Introduction
질병의 부재하에 면역 학적 기억의 발생이 효율적으로 접종 한 생리 기초이다. 최근, 시스템 생물학 기반의 접근 방식은 이러한 황열병 백신 성공적인 백신, 차례로, 리드 항원의 활성화를 multilineage하는 선천성 면역 반응과 수지상 세포 (DCS)의 여러 부분 집합의 활성화 강력한 유도를 유도하는 것으로 밝혀졌다 특정 T 세포 2,3-. DC가 항원 특이 나이브 T 세포 (4)를 활성화 할 수있는 능력을 가진 경우에만 면역 세포 집단이므로, 예방 접종 동안 그들의 기능의 연구는 백신에 대한 면역 반응을 이해하고 도전 병원균 미래 전략을 설계하는 것이 중요하다.
백신에 대한 면역 반응시 DC가 다른 서브 세트들의 추적을 허용하는 시스템을 제공하는 것이다 림프 조직으로 DC 이동의 정확한 동력학을 설정하기 위해 바람직하고, 것백신 특정 적응성 면역 개시 할 책임 생리 메커니즘 통찰력. 유전학을 기반 역방향 접근 방식은 가능성이 수정 생성이 목적으로 실험적으로 사용할 수있는 생균 백신을 제공합니다. 인플루엔자 연구에 구현하기 때문에, 플라스미드 - 기초 역 유전학 널리 LAIVs 포함한 재조합 인플루엔자 균주를 생성하기 위해 사용되어왔다. 표준 프로토콜은 (재조합 인플루엔자 바이러스는 Madin-다비 개과의 신장과 같은 허용 시스템에서의 증폭뿐만 아니라 여덟 인플루엔자 바이러스 분절을 함유 ambisense 플라스미드 매우 형질 세포주 (포지티브 및 네거티브 센스 RNA 모두 제조)의 다 형질을 필요 구출 MDCK) 세포 및 / 또는 닭 유정란 5. 그러나, 백신의 면역 기전을 연구하기 위해 분자 도구를 생성하는 역 유전학의 적용은 비경 남아있다.
세대수지상 세포를 포함하는 면역 세포 하위 집합의 특정 고갈을 허용하는 새로운 마우스 모델, 백신 유도 보호의 기초가되는 기본 면역 메커니즘을 이해하는 새로운 가능성을 열었다. 마우스와 인간에서의 DC 서브 세트 함수 사이의 비교는 크게, 마우스 및 인간 DC가 강하게 상동 기능적 이러한 발견 -6,7-있는 마우스 모델의 개발은 정상 상태의 DC 특이 공핍을 허용하는 것이 제안 것을 밝혔다 염증 상태 동안, 인간 DC 응답의 생리를 이해 될 수있다. 최근 마우스 모델의 수는 8,9 관심의 유전자의 프로모터 영역의 제어하에 유인원 디프테리아 독소 (DT) 수용체 (DTR)를 발현하는 유전자를 운반 생성되었다. 마우스 조직 자연스럽게 DTR을 표현하지 않기 때문에,이 모델은 DT와 마우스 접종에 따라 관심의 대상으로 유전자를 운반하는 세포의 부분 집합의 조건 고갈을 할 수 있습니다. 따라서, 우리의 abili생리 학적 과정에서 생체 내에서 특정 수지상 등의 백혈구를 소모하는 타이는 크게 DTR 기반 RO의 개발에 의해 향상되었습니다. 이들 트랜스 제닉 마우스 모델은 면역계의 개체 발생을 이해하기 위해 광범위하게 사용되었지만 그러나, 백신 개발에 따라 적용이 부족하게 테스트되지 않았다. 여기서, 인플루엔자 역 유전학 DTR 기반 경쟁 골수 키메라를 결합함으로써, 우리는 생체 내에서 백신에 대한 면역 반응 동안 백신 면역뿐만 아니라 개개의 유전자 기능의 동역학을 연구하는 방법을 제안한다. 도전 감염성 질병에 대한 새로운 백신의 임상 평가를 위해이 기술의 응용은 백신 설계 합리화 및 생체 내 백신 후보를 테스트하는 데 도움이 될 수.
