Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Automatiseret Cell Berigelse af cytomegalovirus-specifikke T-celler til kliniske applikationer ved hjælp af Cytokin-capture system

Published: October 5, 2015 doi: 10.3791/52808
* These authors contributed equally

Abstract

Adoptiv overførsel af patogen-specifikke T-celler kan anvendes til forebyggelse og behandling af opportunistiske infektioner såsom cytomegalovirus (CMV) -infektion forekommer efter allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation. Viral-specifikke T-celler fra allogene donorer, herunder tredjeparts donorer, kan formeres ex vivo i overensstemmelse med gældende god fremstillingspraksis (cGMP), som beskæftiger gentagne runder af antigen-drevet stimulering til selektivt udbrede ønskede T-celler. Identificering og isolering af antigenspecifikke T-celler kan også foretages på basis af cytokin datafangstsystem af T-celler, der er blevet aktiveret til at udskille gamma-interferon (IFN-γ). Imidlertid har udbredt anvendelse på mennesker af cytokin capture-system (CCS) for at hjælpe med at genoprette immunitet været begrænset, da produktionsprocessen er tidskrævende og kræver en dygtig operatør. Udviklingen af ​​en anden generation celle berigelse enhed såsom CliniMACS Prodigy nugiver forskere at generere viral-specifikke T-celler under anvendelse af en automatiseret, mindre arbejdskrævende system. Denne enhed separerer magnetisk mærkede celler fra umærkede celler ved hjælp af magnetisk cellesortering teknologi til at generere klinisk-grade produkter, er manipuleret som et lukket system, og kan tilgås og drives på benchtop. Vi demonstrerer, hvorledes denne nye automatiserede celle berigelse enhed til at fremstille CMV pp65-specifikke T-celler opnået fra en steady-state aferese produkt opnået fra en CMV-seropositive donor. Disse isolerede T-celler kan derefter direkte infunderes i en patient under institutionelt og føderale tilsyn. Alle bio-bearbejdningstrin herunder fjernelse af røde blodlegemer, er stimulering af T-celler, adskillelse af antigen-specifikke T-celler, rensning og vask fuldautomatisk. Enheder såsom dette hæve den mulighed, at T-celler til human anvendelse kan fremstilles uden for dedikerede god fremstillingspraksis (GMP) Faciliteter og i stedet blive produceret i blodet bankfaciliteter hvor personalet kan tilsyn automatiserede protokoller til at producere flere produkter.

Introduction

Hæmatopoietisk stamcelle transplantation (HSCT) 1 kan kombineres med adoptiv T-celleterapi at forbedre graft-versus-tumor effekt og give immunitet over for opportunistiske infektioner 2. Generering af antigen-specifikke donor-afledte T-celler til infusion har historisk krævet faglært personale og anvendelse af specialiserede faciliteter, der er GMP-kompatibel. Levering af sådanne T-celler har resulteret i løsningen af opportunistiske infektioner 3 samt behandle den underliggende malignitet 4. For nylig har forskere vist, at adoptiv overførsel af kun få tusinde virus-specifikke T-celler (~ 1 x 10 4 - 2,5 x 10 5 celler / kg af modtagerens legemsvægt) kan med held behandle opportunistiske infektioner efter CMV allogen HSCT 5-9. Et begrænset antal GMP faciliteter med tilhørende dygtige produktionskrav og de høje omkostninger forbundet med celle produktion har imidlertid restricted patient adgang til lovende T-celleterapi 10. En metode til isolering af antigenspecifikke T-celler er baseret på CCS ved hjælp af en bi-specifikt reagens til at genkende CD45 og IFN-γ. Som det er vist, kan denne metode anvendes til at frembringe klinisk kvalitet CMV-specifikke T-celler under anvendelse af en automatiseret celle berigelse CCS enhed (figur 1B).

CMV-specifikke T-celler genereres ved at inkubere overlappende peptider fra CMV pp65-antigen med leukaferese samlede nukleare celler (TNC) fra CMV-seropositive donorer. Disse peptider, der vises i forbindelse med human leukocyt antigen (HLA), aktivere CMV pp65-specifikke T-celler i TNC at udskille IFN-γ. Disse T-celler kan derefter "fanget", og magnetisk adskilt. Driften af den første generation af celle berigelse enhed (figur 1A), der kræves personale faglærte i cellekultur under GMP betingelser, og koordinering af personale til at foretage de mange sbeskæftigelsespagterne nødvendigt at generere en "fanget" produkt.

