका के साथ चूहों टीका। माउस टीकाकरण के लिए एक सटीक vaporizer का उपयोग ऑक्सीजन में 5% isoflurane के साथ चूहों anesthetize। वैक्सीन के 10 3 पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) युक्त पीबीएस के 50 μl प्रशासन के लिए एक 200 μl पिपेट का प्रयोग करें।
    2. अंतिम माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए, intranasally पीबीएस के 50 μl में पतला डीटी के 50 एनजी के साथ चूहों का इलाज। 3.3.1 में वर्णित के रूप में anesthetized चूहों की नाक के लिए सीधे ड्रॉप द्वारा डीटी बूंद प्रशासन। दावत मील2 दिन के बाद टीकाकरण (3B चित्रा) तक टीकाकरण से पहले दिन -2 पर उपचार शुरू दैनिक खुराक के साथ सीई।

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Representative Results

पुनः संयोजक लाइव-तनु फ्लू के टीके का सृजन द्विदिश प्रमोटरों 5 के नियंत्रण में इन्फ्लूएंजा वायरस के आठ खंडों एन्कोडिंग plasmids के अभिकर्मक के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। सर्दी-अनुकूलित इन्फ्लूएंजा टीका आमतौर पर एक ठंडा अनुकूलित तनाव के रूप में अच्छी तरह से पसंद की इन्फ्लूएंजा तनाव की हा और एनए (जैसे, H1N1) (चित्रा 1 ए) के छह खंडों में शामिल है। ठंड में अनुकूलन के सिद्धांत 33 डिग्री सेल्सियस, चूहों और इंसानों के 14 में ऊपरी श्वसन तंत्र (URT) के तापमान पर वायरस से प्रतिबंधित प्रतिकृति पर आधारित है। इसलिए, टीका URT में कुछ हद तक नकल कर सकते हैं, लेकिन कम श्वसन तंत्र निमोनिया के कारण नहीं कर सकते हैं। वायरल neuraminidase (एनए) के तने में फ्यूजन पीसीआर प्रौद्योगिकी, एक संरक्षित क्षेत्र का प्रयोग एक मिल ओवीए व्युत्पन्न पेप्टाइड (SIINFEKL) (चित्रा 1 बी) के लिए प्रतिस्थापित किया गया था।

कैनेटीक्स अध्ययन में टीका-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को ट्रैक करने के लिए हमारे पास टीका तैयार करने के साथ-साथ काइमेरिक माउस मॉडल से व्युत्पन्न मिल पेप्टाइड्स का लाभ उठाया। दिन 3 और 6 के बाद टीकाकरण के बीच, CD103 + DCs फेफड़ों-draining लिम्फ में पता लगाया जा सकता SIINFEKL असर 12 (2A चित्रा) नोड्स। Multiparametric फ्लो वास्तविक समय में टीका-व्युत्पन्न प्रतिजन प्रस्तुति की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। इसके अलावा, SIINFEKL विशेष टी कोशिकाओं का निषेचन टीका-विशिष्ट CD8 टी सेल प्रतिक्रिया (चित्रा 2 बी) की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है।

टीकाकरण के दौरान जीन विशिष्ट कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए हम डीटीआर प्रौद्योगिकी और प्रतिस्पर्धी अस्थि मज्जा काइमेरा (चित्रा 3) के संयोजन एक माउस मॉडल तैयार कर लिया। ऐसा करके, जीन समारोह के नुकसान के टीकाकरण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कोर्स (चित्रा 3 बी, सी) पर विशेष सेल डिब्बों को निशाना बनाया गया था।

