Introduction
Genereringen av immunologiskt minne i frånvaro av sjukdom är den fysiologiska grunden för effektiv vaccinering 1. Nyligen har systembiologi baserade metoder visat att framgångsrika vacciner såsom vaccin mot gula febern, framkalla en stark induktion av medfödda immunsvar och aktivering av flera undergrupper av dendritiska celler (DC), vilket i sin tur leder till multilineage aktivering av antigen- specifika T-celler 2,3. Eftersom DC är den enda immuncellpopulation med förmåga att aktivera antigenspecifika naiva T-celler 4, är studiet av deras funktion under vaccination viktigt att förstå immunsvar mot vaccin och att utforma framtida strategier mot utmanande patogener.
Ett system som möjliggör spårning av olika DCS grupper under immunsvar mot vaccin skulle vara önskvärt för att fastställa en korrekt kinetik DC migration till lymfoidvävnader, och därför att tillhandahållainsikt i de fysiologiska mekanismer som ansvarar för initiering av vaccinspecifik adaptiv immunitet. Omvänd genetik baserade strategier erbjuder möjligheten att generera modifierade, levande försvagade vacciner som kan användas experimentellt med detta syfte. Sedan dess genomförande på forskning influensa, har plasmid-baserad omvänd genetik i stor utsträckning användas för att generera rekombinanta influensastammar inklusive LAIVs. Standardprotokoll för att rädda rekombinanta influensavirus kräver flera transfektion av mycket transfekterbara cellinjer med ambisense plasmider (producerar både positiva och negativa RNA) innehållande åtta influensa virala segment samt förstärkning i en tillåtande system såsom Madin-Darby Canine Kidney ( MDCK) celler och / eller kyckling embryone ägg 5. Förblir dock tillämpningen av omvänd genetik att skapa molekylära verktyg för att studera immunmekanismerna vaccination outforskade.
Alstringennya musmodeller möjliggör specifik utarmning av immuncellundergrupper, inklusive utvecklingsländerna, har öppnat nya möjligheter att förstå de grundläggande immun mekanismerna bakom vaccin framkallade skydd. Jämförelsen mellan DC delmängd funktioner hos möss och människor har visat att, i stor utsträckning, mus och mänskliga utvecklingsländerna är funktionellt homolog 6,7, dessa fynd starkt tyder på att utvecklingen av musmodeller tillåter specifik utarmning av DC i steady state och under inflammatoriska tillstånd, kan tjäna till att förstå fysiologin hos DC responser hos människor. Under de senaste åren har ett antal musmodeller har genererats som bär transgener som uttrycker simian difteritoxin (DT) receptor (DTR) under kontroll av promotorregionen av en gen av intresse 8,9. Eftersom musvävnader inte naturligt uttrycker DTR, dessa modeller tillåter villkorlig utarmning av cellgrupper bär riktade genen av intresse på mus ympning med DT. Således vår ability att tömma särskilda utvecklingsländerna och andra leukocyter in vivo under fysiologiska processer, har förbättrats avsevärt genom utvecklingen av DTR-baserade ro. Men även om dessa transgena musmodeller har använts i stor utsträckning för att förstå ontogenin av immunsystemet, deras tillämpning på vaccinutveckling har knappt testat. Här, genom att kombinera influensa omvänd genetik och DTR-baserade konkurrenskraftiga benmärgs chimärer, föreslår vi en metod för att studera kinetiken vaccin immunitet såväl som enskilda geners funktion under immunsvar på vacciner in vivo. Tillämpningen av denna teknik för preklinisk utvärdering av nya vacciner mot utmanande infektionssjukdomar kan bidra till att rationalisera vaccin design och testa vaccinkandidater in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök utfördes enligt godkända protokoll och följa riktlinjerna i den tyska djurskyddslagen. All personal som utför djurförsök passerade utbildningsprogram enligt kategori B eller C i Federation of European Laboratory Animal Science föreningar.
1. Framställning av rekombinant levande försvagat influensavaccin Vaccines genom omvänd genetik
OBS: detaljerat protokoll för generering av rekombinanta influensavirus av omvänd genetik har beskrivits av tidigare studier 5 och är utanför ramen för denna rapport. I korthet är rädda vacciner kall anpassad influensa (CAV) gjort i en biosäkerhet klass II skåp under skyddsnivå 2 (BSL2) inneslutning och omfattar åtgärder som anges nedan. Den transfektion och infektion protokoll framgår att av Martinez-Sobrido et al. 5.