Proceduren typisk kræves 10 til 12 timers kontinuerlig drift, og derfor personale sandsynligvis nødt til at arbejde over to skift i GMP facilitet. Disse begrænsninger er nu undgås ved gennemførelsen af en anordning, andengenerations (vist i figur 1B). Denne enhed forpligter magnetiske berigelse, svarende til den første generation enhed, men automatiserer andre aspekter af CCS i en unbreached tilgang. Dette reducerer belastningen af ​​GMP teamet, da de fleste af de skridt kan udføres uden opsyn af personale. Eftersom enheden fungerer som et lukket system, det antigen-specifikke T-celler kan indfanges og behandles i laboratoriet med undtagelse af trin involveret i leukaferese isolation og fremstilling af materialer før start instrumentet. Detaljer for den komplette instrumentering og funktionalitet af denne anden generation celleberigelse enhed blevet pubnedsat 11.

Her beskriver vi de trin, som vil berige CMV pp65-specifikke T-celler fra en steady-state afereseprodukt hjælp af automatiserede celle berigelse CCS system. Efter isolering kan disse CMV-specifikke T-celler straks infunderes i en patient.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af materialer under sterile forhold (se Materialer og udstyr tabel)

  1. Forbered 3 L PBS / EDTA-buffer suppleret med humant serumalbumin (HSA) til en slutkoncentration på 0,5% (w / v).
  2. Forbered 1 L pose klinisk kvalitet 0,9% natriumchlorid (NaCl) opløsning og 2 l GMP kvalitet celledyrkningsmedium.
  3. Forbered 60 nmol af CMV-specifikt peptidantigen cocktail ved rekonstituering et hætteglas af CMV pp65 med 8 ml sterilt vand.
  4. Overfør CMV pp65 peptid cocktail i en 50 ml volumen frysepose under anvendelse af en Luer / Spike samkøringslinje og klemme med låsende pincet for at undgå efterfølgende distribution af cocktail i slangesættet. Åbne celler berigelse slangesættet (TS 500) under sterile betingelser.
  5. Brug steril slange svejser, tilslut peptid cocktail frysning taske i rør-tilslutning til ventil 2 af slangesæt TS 500. Åbn ikke peptid-cocktail taske klemme på dette tidspunkt.
  6. Fjern 1 x 10 9 TNC starte cellulært produkt og den suspenderes i PBS / EDTA-buffer indeholdende 2,5% HSA til et totalvolumen på 50 ml. Sprøjt cellulære produkt ind i en 150 ml overførsel taske.

2. Udarbejdelse og brug af automatiske Cell Enrichment (se Materialer og udstyr tabel)

  1. Tænd celle berigelse (figur 1B), og vælg programmet "CCS_IFN-γ Berigelse". Overhold en brugergrænseflade viser skærme med instruktioner og billeder vejledende operatøren gennem proceduren.
  2. Indtast parameteren "Operator" og "Tubing Set P / N Nej". Dernæst installere Tubing Set 500 til automatiseret celle berigelse enhed som pr instruktioner, der vises på monitorskærmen interaktiv.
  3. Følg trin for trin instruktioner, der vises på skærmen for at forbinde mellemstore og buffere til enheden. Optag katalognummer og lotnummer af reagenserne før Tilslug til instrumentet.
  4. Efter den endelige kontrol af slangen sæt, åbne klemmen af ​​peptidet cocktail taske. Åbn medium pose og initiere automatisk priming af slangesættet.
  5. Efter grunding er fuldført, supplere HSA (2,5%) i NaCI-buffer i reservoiret posen (200 ml) ved hjælp af den sterile rør svejser. Overfør start cellulære produkt i "Application posen" ved hjælp af den sterile slange svejser.
  6. Tilslut CCS (IFNy) reagenser til respektive slanger via adaptere. Indtast foretrukne tid til at indsamle en brøkdel af cellulært materiale inden tilsaetning proces. Gennemgå og kontrollere rigtigheden af ​​alle data / parametre indtastes. Starte processen.
  7. Før starten af ​​automatiserede celle berigelse proces, skal du fjerne Quality Control Bag (QCB, original fraktion (ori) indeholder ca. 1,3 ml ud af 100 ml kammer indhold fortyndet med PBS / EDTA-buffer). Forsegl QCB, vejer, og opbevares ved 4 ° C.
  8. Start enrichment processen. Ved afslutningen af ​​processen vil målceller elueres med en omtrentligt volumen elueringsbuffer fra reservoiret posen.
  9. Forsegl Non Target Cell Bag (NTCB, negativ fraktion = neg) og Target Cell Bag (TCB, positiv fraktion = POS) og vejer hver pose. Vægtene skal bruges senere til beregning af celle numre.
  10. Umiddelbart efter proceduren berigelse indsamle to portioner pr fraktion til flowcytometri analyse, og gemme resten af ​​prøverne ved 4 ° C. Brug en prøvealikvot for celletal bestemmelse, og den anden prøvealikvot til analysen berigelse resultater (tabel 1).
  11. Fjern slangen sat fra instrumentet celle berigelse. Overfør logfilen til et USB-drev til fremtidig brug.
    BEMÆRK: Alle reagenser skal være forberedt under sterile forhold. Brugen af ​​en biosikkerhed type II hætte anbefales. Brug steady-state aferese cellulært produkt (ikke-mobiliseret) isoleret fra en sundCMV-seropositive donorer at berige CMV antigenspecifikke T-celler. Eneste FDA licenseret HSA bør anvendes. Bufferen til fremstilling celle skal opbevares ved +19 ° C til +25 ° C som lavere eller højere temperaturer vil resultere i reduceret renhed og en reduceret udbytte af målcellerne.