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Protocol
동물 실험은 승인 된 프로토콜과 독일의 동물 보호 법률의 지침을 따라 수행 하였다. 동물 실험을 수행하는 모든 직원은 카테고리 B 또는 유럽 실험 동물 과학 연맹의 C에 따라 훈련 프로그램을 통과시켰다.
역 유전학에 의해 재조합 약독 화 인플루엔자 백신의 1 세대
참고 : 역 유전학에 의해 재조합 인플루엔자 바이러스의 생성에 대한 자세한 프로토콜은 이전의 연구 (5)에 의해 설명이 보고서의 범위를 벗어나있다. 간단히, 추위에 적응 인플루엔자 백신 (CAV)의 구조는 바이오 안전성 수준에 따라 바이오 안전성 클래스 II 캐비닛 2 (BSL2) 봉쇄를 수행하고, 아래에 자세히 단계를 포함한다. 형질 감염 프로토콜의 다음 마르티네즈 - Sobrido 등. 5.
- 재조합 체 감기 적응 인플루엔자를 생성배경으로 냉 적응 된 균주 A / Ann 나무 / 60분의 6 (H2N2)뿐만 아니라, 헤 마글 루티 닌 (HA)과 변형 뉴 라미니다 제 (NA)를 A / PR / 8 / 34 (H1N1) 균주 (사용 백신 도 1a). NA 유전자 변형 닭의 난백 알부민 (OVA) 유래 펩타이드 SIINFEKL (그림 1B)를 암호화하는 짧은 cDNA 서열에 의한 단백질 줄기 (잔류 65-72)에 보존 시퀀스의 PCR 기반의 교체로 구성되어 있습니다. SIINFEKL 펩티드는 C57BL / 6 생쥐 (12)의 응답이 I 제한된 H-2B MHC 클래스의 문맥에서 매우 면역 펩티드이다.
- 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / E)이 보충 된 DMEM, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 사용하여 6 웰 플레이트에 웰 당 접시 106 293T 세포.
- 플라스미드 형질 전환 혼합물을 준비합니다 추가 NA 인코딩 PB2, PB1, PA, NP, M, NS 인플루엔자 A / 앤아버 / 60분의 6 변형에 대한 cDNA를하고 플라스미드의 1 μg의를 암호화하는 플라스미드 각각 1 μg의 -SIINFEKL과인플루엔자 A / PR / 8 / 34에서 HA. (/ 잘 100 μL의 최종 부피 15 μl를) 티멤를 미리 예열 추가.
- RT에서 30 분 동안 형질 믹스 부화.
- 잘 / 형질 믹스 100 μl를 추가하고 37 ℃에서 16 시간, 5 % CO 2 품어.
- 5 시간 동안 CO 2를 33 ℃에서 DMEM 0.3 % BSA 1 % P / E로 세포 매체를 변경하고 5 %.
- L-1-Tosylamide -2- 페닐 에틸 클로로 메틸 케톤 (TPCK-트립신)으로 처리 소 췌장 트립신의 1 ㎍ / ㎖의 DMSO를 함유하는 10 6 인플루엔자 허용 MDCK 세포를 추가한다. 33 ℃에서 3 일, 5 % CO 2 - 2 293T - MDCK 공동 문화를 유지한다.
- 5 분 260 XG에서 원심 분리하여 MDCK-293T 세포의 공동 문화의 상층 액과 명확한를 수집합니다.
- 멸균 조건 10 일 된 닭 유정란 - 9 접종. 마르티네스-Sobrido 등에 의해 나타낸 바와 같이,이를 위해, 껍질의 상부에 구멍을 만든다. 5.
- 달걀 껍질 기지를 커버시간은 면봉을 사용하여 33 ℃에서 3 일간 접종 닭 알을 품어 왁스를 용융.
- 감염된 유정란에서 막액을 수확 : 70 % 에탄올로 달걀 껍질을 씻으십시오. 아주 부드럽게 상부에 균열 및 멸균 집게를 사용하여 뇨 막을 제거와 계란을 엽니 다. (- 10 ml의 일반적으로 6) 가능한 한 많은 유체를 수집하기 위해 10 ML의 피펫을 사용합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 260 XG에 원심 분리기 새로운 튜브로 뇨 삭제 유체를 전송합니다.