- Generera en reassortant kallanpassad influensavaccin med användning som bakgrund kallanpassad stam A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), liksom hemagglutinin (HA) och en modifierad neuraminidas (NA) av A / PR / 8/34 (H1N1) -stammen ( Figur 1A). Ändringen i NA-genen består av en PCR-baserad ersättning av en konserverad sekvens i protein stjälk (resterna 65-72) med en kort cDNA-sekvens som kodar för kycklingovalbumin (OVA) härledda peptiden SIINFEKL (Figur 1B). Den SIINFEKL-peptiden är en mycket immundominant peptid i samband med H-2b MHC klass I-begränsade svaret hos C57BL / 6-möss 12.
- Plate 10 6 293T celler per brunn i 6-brunnars plattor med användning av DMEM 10% fetalt bovint serum (FBS) kompletterat med 1% penicillin / streptomycin (P / E).
- Förbered plasmidtransfektion blandning: Lägg ett ig av var och en av plasmiderna som kodar för cDNA för PB2, PB1, PA, NP, M, NS från influensa A / Ann Arbor / 6/60-stammen och en xg av plasmiderna som kodar för NA -SIINFEKL ochHA från influensa A / PR / 8/34. Lägg förvärmda OptiMEM (15 | il för en slutlig volym av 100 | il / brunn).
- Inkubera transfektion mix för 30 minuter vid RT.
- Lägg 100 pl av transfektionsblandning / brunn och inkubera i 16 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Ändra cellmedia genom DMEM 0,3% BSA 1% P / E vid 33 ° C och 5% CO2 under 5 timmar.
- Lägg 10 6 influensa permissiva MDCK-celler i DMSO innehållande en xg / ml av trypsin från bovin pankreas behandlades med L-1-Tosylamide-2-fenyletyl-klormetylketon (TPCK-trypsin). Underhålla 293T-MDCK samkulturer för 2 - 3 dygn vid 33 ° C och 5% CO2.
- Samla supernatanter av MDCK-293T-cell samkulturer och klar genom centrifugering vid 260 xg under 5 minuter.
- Inokulera 9-10 dagsgamla kyckling embryonerade ägg under sterila förhållanden. För att göra detta, gör ett hål på toppen av äggskal som indikeras av Martinez-Sobrido et al. 5.
- Täck äggskal kvickheth smält vax med en bomullspinne och ruvar ympade hönsägg under 3 dagar vid 33 ° C.
- Skörda allantoisvätska från infekterade embryonerade ägg: Tvätta äggskal med 70% etanol. Öppna ägg med en mycket försiktigt spricka i den övre delen och avlägsna allantois membranet med användning av steril pincett. Använd en 10 ml pipett för att samla in så mycket vätska som möjligt (typiskt 6 - 10 ml). Centrifugera vid 260 xg under 10 min vid 4 ° C och överföra den rensade allantoisvätska till nya rör.
2. Tracking Vaccin-specifik immunitet
- Spårning av peptidbärande dendritceller (DC)
- För vaccination mus, söva möss med 5% isofluran i syre med en precision Vaporizer. Använd en 200 jil pipett för att administrera 50 | il PBS innehållande 10 3 plackbildande enheter (pfu) av vaccin som uttrycker det SIINFEKL-peptiden via droppar direkt till mus näsborrar.
- Tre dagar efter vaccination, euthanize-möss via isoflurananestesi följt av halsdislokation.
- Lyft mushud vid mittlinjen strax under bröstkorgen med pincett och skär ett litet snitt genom huden med en sax. Ur snittet, göra en 3 - 5 cm långa skär genom huden mot både huvud och svans, sedan två 2 cm snitt från mittlinjen i sidled från vardera änden. Dra av huden för att avslöja de peritoneala och bröstkorg hålrum. Skär försiktigt genom membran som omger bukhinnan att exponera bröstkorgen.
- För att komma åt mediastinumen skär diafragma och botten av buren revbenet. Hitta och ta bort två mediastinala lymfkörtlar (MLNs), något dorsala och lateralt intill tymus, medialt intill brachiocephalic artären, nära den ventrala sidan av trakea.