3. celletal Bestemmelse

  1. Tag portioner af QCB, NTCB og TCB for celletal, som vist i tabel 1. Tilføj CD45-VoBlue til hver alikvot (titer 1:11) og inkuberes i mørke i 10 minutter ved 4 ° C.
  2. Tilføj 1,5 ml frisk fremstillet lyse af røde blodlegemer opløsning (1x) til den oprindelige fraktion og negative fraktion, 450 pi frisk fremstillet lyse af røde blodlegemer løsning på den positive fraktion, og inkuberes alle fraktioner i 15 minutter ved stuetemperatur.
  3. Lige før analyse, tilføje propidiumiodid til en slutkoncentration på 1 ug / ml (1: 100 fortynding af 100 ug / ml). Brug automatisk celletæller at bestemme celletal og VIevne. Brug celletalsmåleren anordning anbefalede software til flowcytometri analyse. Bestem de absolutte tællinger af leukocytter for originale, negative og positive fraktioner.
    BEMÆRK: celletal af levedygtige leukocytter per ml af de udtagne til celletælling analyse prøver bestemmes ved hjælp af cellen analysator anbefalede software.
  4. Indstil region som vist i figur 2 (område 5, levedygtige leukocytter). Brug følgende gating strategi til at bestemme celletal. En levedygtig leukocyt i original fraktion er vist i figur 2.
  5. De angivne områder (Figur 2, 1-6) er hierarkisk som følger:
    1: Time gate → 2: Enkelte celler → 3: CD45 + celler → 4: Leukocytter (rester undtaget) → 5: Levedygtige leukocytter → 6: Levedygtige lymfocytter
  6. Gentag de samme trin til at bestemme celletal for negative og positive fraktioner. Beregn celletallet af hele fraktionenved at betragte fortyndingsmiddel faktor prøven og samlede volumen af fraktion (tabel 2).