2. 추적 백신 별 내성
- 펩타이드 함유 수지상 세포의 추적 (DCS)
- 마우스 접종, 정밀 기화기를 사용 산소 5 % 이소 플루 란으로 마취 된 마우스. 마우스 콧 구멍에 직접 방울을 통해 SIINFEKL 펩타이드를 발현하는 백신의 10 3 플라크 형성 단위 (PFU)를 포함하는 PBS의 50 μl를 관리하는 200 μL 피펫을 사용합니다.
- 백신 접종 후, euthaniz 세 일이소 플루 란 마취를 통해 E 마우스는 경추 탈구시켰다.
- 단지 집게로 흉곽 아래의 중간 선에서 마우스 피부를 들어 올리고 가위로 피부를 통해 작은 절개를 잘라. 5cm 길이 양쪽 끝에서 옆으로 중간 선에서 다음, 머리와 꼬리 양쪽을 향해 피부를 통해 두 2cm의 절개를 잘라 - 절개의 관점에서, 3합니다. 껍질은 다시 피부는 복막과 흉부 충치를 공개합니다. 조심스럽게 가슴을 노출 복막을 둘러싼 세포막을 통해 잘라.
- 종격동이 diafragma와 케이지 리브의 바닥을 잘라 액세스 할 수 있습니다. 약간 지느러미와 기관의 복부 측면에 가까운, 완두 동맥 내측에 인접, 흉선에 횡 방향으로 인접 찾기 및 2 종격동 림프절 (mLNs)를 제거합니다.
- mLNs는 곡선 집게를 사용하여 수확합니다. 림프절 아래 집게를 놓고 부드럽게를 당깁니다. DMEM 1ml를 포함하는 6 웰 플레이트에서 림프절을 배치하고 접속 .. 제거적이거나 지방 조직 주변 노드.
- 1 ml의 주사기에 부착 된 두 개의 26 G 바늘로 완전히 각각의 샘플을 애무 해줘. 다른 바늘 림프 노드를 엽니 다 파괴하면서 림프절을 애타게, 하나의 바늘을 누르고 있습니다. 이것이 제대로하면 림프절에서 붕괴 농축 세포를 배지에서 쉽게 관찰된다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 70 ㎛의 나일론 필터를 통해 모든 조직 재료를 전달.
- 냉장 원심 분리기 260 XG에 10 분 동안 원심 분리기 단일 세포 현탁액. 적혈구를 용해시키기 위해 적혈구 용균 (RBCL) 완충액 2 ㎖로 세포 펠렛을 재현 탁. 용해는 실온에서 3 분간 할 수있게합니다.
- 얼음 - 냉각 PBS로 2 ㎖를 원심 분리하고 세포를 재현 탁 통해 RBCL 버퍼 중화.
- 플레이트에 세포를 100 μL의 최종 부피 107 세포 / ml의 농도로 96 웰 플레이트를 U 자형.
- 분석 블록 셀의 Fc- 수용체를 이용한 유동 세포 계측법얼음에 15 분 동안 10 6 세포 당 항 마우스 CD16 / CD32 항체의 1 μg의.
- 원심 분리기 플레이트와 플레이트 쓸어 넘겨 상층 액을 버린다. 선택의 표면 항체 조합으로 개별 우물을 품어. 일반적으로 림프절에서 수지상 세포의 검출, 항체 칵테일은 다음을 포함한다 : 0.25 방지하는 CD11c의 μg의, CD11b를 0.25 μg의, MHC 클래스 II의 0.5 μg의, CD103의 0.25 μg의 100의 최종 부피에 CD8α 0.15 μg의를 μL.
- 음의 게이트를 들어, 항 CD3, CD19, NK1.1 또는 혈통 칵테일 (그림 2A)의 0.25 μg의를 추가합니다. 대체 게이팅 전략뿐만 아니라 다수의 형광 염료의 적절한 보상을위한 프로토콜은 면역 게놈 프로젝트의 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다. 원하는 표면 마커 이외에도, 칵테일에 SIINFEKL 수밖에 H-2K의 B에 대한 항체 1 μg의 추가. 이 상업적으로 이용 가능한 항체는 DC가 난의 시각화 수 있습니다SIINFEKL 펩타이드가 MHC 클래스 I.를 표면에 결합되는 N
- 얼음에 30 분 동안 표면 항체와 세포를 품어. 빛 플레이트를 보호합니다. 260 XG에 원심 분리기 판 5 분 동안 PBS로 두 번 2 ㎖로 세척한다. 분석을 위해 세포 계측법 튜브 흐름 세포를 전송합니다.