- För att skörda MLNs använda böjda pincett. Placera pincett under lymfkörtlarna och dra upp dem försiktigt. Placera lymfkörtlar i en 6-brunnar innehåller 1 ml DMEM och ta bort eventuella connective eller fettvävnad som omger noden.
- Reta varje prov noggrant med två 26 G nålar knutna till 1 ml sprutor. Att retas lymfkörteln, håll ner den med en nål, medan bryta upp lymfkörteln med andra nål. När detta är gjort på rätt sätt, är koncentrerade cellerna spricker från lymfkörteln lätt observeras i media. Pass alla vävnadsmaterial genom en 70 pm nylonfilter för att få enkelcellsuspensioner.
- Centrifugera enstaka cellsuspensioner för 10 minuter vid 260 x g i en kyld centrifug. Resuspendera cellpelleten i 2 ml röda blod cellyserande (RbCl) buffert för att lysa röda blodkroppar. Tillåt lys fortgå under 3 min vid RT.
- Neutralisera RbCl buffert genom centrifugering och cell resuspension i 2 ml iskall PBS.
- Plate celler i U-formade 96-brunnars plattor i en koncentration av 10 7 celler / ml i en slutvolym av 100 | il.
- För flödescytometrianalys, blockera cell Fc-receptorer med användning av1 pg av anti-mus CD16 / CD32-antikroppar per 10 6 celler under 15 minuter på is.
- Centrifug plattor och kassera supernatanter från plattan rulla. Inkubera enskilda brunnar med ytan antikropps kombinationen av val. Typiskt för detektion av dendritiska celler i lymfkörtlarna, bör antikroppscocktail inkluderar: 0,25 | ig av anti-CD11c, 0,25 | j, g av CD11b, 0,5 ^ g av MHC klass II, 0,25 pg av CD103 och 0,15 pg av CD8a i en slutvolym av 100 il.
- För negativ grind, tillsätt 0,25 pg av anti-CD3, CD19, NK1.1 eller härstamning cocktail (Figur 2A). Alternativa grind strategier samt protokoll för korrekt ersättning av flera fluorescerande färgämnen kan hittas på webbplatsen för immunologiska Genome Project. Förutom de ytmarkörer av val, tillsätt 1 | j, g av en antikropp mot H-2K '' bunden till SIINFEKL till cocktailen. Detta kommersiellt tillgänglig antikropp möjliggör visualisering av DC in som SIINFEKL peptiden är bunden till ytan MHC klass I.
- Inkubera cellerna med ytan antikroppar under 30 minuter på is. Skydda plattan från ljus. Centrifugera plattor vid 260 xg under 5 minuter och tvätta med 2 ml PBS två gånger. Överför celler till flödescytometri rör för analys.
- Bedömning av vaccin-specifik T-cellproliferation
- Erhåll donator-T-celler från kommersiellt tillgänglig TCR-transgena möss (OT-I-möss) (C57BL / 6-Tg (Tcr aTcrb) 1100Mjb / J) i vilken alla de genererade CD8 T-celler är specifika för SIINFEKL-peptiden. Euthanize möss genom isoflurananestesi följt av cervikal dislokation. Skörd mjälte genom att utföra ett snitt i bukhålan. Placera mjälten / si 2 ml DMEM / mjälte och avlägsna bind och fettvävnad.
- Generera enkelcellsuspensioner från mjälte efter det förfarande som beskrivs i 2.1.2 och 2.1.3.
- För att ytterligare berika enda cellsuspensionen på T-celler, tillämpa magnetisk pärla separationsprotokollmed hjälp av antingen positiv eller negativ urvalsförfaranden 12. För att skilja donator från mottagarceller, använd kongena möss så att till exempel recipientmöss uttrycker leukocyter markör CD45.1 medan donator T-celler uttrycker CD45.2 12.
- För att märka T-celler, inkubera dem i en ml PBS innehållande 5 pM karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) i en optimal celldensitet av 5 x 10 6 celler / ml. Inkubera cellerna under 20 min vid 37 ° C, skyddat från ljus. Efter inkubation för att centrifugera cellerna vid 260 xg under 5 minuter, kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 3 ml fetalt bovint serum (FBS) neutralisera CFSE.
- Centrifugera cellerna vid 260 xg under 10 min och återsuspendera i tillräcklig volym PBS så att 100 pl lösning innehåller 2 x 10 6 celler. Ingjuta mottagande kongena möss med 2 x 10 6 celler / mus via retro-orbital sinus injektion 13.