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मिल LAIVs चित्रा 1. इंजीनियरिंग। (ए) ambisense प्लास्मिड में क्लोन इन्फ्लुएंजा खंडों (मार्टिनेज-Sobrido एट अल। 5 द्वारा वर्णित के रूप pDZ रीढ़ की हड्डी), 2000 के 24 घंटा अभिकर्मक के बाद Lipofectamine का उपयोग कर 293T कोशिकाओं में 293T कोशिकाओं से प्राप्त supernatants ट्रांसफ़ेक्ट गया TPCK trypsin के 1% की उपस्थिति में कोट इन्फ्लूएंजा-अनुमोदक Madin-डार्बी कुत्ते गुर्दे (MDCK) कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया। सभी प्रोटोकॉल 33 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया गया था। MDCK कोशिकाओं से वायरल supernatants फिर 33 डिग्री सेल्सियस पर तीन दिनों के लिए 9 दिन पुरानी embryonated चिकन अंडे में inoculated थे। वायरल बचाव पीसीआर आधारित वायरल जीनोम प्रवर्धन और अनुक्रमण द्वारा पुष्टि की गई। (बी) ए / पर्टो की एनए जीन की (अवशेषों 65-72) इन्फ्लूएंजा neuraminidase (एनए), एक संरक्षित क्षेत्र में ओवीए व्युत्पन्न SIINFEKL पेप्टाइड सम्मिलित करने के लिए रीको / 8/34 (H1N1) के वायरस संलयन के माध्यम से SIINFEKL पेप्टाइड एन्कोडिंग एक छोटी सीडीएनए के लिए प्रतिस्थापित किया गया थापीसीआर। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. वैक्सीन तकनीक अनुरेखण। (ए) प्रवासी DCs CD11c मेड MHC वर्ग द्वितीय हाय कोशिकाओं के रूप में mediastinal लिम्फ नोड्स (mLNs) में gated थे। उदाहरण में, प्रतिजन असर प्रवासी CD103 + DCs प्रवाह cytometry द्वारा CD103 + एच -2 बी -SIINFEKL + कोशिकाओं के रूप में पहचान की गई। (बी) OT-मैं विशेष टी कोशिकाओं टीकाकरण के एक ही दिन पर चूहों को संचार कर रहे थे। चार दिनों के बाद, कोशिकाओं टीका चूहों के लिम्फ नोड्स से एकत्र की है और उनके प्रसार प्रोफाइल के लिए मूल्यांकन किया गया। फ्लोरिडा -1 चैनल पर CFSE कमजोर पड़ने कोशिका विभाजन के संकेत के रूप में उपयोग किया गया था। CAV: शीत-अनुकूलित टीका; CAV SIINFEKL :। ओवीए व्युत्पन्न SIINFEKL पेप्टाइड व्यक्त ठंडा-अनुकूलित टीका इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. जीन समारोह अध्ययन करता है। अस्थि मज्जा काइमेरा (बीएमसी) और टीकाकरण रणनीतियों में से (ए) योजनाबद्ध। Langerin-डीटीआर व्यक्त काइमेरिक चूहों में डीटी के (-2 और दो ​​दो दिन पहले या टीकाकरण के बाद डीटी के प्रशासन को देखें)। (बी) इसके अलावा प्रवासी Langerin + DCs के फेफड़ों में CD103 coexpressing के विशिष्ट कमी की अनुमति देता है। (सी) तुलनात्मक काइमेरिक चूहों में टीका विशेष टी कोशिकाओं का विश्लेषण। एनपी 366-374 -specific CD8 टी कोशिकाओं का पता लगाने वाणिज्यिक dextramer धुंधला के माध्यम से किया गया था।803fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन में हम टीका-प्रेरित उन्मुक्ति के शारीरिक और आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि कैसे रिवर्स आनुवंशिकी और काइमेरिक माउस मॉडल का वर्णन है। इन्फ्लुएंजा रिवर्स आनुवंशिकी कई प्रयोगशालाओं में स्थापित किया है और इन्फ्लूएंजा रोगजनन, प्रतिकृति, और प्रसारण 17 को समझने में एक प्रमुख भूमिका निभाई है। हमारे प्रोटोकॉल में एक प्रमुख मुद्दा विदेशी epitopes व्यक्त ठंड में रूपांतरित फ्लू के टीके का बचाव है। Neuraminidase के डंठल में कम cDNAs शुरू करने की रणनीति कई समूहों द्वारा वर्णित किया गया है, अन्वेषक कोई अतिरिक्त म्यूटेशन अंडे में वैक्सीन उत्पादन के दौरान और टीका उत्प्रेरण बिना श्वसन तंत्र में दोहराने में सक्षम है कि पेश कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने की जरूरत है निमोनिया 5,12। वायरल neuraminidase के डंठल के साथ-साथ इस तरह के एन एस जीन खंड और PB1 खंड के रूप में इन्फ्लूएंजा जीनोम के अन्य क्षेत्रों के बाद से दोनों विदेशी दृश्यों 1 के आवंटन की अनुमति देते हैं9,20, हमारे प्रोटोकॉल का संशोधन, उदाहरण के लिए, इन्फ्लूएंजा वायरस, तर्कसंगत वैक्सीन डिजाइन के लिए एक प्रमुख मुद्दा खिलाफ टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के ढांचे को समझने के लिए अतिरिक्त विदेशी पेप्टाइड्स जोड़ने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