4. Undersøgelse af Separation ydeevne

  1. Vask portioner af QCB, NTCB og TCB fraktion celler med præ-kølet PBS / EDTA-buffer / 0,5% AB-serum. Centrifuger cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved 4 ° C og supernatanten aspireres.
  2. Resuspender celler i 100 pi antistof-fluorochrom farvning blanding indeholdende: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue og anti-IFNy-PE (titer 1:11) og Der inkuberes i mørke i 10 minutter ved 4 ° C.
  3. Der tilsættes 1 ml frisk fremstillet lyse af røde blodlegemer opløsning (1x) og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur. Centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C og supernatanten aspireres. Resuspender cellerne i et passende volumen af ​​PBS / EDTA-buffer / 0,5% AB-serum.
  4. Tilføj propidiumiodid til en slutkoncentration på 1 ug / ml umiddelbart før analyse (1: 100 dilutipå 100 ug / ml). Udfør flowcytometri analyse for at vurdere renheden af ​​prøven.
  5. Brug følgende gating strategi for at beregne CD3 + T-celler i levedygtig leukocyt Gating strategi til bestemmelse af CD3 + T-celler er vist i positiv fraktion efter CCS berigelse proces. De angivne regioner (figur 3A og 3B, 1-6) er hierarkisk forbundet på følgende måde:
    1: Time gate → 2: Enkelte celler → 3: CD45 + celler → 4: Celler (vragrester undtaget) → 5: Levedygtige leukocytter → 6: Levedygtige CD3 + celler befolknings-
  6. Bestem frekvenserne af CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + og CD8 + IFN-γ + T-celler efter CCS berigningsprocessen (tabel 2).
  7. Brug gating-strategi til at bestemme frekvenserne af CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + og CD8 + IFN-γ + T-celler er vist nedenfor feller en original og beriget (fanget) positiv fraktion efter CCS-processen. De angivne regioner er hierarkisk forbundne og navngivet som følger:
    1: Time gate → 2: Enkelte celler → 3: CD45 + celler → 4: Celler (vragrester undtaget) → 5: Levedygtige Leukocytter → 6: Levedygtige CD3 + celler → 7: CD4 + celler → 7a: CD4 + IFN-γ + celler (boks) → 8: CD8 + celler → 8a: CD8 + IFN-y + -celler (kassen)

BEMÆRK: De første 6 angivne områder af hierarkiet links er de samme som figur 3, (1-6) og sidste 2 regioner er vist i figur 4 (6-8a).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne undersøgelse blev en automatiseret celle berigelse CCS System anvendes til automatiseret produktion af CMV pp65-specifikke T-celler. CMV-specifikke T-celler blev beriget fra tre aferese celleprodukter. Steady-state aferese produkt blev høstet i løbet af 2 timer fra en CMV-seropositive donor og genererede 10 10 samlede nukleare celler (TNC). 10 9 TNC blev derefter aktiveret med CMV pp65-afledte peptider (60 nmol) i 4 timer og IFN-γ-udskillende T-celler blev isoleret under anvendelse af CCS på den automatiserede celle berigelse enhed. En operatør var nødvendig ved begyndelsen af ​​eksperimentet til at indlæse alle reagenser og slangesæt. Opsætning af systemet fra den oprindelige udpakning til at starte indretningen tog ca. 60 til 120 min. Bemærk, at maskinen kan derefter programmeres til at starte efter reagenserne og slangesæt er indlæst hvorved maskinen køre uden opsyn (såsom natten over). Operatøren var nødvendig igen efter 15 timer til at udføre karakterisering afslutprodukterne for celle renhed og levedygtighed. Efter berigelse cellesupernatanten blev screenet for mycoplasma og endotoxin tilstedeværelse. Efter validering, kan de forarbejdede celler infunderes direkte i patienten, eller kryopræserveret til senere ansøgninger.

Celletællinger blev bestemt efter celletælling standardpraksis ved hjælp af formlen i tabel 2. Hver type celletal blev gentaget tre gange, og resultaterne blev udtrykt som middelværdier samlede celletal med standardafvigelse (SD). Rapporter blev derefter analyseret under anvendelse af celle analysator anbefalede software. Gating at bestemme levedygtige leukocytter og lymfocytter er vist i figur 2. Data for celletal er præsenteret i tabel 3. Gating-strategi anvendt til at bestemme IFN-y + T-celler er vist i figur 3 og 4. Før tilsætning, det Cellernes levedygtighed var rutinemæssigt> 95%. Efter enrichment, levedygtigheden af ​​celler blev <50%. Den absolutte optælling af IFN-γ + T-celler blev vurderet før og efter berigningsprocessen. Det samlede antal IFN-y + T-celler før tilsætning var 1,14 x 10 6 ± 0,35 x 10 6 som stammer fra 10 9 starter TNC, og efter tilsætning var 3,09 x 10 5 ± 1.70 x 10 5 IFN-y + T-celler. Der var 0,16 ± 0,18% IFN-γ + CD4 + T celler til stede forud for forarbejdning og dette steg til 47,5 ± 34,7% efter berigelse. Procentdelen af CD8 + IFN-γ + T-celler forud for opsamling renheden var 0,47 ± 0,1%, og steg til 90,3 ± 1,7% efter berigelse (tabel 3 og 4). Prøve opsving i billedudsnittet (positive) fraktion var 32,9 ± 15,7% for CD4 + -T-celler og 31,8 ± 13,2% for CD8 + T-celler baseret på måling af IFN-y + T-celler i sta rting befolkning (tabel 4). Disse data indikerer, at både CD4 + og CD8 + CMV pp65-specifikke T-celler kan høstes automatisk på en måde, der er egnet til deres anvendelse på mennesker.