- Euthanize mottagarmöss vid dagarna 3, 4 och 5 eftervaccination med hjälp av isoflurananestesi följt av halsdislokation. Harvest mediastinum lymfkörtlar och förbereda enkelcellsuspensioner för flödescytometri som anges i 2.1.2-2.1.5.
- Identifiera donatorceller genom färgning av enkelcellsuspensioner i 100 | il av en antikroppscocktail innehållande: 0,25 | ig av anti-mus-CD3, CD4 och CD8-antikroppar; 0,5 | j, g av anti-mus-CD45.1 eller CD45.2 antikropp (beroende på fenotypen av donatorceller). Lämna FL-1 kanal av flödescytometern öppna (FITC) för att bestämma utspädningsprofil CFSE 12 (Figur 2B).
3. Chimära möss att dissekera Genspecifika Vaccine svar
OBS: Den generation av konkurrenskraftiga benmärgs chimärer använder DTR-baserade musmodeller tillåter diskriminering av cellspecifika funktioner under immunsvaret efter vaccination. Här visar vi en ytterligare strategi genom vilken kombination av DTR-uttryckande givare calnar med celler från knockoutmöss tillstånd att studera gen specifika funktioner under immunitet i specifika cellavdelningar. I exemplet skapar vi möss med specifika radering av Toll-like receptors 3 (TLR3) i Langerin + CD103 + DC.
- Framställning av benmärgsdonatorceller
- Arbete inom ramen för en skyddsnivå II skåp. Undvik kontaminering genom att använda uteslutande autoklave instrument.
- För att generera benmärgs chimära möss, använd kongena CD45.1 + C57BL / 6 honmöss som mottagare och använda TLR3 - / -, Langerin-DTR / EGFP eller wt möss som uttrycker CD45.2 + som donatorer. Använda kongena givar- och mottagarländerna möss tillåter differentiering av givar- och mottagarceller via flödescytometri och detta gör inympning som ska utvärderas.
- För att erhålla donatorbenmärgsceller, euthanize donatormöss med isoflurananestesi följt av cervikal dislokation. Med vassa saxar utföra snitt runt anklarna så att mOuse muskulaturen utsätts för.
- Använda trubbig pincett dra mushud och päls försiktigt från vristen mot höfterna så att benmusklerna är synliga.
- Med skarpa sax klippa mus ben i höjd med höfterna och ovanför huvudet på lårbenet.
- Placera ben på en petriskål och på is. Arbeta snabbt och ta bort alla muskler för att exponera benen.
- Separata lårben och skenben. Placera benen i en lösning av 70% etanol under 5 minuter för att avlägsna eventuella bakterier och placera dem direkt på en annan petriskål innehållande 5 ml serumfritt DMEM. Skär benändarna använder vass sax och spola benmärgen in i DMEM. För att göra detta, skölj 1 ml DMEM i benet genom att sätta en 26 G nål fäst vid en 5 ml spruta. Se till att benen ser vitt (tom) efter spolning.
- Samla alla benmärgsceller från donatormöss i 10 ml DMEM. Generera enkelcellsuspensioner från benmärgsceller genom att skörden genom en 70 ìm cell sil.
- Clöron enkelcellsuspensioner av benmärgsceller genom centrifugering vid 260 xg under 10 min vid 4 ° C i en kyld centrifug. Resuspendera cellpelleten i 10 ml PBS. Utarma röda blodkroppar med användning RbCl lösning som beskrivet i 2.1.3 och 2.1.4.
- Räkna benmärgsceller med hjälp av antingen en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare. Bedöm cellviabiliteten genom bestämning av döda celler via trypanblått-färgning 13. Optimalt ett enskilt djur ger ca 3 x 10 7 vita blodkroppar / mus med en lönsamhet på minst 80%.
- I fallet med de totala benmärgs chimärer, förbereda TLR-3 - / - eller viktdonatorceller. Den optimala cellkoncentrationen är 2 x 10 7 celler / ml sedan 2 x 10 6 celler i 100 | il PBS kommer att användas för transplantation. Om den inte används omedelbart, bevara donatorceller vid -80 ° C med användning av långsam frysning metoder och FBS med 10% DMSO. För blandade chimära modellen, blanda Langerin-DTR-donatorceller och TLR3 - / -
- Mus bestrålning och transplantation
- Bestråla honmöss mellan 6 - 8 veckors ålder i en cesium-137 källa bestrå. Ge möss två doser av 550 rad 4 timmar isär. Split bestrålning minimerar akut levertoxicitet och minskar därför musen dödlighet på grund av strålnings protokollet.