- 백신 특이 T 세포 증식의 평가
- 시판 TCR 유전자 변형 마우스 (OT-I 마우스)로부터 공여 T 세포를 구하는 (C57BL / 6-TG와 (TCR aTcrb) 1100Mjb / J)가있는 모든 생성 CD8 T 세포 SIINFEKL 펩타이드에 특이. 자궁 경부 전위 다음 이소 플루 란 마취로 쥐를 안락사. 복강에 절개를 수행하여 수확 비장. DMEM / 비장의 2 ml의 비장 / S를 놓고 결합과 지방 조직을 제거합니다.
- 2.1.2 및 2.1.3에 기술 된 절차에 따라, 비장으로부터 단일 세포 현탁액을 생성한다.
- 상기 T 세포의 단일 세포 현탁액을 농축, 자기 비드 분리 프로토콜을 적용양 또는 음의 선택 절차 (12)를 사용. 받는 사람 세포에서 기증자를 차별화 기증자 T 세포가 CD45.2 12 표현 예를 들어받는 사람 마우스 백혈구 마커 CD45.1을 표현할 수 있도록 congenic 마우스를 사용합니다.
- T 세포를 레이블링하기 위해 5 × 106 세포 / ml의 최적의 셀 밀도에 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE) 5 μM을 함유하는 1 ml의 PBS에서 그들을 부화. 빛 노출로부터 보호 37 ℃에서 20 분 동안 세포를 품어. 배양 후, 3 ml의 소 태아 혈청 (FBS) 5 분, 폐기 상등액 재현 탁하고 세포를 260 XG에 원심 세포 CFSE 중화.
- PBS의 적절한 볼륨에서 10 분, 재현 탁 동안 260 XG에 원심 분리기 세포 용액 100 ㎕를 2 × 10 6 세포를 함유하도록. 2 × 10 6 세포 / 복고풍 궤도 동 주사 (13)를 통해 마우스를 사용하여받는 사람 congenic 쥐를 달이다.
- 일 3, 4 및 5에서 수신자 사후 마우스를 안락사자궁 경부 전위 다음 이소 플루 란 마취를 사용하여 예방 접종. 종격동 림프절을 수확하고 2.1.2-2.1.5에 표시된 유동 세포 계측법에 대한 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
- 포함한 항체 칵테일 100 ㎕의 단일 세포 현탁액을 염색하여 공여 세포를 식별 : 항 - 마우스 CD3, CD4 및 CD8 항체를 0.25 μg의; 항 - 마우스 또는 CD45.1 CD45.2 항체 (공여 세포의 표현형에 따라) 0.5 μg의. CFSE (12) (그림 2B)의 희석 프로파일을 결정하기 위해 열린 (FITC) 흐름 cytometer의 FL-1 채널을 남겨주세요.
유전자 특정 백신 응답을 해부 3. 키메라 마우스
주 : DTR 계 마우스 모델을 사용하여 경쟁 골수 키메라의 생성은 백신에 대한 면역 반응 동안 셀 고유 함수의 차별을 허용한다. 여기에서 우리는의 조합에 의해 기증자 C를 DTR 발현 추가 전략을 보여녹아웃 쥐 허가의 세포와 ELL 학생은 특정 세포 구획에서 면역 유전자 중 특정 기능을 연구한다. 예에서 우리는 Langerin + CD103 + 수지상의 수신자 같은 수용체 3 (TLR3)의 특정 삭제와 마우스를 생성합니다.
- 골수 공여 세포의 제조
- 바이오 안전성 레벨 II 장에서 작업 할 수 있습니다. 독점적으로 멸균 악기를 사용하여 오염을 피하십시오.
- 골수 키메라 쥐를 생성받는 사람으로 congenic CD45.1 + C57BL / 6 암컷 마우스를 사용 TLR3 사용 - / -, Langerin-DTR / EGFP, 또는 중량 마우스 기증자로 CD45.2 +를 표현합니다. congenic 기증자와받는 사람 마우스를 사용하여 유동 세포 계측법을 통해 기증자와받는 사람 세포의 분화를 허용하고이 생착을 평가 할 수 있습니다.