Figur 1
Figur 1. Berigelse af CMV-specifikke T-celler ved hjælp af CCS-system. (A) forarbejdningstrin Flere involveret i den første generation celle berigelse enhed håndteres af dygtige fagfolk. (B) De fleste af de procestrin, undtagen indledende slange setup, er automatiserede i anden generation celleberigelse anordning, som sparer 10 - 12 timer af operatørhåndtering tid i sammenligning med den første generation enheden. De berigede CMV-virus-specifikke T-celler er karakteriseret ved flowcytometri celle analysator. > Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Gating strategi, der anvendes til at bestemme levedygtige T-celler. Numrene 1 til 6 angiver den tilsvarende gating hierarki domæne i figuren. (1) Opsætning af tid gate, (2) Fjernelse dublet celler ved at plotte FSC-højde mod FSC-område (3) Identifikation af CD45 + celler, (4) Fjernelse celle debris (5) Valg af levedygtige leukocytter og (6) Levedygtige lymfocytter fra oprindelige befolkning ved propidiumiodidfarvning. Klik her for at se en større version af dette tal.

belastning / 52808 / 52808fig3.jpg "/>
Figur 3. gating strategi, der anvendes til at bestemme CD3 + T-celler. Flowcytometri blot-analyse af CD3 + T-celler før (3A) og efter (3B) celleberigelse vises her. Det er afgørende at bestemme, hvor mange CMV-specifikt peptid aktiverede T-celler er til stede i prøverne før og efter berigningsprocessen. I denne figur, tallene 1 til 6 angiver den tilsvarende cellepopulation enten efter størrelse eller farvet med et specifikt antistof. (1) Etablering tid-gate, (2) Fjernelse dublet celler, (3) Valg CD45 + celler, (4) Fjernelse af cellerester (5) Valg af levedygtige leukocytter og (6) levedygtig CD3 + lymfocytter. Propidiumiodidfarvning blev udført for at fjerne døde celler./52808fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. gating-strategi anvendt til at bestemme renheden af IFN-γ + T-celler. Aktiveret CMV-specifikke T-celler er afgørende for at kontrollere CMV-infektion, så IFN-γ + ekspression på T-celler blev anvendt til gating. IFN-y + T-celler blandt CD4 + og CD8 + undergrupper (A) før berigelse og (B) efter berigelse. (7/8) Procent af CD4 + T-celler og CD8 + -T-celler er vist i A og B (7a. ) Procent af CD4 + IFN-y + T-celler er vist i firkantede boks (a) inden for gating området og tilsvarende for C D8 + IFN-γ + T-celler i (8a). "T" betegner% af cellerne i den samlede befolkning og "#" repræsenterer% af celler i gated population. Propidiumiodidfarvning blev udført for at gate-out døde celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1
Tabel 1. Mængden af de fraktioner, der bruges til cellefarvning strategi.

Tabel 2
Tabel 2. formler anvendes til beregning af CD4 + IFN-γ + T-celler efter berigelse proces. Beregning af CD8 + IFN-γ + T-celler udføres på samme måde.

ove_content "fo: holde-together.within-side =" altid "> Tabel 3
Klik her for at se en større version af denne tabel.
Tabel 3. Samlet celletal i T-celle-undergrupper før og efter berigelse. Prøve # 1 resultater Her vises.

Tabel 4
Tabel 4. Renhed og genvinding af IFN-γ + T-celle før og efter berigningsprocessen af prøve # 1.

Tabel 5
Tabel 5. cellesortering strategier, der anvendes i isoleringen af klinisk kvalitet CMV-antigen-specifikke T-celler. 5