मिल टीके और डीसी सबसेट के डीटीआर आधारित कमी के संयोजन से हम विशेष सेल सबसेट के लिए जीन समारोह के नुकसान को लक्षित करने में सक्षम है। रोगज़नक़ों 21 के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को स्पष्ट करने के लिए, लेकिन वैक्सीन की सुरक्षा के लिए जिम्मेदार रास्ते काटना नहीं करने से पहले यह तकनीक लागू किया गया है। कारण डीटीआर आधारित मॉडल की उपलब्धता और काइमेरिक चूहों उत्पन्न करने के लिए तकनीक के लचीलेपन के लिए, इस तकनीक को आगे प्रतिरक्षा कार्यों के साथ अतिरिक्त ल्युकोसैट आबादी और जीन का विस्तार किया जा सकता है। यह डीटी इलाज भी ल्य्म्फोइड ऊतकों में ऐसे CD8α + DCs के रूप में langerin व्यक्त अतिरिक्त डीसी सबसेट की कमी का परिणाम हो सकता है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए यह बेहद पे करने के लिए सिफारिश की हैडीटी उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक खुराक-प्रतिक्रिया का अध्ययन rform। हमारे मॉडल की एक संभावित चेतावनी allogenic अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के समग्र एंटीवायरल CD8 टी सेल उन्मुक्ति 15 में कमी दर्ज की गई है। इस प्रकार, सावधानी प्रत्यारोपित और गैर प्रतिरोपित चूहों के बीच डेटा की तुलना करते समय प्रयोग किया जाना है।

टीके की तत्काल जरूरत है, जिसके लिए कई महत्वपूर्ण मानव रोगज़नक़ों जंगली प्रकार रोगज़नक़ों या माउस surrogates का उपयोग करने के लिए माउस मॉडल में अध्ययन किया जा सकता है। ये इन्फ्लूएंजा वायरस, प्लाज्मोडियम, और Ebola वायरस शामिल हैं। इस अध्ययन में प्रस्तावित तकनीक वैक्सीन डिजाइन युक्तिसंगत बनाने के लिए है, इसलिए इन रोगज़नक़ों और के खिलाफ प्रयोगात्मक टीकों की बुनियादी तंत्र को समझने में मदद कर सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) Gibco RL-Life Technologies 41965-039
OptiMEM Gibco RL-Life Technologies 31985-047
Lipofectamine 2000 Invitrogen-Life Technologies 11668-027
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) PAA p11-010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2153
Embryonated eggs Valo biomedia Gmbh
PBS (1x) Sigma-Aldrich D8537
70 μM Nylon Filters Greiner-Biorad 542-070
Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x BD Bioscience 555899
CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) BD Pharmigen 553142
APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) Biolegend 141605
PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) BD Biosciences 553802
eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) eBioscience 48-5321-82
Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) Biolegend 101216
PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) Biolegend 121416
PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) eBioscience 12-0453-82
V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) BD Bioscience 562130
PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) eBioscience 46-0081-80
APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) Biolegend 100325
eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) eBioscience 48-0041-80
CFSE Proliferation dye eBioscience 65-0850-85
Baytril 2.5% Bayer 65-0850-85
Dymethil-Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Ovalbumin  Molecular probes  O23020
Diphteria Toxin (DT) Sigma-Aldrich D0564
Trypsin-TPCK Sigma-Aldrich T1426
BD FACsCanto II Flow cytometer BD Biosciences
FlowJo cell analysis software 9.5 Flowjo inc.
Trypan Blue Stain (0.4%)  Life technologies T10282
Countess Automatic Cell Counter Invitrogen-Life Technologies C10227

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 100 माउस मॉडल टीके प्रतिरक्षा वृक्ष के समान कोशिकाओं इन्फ्लूएंजा टी कोशिकाओं
Chimeric माउस मॉडल में संयोजक फ्लू के टीके की intranasal प्रशासन mucosal प्रतिरक्षण अध्ययन करने के लिए
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Pérez-Girón, J. V.,… More

Pérez-Girón, J. V., Gómez-Medina, S., Lüdtke, A., Munoz-Fontela, C. Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity. J. Vis. Exp. (100), e52803, doi:10.3791/52803 (2015).

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