- , 기증자의 골수 세포를 얻기 자궁 경부 전위 다음 이소 플루 란 마취와 기증자 쥐를 안락사합니다. 날카로운 가위는 발목 주위에 절개를 수행으로 M 있도록여러개 근육이 노출되어있다.
- 그 다리 근육이 표시되도록 사용 무딘 집게는 엉덩이쪽으로 발목에서 부드럽게 마우스 모피를 당깁니다.
- 날카로운 가위로 엉덩이의 높이와 대퇴골의 머리 위에 마우스 다리를 잘라.
- 배양 접시에 얼음에 다리를 놓습니다. 빠른 작업과 뼈를 노출하는 모든 근육을 제거합니다.
- 별도의 대퇴골과 경골. 가능한 세균을 제거하고 무 혈청 DMEM 5 ㎖를 함유하는 다른 페트리 접시에 즉시 배치를 5 분 동안 70 % 에탄올 용액에서 뼈를 놓는다. 잘라 뼈는 DMEM으로 골수를 날카로운 가위를 사용하여 세척 끝납니다. 5 ML의 주사기에 부착 된 26 G 바늘을 삽입하여 뼈에, 그래서 DMEM의 플러시 1 ml의 작업을 수행합니다. 뼈는 세척 후에는 흰색 (빈)보고해야합니다.
- DMEM 10ml에 공여 마우스의 모든 골수 세포를 수집. 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 수확 전달하여 골수 세포의 단일 세포 현탁액을 생성한다.
- CL냉장 원심 분리기에서 4 ° C에서 10 분 동안 260 XG에서 원심 분리하여 골수 세포의 귀 단일 세포 현탁액. PBS 10 ㎖에 재현 탁 된 세포 펠렛. 2.1.3 및 2.1.4에 기술 된 바와 같이 RBCL 용액을 사용하여 적혈구를 고갈.
- 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 골수 세포를 카운트. 트리 판 블루 염색 (13)를 통해 죽은 세포의 결정에 의해 세포 생존 능력을 평가합니다. 최적으로는 적어도 80 %의 생존율을 가진 하나의 동물 수율 약 3 × 107 개의 백혈구 세포 / 마우스.
- - / - 또는 중량 공여 세포 전체 골수 키메라의 경우, TLR-3을 제조. PBS 100 ㎕에서 2 × 106 세포는 이식을 위해 사용되기 때문에 최적의 세포 농도를 2 × 107 세포 / ㎖이다. 즉시 사용하지 않으면, 10 % DMSO로 느린 냉동 FBS 및 기법을 사용하여 -80 ° C에서 공여 세포를 보존. 혼합 된 키메라 모델 들어 Langerin-DTR 공여자 세포와 혼합 TLR3 - / -
- 마우스 조사 및 이식
- 세슘 137 소스 조사기 연령의 6~8주 사이의 여성 쥐를 조사. 쥐에게 떨어져 550 RAD 4 시간의 두 가지 용량을 제공합니다. 분할 조사는 급성 간 독성을 최소화하고, 따라서 조사 프로토콜에 의한 마우스의 치사율을 감소시킨다.
- 조사 후, 2 주 동안 항생제로 치료에서 쥐를 유지한다. Baytril / ㎏의 5 mg의 - 2.5에서 식수와 항생제를주십시오.
- 2 - 두 번째 조사 후 4 시간, 정맥 기증자의 골수 세포 이식 마우스. 2 × 106 세포를 함유하는 PBS 100 ㎕의 최대 음량을 사용하여 레트로 안와 분사 (13)를 통해 이소 플루 란 마취하에 공여 세포의 주입을 수행한다.
- 네 개의 주 이식 후, (100)의 샘플을 평가 생착적어도 두 가지 색상을 판독 할 수있는 기계를 사용하여 유세포 분석을 통해 말초 혈액 μL. 시중에서 판매하는 형광 표지 CD45.1 및 1/100과 1/200 사이에 희석을 사용 CD45.2 항 마우스 항체를 사용, 기증자와 라디오 방지받는 사람 세포를 구분합니다. 공여 세포의 생착 최적의 말초 혈액에서 전체 조혈 세포의 적어도 80 %이어야한다.