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Adoptiv T-celle terapi har vist sig som en farbar vej til at behandle B-celle cancerformer 4. Dets terapeutiske potentiale er afhængig infusion det ønskede antal target antigenspecifikke T-celler, der mangler replikativ senescens 2. Dette kan opnås ved at sortere en ren population af antigenspecifikke T-celler fra ekspanderede T-celler i overensstemmelse med gældende god fremstillingspraksis. To sortering procedurer er meget udbredt, nemlig fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) og magnetisk cellesortering (MACS) for at generere CMV antigenspecifikke T-celler, som vi har for nylig revideret 5. Fordelen ved at anvende én strategi over den anden er skitseret i tabel 5. MACS teknologi giver den højeste celleberigelse renhed i en billigere og hurtigere måde i forhold til FACS-teknologi. Derudover brugen af ​​engangs kolonner og reagenser til celleberigelse fuldstændigt hindrer prøve til prøveforurening gør detlettere at anvende i kliniske indstillinger. Den halvautomatisk celleberigelse enhed er arbejdskrævende og tidskrævende, så udviklingen af ​​automatiserede celle berigelse enhed var nødvendigt at fodre kliniske efterspørgsel.

Den automatiserede celle berigelse CCS enhed er et alsidigt instrument til isolering af klinisk kvalitet celler, såsom hæmatopoietiske stamceller, somatiske stamceller, samt T-celler til adoptiv overførsel. Denne automatiserede enhed integrerer celle behandling, herunder fraktionering af udgangsmateriale, celle vask, celleseparering, cellekultur, og slutproduktet dannelse i et engangsbrug GMP-kompatible engangs enhed. Det lukkede system reducerer ren-rum krav og minimerer operatør involvering for at opretholde GMP faciliteter. Automatisering reducerer den tid, der kræves for en operatør at være til stede og dermed mindske omkostningerne forbundet med disse laboratorie procedurer.

For at validere den automatiserede celle berigelse enhed, sammenlignetmed halvautomatisk celleberigelse enhed, isolerede vi CMV-specifikke T-celler efter inkubation CMV pp65-afledte peptider med en afereseprodukt. GMP kvalitet CMV pp65-afledt peptid cocktail (f.eks PepTivator) er et peptid pulje, der hovedsageligt består af 15 mer-peptider med 11 aminosyrer overlapper hinanden, dækker den komplette sekvens af pp65-proteinet af human cytomegalovirus. Prøve udvindingsudbytte var ~ 0,3 x 10 6 CD3 + IFN-y + T-celler fra 10 9 TNC. Kliniske undersøgelser har vist, at infusion af et par tusinde CMV-specifikke T-celler som profylaktisk behandling for patienter (~ 360 til 4.000 celler / kg legemsvægt) undergår HSCT resulterede i beskyttelse mod CMV. For eksempel, med henblik på at behandle CMV i kliniske forsøg ved hjælp af denne teknologi, en 70 kg voksen og en 30 kg barn tilsyneladende kræver kun 0,26 - 3,0 x 10 5 og 1 x 10 4 - 1.2 x 10 5 celler af henholdsvis virus- specifikke T-celler 12-15 et al. 13. Et højere antal levedygtige celler vil også være acceptabelt, da dette ville være forbundet med tilstrækkeligt materiale til forskellige infusioner. Men mere levedygtige celler generelt betyder, også flere andre end T-celler (B, NK, osv) celler. Vores data viser, at CMV-specifikke T-celler genereret på automatiserede celle berigelse systemet resulterede i klinisk tiltalende antal CMV-specifikke T-celler, kan derefter infunderes efter allogen HSCT.

CMV-infektion kan være et stort problem efter HSCT resulterer i både øget morbiditet og mortalitet. Desuden er CMV-infektion er forbundet med øgede omkostninger, på trods af nylige fremskridt i tidlig diagnose og tidlig behandling med antivirale lægemidler 16. Den nuværende behandling med ganciclovir og foscarnet kan føre til toksicitet i medicinsk-skrøbelige modtagere af HSCT.Den add-back af donor-afledt CMV-specifikke T-celler har vist sig at forebygge og behandle opportunistiske infektioner i modtagere af allogen HSCT 9. Denne tilgang til adoptiv immunterapi er også blevet anvendt til at genoprette immunitet over for andre patogener, såsom Epstein-Barr virus (EBV), adenovirus 8 og Aspergillus 3 ved at inkubere mononukleære celler (MNC) med respektive antigen afledt af klinisk kvalitet peptid cocktail reagenser ( Materialer og udstyr bord). For nylig har forskere sikkert infunderes tredjeparts patogen-specifikke T-celler, der matcher med mindst et HLA allel i modtageren præsentere immundominante peptid 17. Den automatiserede celle berigelse CCS systemet kan også anvendes til at generere tredjeparts-T-celler til off-the-shelf applikationer, der vil være nyttige, når donoren er CMV-seronegative eller utilgængelig, såsom tilfældet med donorer til allogen navlestrengsblod transplantatipå.