- Efter bestrålning hålla möss under behandling med antibiotika för två veckor. Ge antibiotika med dricksvattnet vid 2,5-5 mg Baytril / kg.
- 2-4 h efter den andra bestrålningen, transplantations möss med givarbenmärgsceller intravenöst. Utför injektion av donatorceller via retro-orbital sinus injektion 13 och under isoflurananestesi använder maximal volym av 100 pl PBS innehållande 2 x 10 6 celler.
- Fyra veckor efter transplantation, utvärdera inympning i ett prov av 100il perifert blod via flödescytometri med användning av en maskin kan läsa minst två färger. För att skilja mellan givare och radioresistenta mottagarceller, använda kommersiellt tillgängliga fluorescerande CD45.1 och CD45.2 antimusantikroppar använder späd mellan 1/100 och 1/200. Optimal inympning av givarceller bör vara minst 80% av den totala hematopoietiska celler i perifert blod.
- Vaccination och målinriktad utarmning
- Vaccinera möss med rekombinant vaccin levande försvagat influensa via intranasal. För vaccination mus, söva möss med 5% isofluran i syre med en precision Vaporizer. Använd en 200 jil pipett för att administrera 50 | il PBS innehållande 10 3 plackbildande enheter (pfu) av vaccinet.
- För att generera den slutliga musmodell, behandla möss med 50 ng DT utspädd i 50 pl PBS intranasalt. Administrera DT droppvis direkt till näsborrarna av sövda möss som beskrivs i 3.3.1. Behandla mice med dagliga doser som börjar behandling på dag -2 före vaccinationen tills dag 2 efter vaccination (Figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generering av rekombinanta vacciner färsk attenuerade influensa kan åstadkommas genom transfektion av plasmider som kodar för de åtta segmenten av influensavirus under kontroll av dubbelriktade promotorer 5. Ett vaccin kall-anpassade influensa innehåller vanligen sex segment av en kall-anpassade stammen samt HA och NA av influensa stam av val (t.ex. H1N1) (Figur 1A). Principen om kall anpassning bygger på virus begränsad replikation vid 33 ° C, temperaturen i övre luftvägarna (URT) hos möss och människor 14. Därför kan vaccinet replikera i viss utsträckning i URT men kan inte orsaka nedre andningsvägarna pneumoni. Använda fusions-PCR-teknik, en konserverad region i stammen hos viralt neuraminidas (NA) ersatte en spårbar OVA-härledd peptid (SIINFEKL) (Figur 1B).
För att spåra vaccinspecifika svar i kinetiska studier vi har utnyttjat spår peptider härledda från vaccinformuleringen liksom chimära musmodeller. Mellan dag 3 och 6 efter vaccination, SIINFEKL bärande CD103 + DC kan upptäckas i lungan dränerande lymfkörtlar 12 (Figur 2A). Multiparameter flödescytometri möjliggör kvantifiering av vaccin härrörande antigen presentation i realtid. Dessutom infusion av SIINFEKL-specifika T-celler tillåter kvantifiering av vaccin-specifika CD8 T-cellssvar (figur 2b).
För att utvärdera genspecifika funktioner under vaccination vi utarbetat en musmodell som kombinerar DTR-teknik och konkurrenskraftiga benmärgs chimärer (Figur 3A). Genom att göra detta, var förlusten av genfunktion riktad till specifika cellavdelningar under loppet av immunsvar på vaccination (Figur 3B, C).
52803 / 52803fig1.jpg "/>
Figur 1. Konstruktion av spår LAIVs. (A) Influensa segment klonade i ambisense plasmider (PDZ ryggrad som beskrivits av Martinez-Sobrido et al. 5) transfekterades in i 293T-celler med hjälp av Lipofectamine 2000. 24 timmar efter transfektion, supernatanter erhållna från 293T-celler användes för att belägga influensa permissiv Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) -celler i närvaro av 1% av TPCK trypsin. All protokollet utfördes vid 33 ° C. Viral supernatanter från MDCK-celler ympades sedan i 9 dagar gamla embryonerade hönsägg under tre dagar vid 33 ° C. Viral räddning bekräftades av PCR-baserad virusgenom förstärkning och sekvensering. (B) Om du vill infoga OVA härrörande SIINFEKL peptid i influensaneuraminidas (NA), en konserverad region (resterna 65-72) av NA-genen av A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) -virus ersattes för en kort cDNA som kodar för SIINFEKL peptiden via fusionPCR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Vaccin spåra tekniker. (A) flyttande DC var gated i mediastinal- lymfkörtlarna (MLNs) som CD11c Med MHC klass II hi celler. I exemplet var antigenbärande migrations CD103 + DC: er identifierades som CD103 + H-2 b -SIINFEKL + celler genom flödescytometri. (B) OT-I-specifika T-celler infuserades till möss på samma vaccinationsdagen. Fyra dagar efter, uppsamlades celler från lymfkörtlar från vaccinerade möss och utvärderas för deras proliferation profil. CFSE utspädning på FL-1 kanal användes som indikator på celldelning. CAV: Kall anpassad vaccin; CAV SIINFEKL :. Kall anpassad vaccin som uttrycker OVA-härledda SIINFEKL peptid Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Gene funktionsstudier. (A) Schematisk bild av benmärgs chimärer (BMC) och vaccinationsstrategier. (-2 Och +2 avser administration av DT två dagar före eller efter vaccination). (B) Tillsats av DT i chimära möss som uttrycker Langerin-DTR tillåter specifik utarmning av migrations Langerin + DCs samuttrycker CD103 i lungan. (C) Jämförande analys av vaccinspecifika T-celler i chimära möss. Upptäckt av NP 366-374 specifika CD8 T-celler gjordes via kommersiella dextramer färgning.803fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie beskriver vi hur omvänd genetik och chimära musmodeller kan utnyttjas för att belysa de fysiologiska och molekylära mekanismer av vaccin-inducerad immunitet. Influensa omvänd genetik är etablerad i många laboratorier och har spelat en chefsroll i att förstå influensa patogenes, replikering och överföring 17. En viktig punkt i våra protokoll är rädda vacciner kall anpassad influensa som uttrycker främmande epitoper. Även strategin att införa korta cDNA i stjälken av neuraminidas har beskrivits av många grupper, måste utredaren att säkerställa att inga ytterligare mutationer introduceras under vaccinproduktion i ägg och att vaccinet kan replikera i luftvägarna utan att inducera pneumoni 5,12. Eftersom både stjälken av viralt neuraminidas såväl som andra regioner av influensagenomet såsom NS-gensegmentet och PB1 segmentet tillåter tilldelning av främmande sekvenser 19,20, kan modifieringar av våra protokoll användas för att lägga till ytterligare utländska peptider till exempel, förstå hierarkier av T-cellimmunsvar mot influensavirus, en viktig punkt för rationell vaccin design.
Genom att kombinera spårvacciner och DTR-baserade utarmning av DC delmängder har vi kunnat rikta förlust av geners funktion till specifika cellgrupper. Denna teknik har tillämpats tidigare för att belysa immunsvar på patogener 21, men inte för att dissekera vägar som ansvarar för vaccinskydd. På grund av tillgången på DTR-baserade modeller och flexibiliteten i tekniken för att skapa chimära möss, kan denna teknik utökas ytterligare till ytterligare leukocytpopulationer och gener med immunförsvaret. Det är viktigt att notera att DT behandling också kan leda till utarmning av ytterligare DC delmängder uttrycker langerin såsom CD8a + DC i lymfvävnad. Därför är det starkt rekommenderat att peR form en dos-responsstudie för att utvärdera effekterna av DT behandling. En potentiell nackdel med vår modell är att allogen benmärgstransplantation har visat sig minska totala antivirala CD8 T-cellsimmunitet 15. Sålunda har försiktighet iakttas när man jämför data mellan transplanterade och icke-transplanterade möss.
Flera viktiga mänskliga patogener som vacciner finns ett akut behov kan studeras i musmodeller med hjälp av vild-typ patogener eller mus surrogat. Dessa inkluderar influensavirus, Plasmodium och ebolavirus. De tekniker som föreslås i denna studie kan bidra till att förstå den grundläggande mekanismen av experimentella vacciner mot dessa patogener och därför, för att rationalisera vaccin design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