- 예방 접종 대상이 고갈
- 비강을 통해 재조합 라이브 감쇠 인플루엔자 백신과 쥐를 예방 접종. 마우스 접종, 정밀 기화기를 사용 산소 5 % 이소 플루 란으로 마취 된 마우스. 백신의 10 3 플라크 형성 단위 (PFU)를 포함하는 PBS의 50 μl를 관리하는 200 μL 피펫을 사용합니다.
- 최종 마우스 모델을 생성하기 위해, 비강 PBS의 50 μL에 희석 DT 50 NG와 쥐를 치료. 3.3.1에 설명 된대로 마취 된 쥐의 콧 구멍에 직접 강하에 의한 DT 드롭을 관리 할 수 있습니다. 취급의 미2 일 백신 접종 후 (그림 3B)까지 예방 접종 전날 -2에 치료를 시작 매일 복용과 CE.
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Representative Results
재조합 인플루엔자 생균 백신의 생성은 양방향 5 프로모터의 제어하에 인플루엔자 바이러스의 8 세그먼트를 코딩하는 플라스미드의 형질 감염에 의해 달성 될 수있다. 추위에 적응 된 인플루엔자 백신은 일반적으로 감기에 적응 변형뿐만 아니라 선택의 인플루엔자 균주의 HA 및 NA (예, H1N1) (그림 1A)의 여섯 세그먼트가 포함되어 있습니다. 냉 적응의 원리는 33 ° C, 마우스 및 인간 (14) 상부 호흡기 (URT)의 온도에서 바이러스 복제 제한에 기초한다. 따라서, 백신 URT에 어느 정도 복제 할 수 있지만, 하부 호흡기 폐렴을 야기 할 수 없다. 바이러스 뉴 라미니다 아제 (NA)의 줄기에 융합 PCR 기술, 보존 영역을 사용하는 것은 추적 OVA 유래 펩타이드 (SIINFEKL) (그림 1B)로 대체되었다.
역학 연구에서 백신 별 응답을 추적하려면 우리는이 백신 제제뿐만 아니라 키메라 마우스 모델로부터 유도 된 펩티드의 추적 찍은 장점. 3, 6 일 후 접종 사이 CD103 + 수지상 세포가 폐 배수 림프절 검출 할 수 SIINFEKL는 베어링 (12)은 (도 2A)를 노드. Multiparametric 유동 세포 계측법 실시간 백신 유래 된 항원 제시의 정량화 할 수 있습니다. 또한 SIINFEKL 특정 T 세포의 주입은 백신 특정 CD8 T 세포 반응 (도 2B)의 정량을 허용한다.
접종시 유전자 특이 기능을 평가하기 위해, 우리는 DTR 기술과 경쟁 골수 키메라 (도 3A)을 조합 한 마우스 모델을 고안했다. 이렇게함으로써, 유전자 기능의 손실을 예방 접종에 대한 면역 반응의 과정 (도 3B, C)을 통해 특정 세포 구획에 타겟팅 하였다.
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추적 LAIVs 그림 1. 공학. (A) ambisense 플라스미드 클로닝 인플루엔자 세그먼트 (마르티네스-Sobrido 외. (5)에 의해 기술 된 바와 같이 된 pDZ 백본), 2000. 24 시간 후 형질 전환 리포 펙 타민을 사용하여 293T 세포로 293T 세포로부터 얻은 상청액을 형질 감염시켰다 TPCK 트립신의 1 %의 존재 코트 인플루엔자 허용 Madin-다비 송곳니 신장 (MDCK) 세포에 사용되었다. 모든 프로토콜은 33 ℃에서 수행 하였다. MDCK 세포에서 바이러스 상층 액은 33 ℃에서 사흘 동안 9 일된 발육 계란에 접종 하였다. 바이러스 구제는 PCR 기반 바이러스 게놈의 증폭 및 시퀀싱으로 확인 하였다. (B) A / 푸에르토의 NA 유전자 (잔기 65-72) 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 (NA), 보존 된 영역으로 OVA 유래 SIINFEKL 펩티드 삽입 리코 / 34분의 8 (H1N1) 바이러스는 융합을 통해 SIINFEKL 펩타이드를 코딩하는 짧은 cDNA를 교체되었을 때PCR을. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 백신 기술을 추적. (A) 철새 DC가이 중 CD11c 의대 MHC 클래스 II 안녕하세요 세포와 같은 종격동 림프절 (mLNs)에 문이되었다. 예에서, 항원 - 함유 이동성 CD103 + 수지상 세포는 유동 세포 계측법에 의해 CD103 + H-2 B -SIINFEKL + 세포로 확인 하였다. (B) OT-I 특이 T 세포를 접종 같은 날에 마우스에 주입 하였다. 네 일 후, 세포를 접종 된 마우스의 림프절에서 수집 증식 프로파일에 대해 평가 하였다. FL-1 채널에 CFSE 희석은 세포 분열의 지표로 사용 하였다. CAV : 초기 적응 백신; CAV SIINFEKL :. OVA 유래 SIINFEKL 펩타이드를 발현 초기 적응 백신 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 유전자 기능 연구. 골수 키메라 (BMC) 및 예방 접종 전략 (A) 도식. Langerin-DTR을 표현 키메라 마우스에서 DT의 (-2 +2 이틀 전이나 예방 접종 후 DT의 관리 참조). (나) 추가가 철새 Langerin + DC가 폐에 CD103를 coexpressing의 특정 고갈을 할 수 있습니다. (C) 비교 키메라 마우스에서 백신 특정 T 세포의 분석. 366-374 NP 특이 적 CD8 T 세포의 검출은 상업적 dextramer 염색을 통해 이루어졌다.803fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 연구에서는 백신 유발 면역 생리학 및 분자 메커니즘을 규명하기 위해 이용 될 수있는 방법을 역 유전학 및 키메라 마우스 모델을 설명한다. 인플루엔자 역 유전학은 많은 실험실에서 설립 및 인플루엔자 발병 기전, 복제 및 전송 (17)을 이해하는데 주요한 역할을하고있다. 우리의 프로토콜의 핵심은 외국 항원을 표현 추위 적응 인플루엔자 백신의 구조입니다. 뉴 라미의 줄기로 짧은 cDNA를 도입 전략은 여러 그룹에 의해 설명되었지만, 연구자들은 추가적인 돌연변이 계란 백신 제조시 및 백신이 유도없이 호흡기로 복제 할 수 있음을 도입되지 않도록 할 필요 폐렴 5,12-. 바이러스 성 뉴 라미니다 제의 줄기뿐만 아니라 NS 유전자 분절과 PB1 세그먼트로서 인플루엔자 바이러스 게놈의 다른 영역들 모두 때문에 외래 서열 1의 할당을 허용9,20, 우리의 프로토콜의 수정은, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스, 백신 합리적인 디자인 핵심 대하여 T 세포 면역 반응의 계층 구조를 이해하기 위해 추가적인 외래 펩티드를 추가하는데 이용 될 수있다.
추적 백신 및 DC의 부분 집합의 DTR 기반의 고갈을 결합함으로써 우리는 특정 세포 하위 집합에 유전자 기능의 손실을 대상으로 할 수 있었다. 병원균 (21)에 대한 면역 반응을 규명하는 것이 아니라 백신 보호 할 책임 경로를 해부하지 전에이 기술을 적용하고있다. 인해 DTR 기반 모델의 가용성 키메라 마우스를 생성하는 기술의 유연성,이 기술은 또한 면역 기능 추가 백혈구 집단 유전자로 확장 될 수있다. 그것은 DT 치료 또한 림프 조직 등 CD8α + 수지상 등 langerin 발현 추가적인 DC 서브 세트의 고갈을 초래할 수 있다는 점이다. 따라서 그것은 매우 퍼가기하는 것이 좋습니다DT 치료의 효과를 평가하기 위해 용량 - 반응 연구를 rform. 우리의 모델의 잠겨진 동종 골수 이식은 전체 바이러스 CD8 T 세포 15 내성을 감소하는 것으로 나타났다는 것이다. 따라서,주의 이식 비 이식 생쥐간에 데이터를 비교할 때 발휘 될 수있다.
백신이 절실히 필요하는 몇 가지 주요 인간 병원체는 야생형 병원체 또는 마우스 대리를 사용하여 마우스 모델에서 공부하실 수 있습니다. 이들은 인플루엔자 바이러스, 말라리아 및 에볼라 바이러스를 포함한다. 본 연구에서 제안 된 기술은 백신 설계 합리화, 따라서 이들 병원균에 대해 실험 백신의 기본 메커니즘을 이해하는 데 도움이된다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