Sammenfattende vi vise anvendeligheden af ​​en automatiseret celle berigelse enhed til at generere CMV-specifikke T-celler baseret på automatisering af CCS. Vi mener, at denne enhed har potentiale til at sænke tærsklen for kliniske hold til infusion af patogen-specifikke, samt tumorspecifikke T-celler, i immunkompromitterede patienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Både MD Anderson Cancer Center og Dr. Cooper have en økonomisk interesse i ZIOPHARM Oncology, Inc., og Intrexon Corporation. Den 7. maj 2015 blev Dr. Cooper udnævnt til Chief Executive Officer hos ZIOPHARM Oncology. Dr. Cooper er nu gæsteforsker ved MD Anderson. Dr. Cooper grundlagde og ejer InCellerate, Inc. Han har patenter med SANGAMO BioSciences med kunstige nukleaser. Han rådfører sig med Targazyme, Inc. (tidligere amerikanske Stamceller, Inc.), GE Healthcare, Ferring Pharmaceuticals, Fate Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals og Bristol-Myers Squibb. Han er på den videnskabelige rådgivende organ for Cellectis. Han modtager honorarer fra Miltenyi Biotec.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag Miltenyi Biotec GmbH 700-29
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 Miltenyi Biotec GmbH 130-097-182
5 L waste bag Miltenyi Biotec GmbH 110-004-067
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) Miltenyi Biotec GmbH 279-01
Albumin (Human) 25%  Grifols 58516-5216-2
Luer/Spike Interconnector Miltenyi Biotec GmbH 130-018-701
0.9 % NaCl Solution (1 L) Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65 Miltenyi Biotec GmbH 170-076-109
Water for injections Hospira, inc, Lake Forest, IL NDC-0409-4887-10
MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm  Millipore SLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L bag Miltenyi Biotec GmbH 170-076-306
Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) Miltenyi Biotec GmbH 130-018-301
CryoMACS Freezing Bag 50 Miltenyi Biotec GmbH 200-074-400
60 ml Syringes, sterile BD, Laagstraat, Temse, Belgium 309653
CMV sero positive apheresis product Key Biologics, LLC, Memphis
Flow Cytometry Materials Manufacturer Catalog number
AB Serum, GemCell Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA 100-512
CD3-FITC Miltenyi Biotec GmbH 130-080-401
CD4-APC Miltenyi Biotec GmbH 130-098-033
CD8-APC-Vio770 Miltenyi Biotec GmbH 130-098-065
CD14-PerCP Miltenyi Biotec GmbH 130-098-072
CD20-PerCP Miltenyi Biotec GmbH 130-098-077
CD45-VioBlue Miltenyi Biotec GmbH 130-098-136
aIFN-γ-PE, human Miltenyi Biotec GmbH 130-097-940
CD3-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-091-374
Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) Miltenyi Biotec GmbH 130-093-233
Equipment Manufacturer Catalog Number
CliniMACS Prodigy Device  Miltenyi Biotec GmbH 200-075-301
Software V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec GmbH 130-096-343
Software 2.4
Centrifuge 5415R  Eppendorf AG 22331
Cellometer K2 Nexelom Bioscience, Lawrence, MA LB-001-0016
Sterile tubing welder SCDIIB Terumo Medical Corp., Elkton, MA 7811

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
  2. Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
  3. Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
  4. Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
  5. Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), Available from: http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/ 55-59 (2014).
  6. Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
  7. Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
  8. Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
  9. Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
  10. Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
  11. Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
  12. Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
  13. Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
  14. Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
  15. Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
  16. Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
  17. Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).

Tags

Immunologi Cytokine-capture-system (CCS) CMV-specifikke T-celler pp65 IFN-gamma-secernerende T-celler anti-viral immunterapi bioforarbejdning automatiseret celle berigelse enhed magnetisk cellesortering teknologi
Automatiseret Cell Berigelse af cytomegalovirus-specifikke T-celler til kliniske applikationer ved hjælp af Cytokin-capture system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumaresan, P., Figliola, M., Moyes,More

Kumaresan, P., Figliola, M., Moyes, J. S., Huls, M. H., Tewari, P., Shpall, E. J., Champlin, R., Cooper, L. J. N. Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System. J. Vis. Exp. (104), e52808, doi:10.3791/52808 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter