Protocol
1. Fabricação de um molde de mestre para a focagem hidrodinâmica dispositivo micro (DMPB) através de fotolitografia
- Projetar uma fotomáscara para o DMPB (Figura 1a), utilizando software assistida por computador (CAD) de acordo com o protocolo do fabricante.
- Lavar uma bolacha 4 'silício com acetona, álcool isopropílico (IPA), e água desionizada (DI) para remover o pó orgânico e inorgânico a partir da bolacha.
- Limpar a bolacha de silício com O2 no plasma a 100 W de potência durante 5 min para aumentar a resistência de ligação entre a bolacha e SU-8.
- Spin-revestimento de 4 ml do fotorresistente negativo, SU-8 2150, sobre a bolacha a 3.000 rpm durante 30 segundos para se conseguir uma espessura de 150 um (B1 na Figura 1b).
- Coloque a pastilha revestida SU-8 numa placa de aquecimento durante 5 min a 65 ° C, ajustar a temperatura a 95 ° C, e, em seguida, deixar a bolacha sobre a placa de aquecimento durante 30 min a cozer macio.
- Coloque oconcebido fotomáscara sobre a bolacha e expor à luz UV (260 mJ cm -2, 26 seg para 10 mW cm -2) em um alinhador de máscara (B2 na Figura 1b).
- Realizar pós-exposição cozer numa placa de aquecimento (65 ° C durante 5 minutos e depois 95 ° C durante 12 min).
- Desenvolver o wafer por imersão num banho de revelador SU-8 durante 10 min, e, em seguida, transferi-la para revelador novo durante 5 segundos para se obter uma superfície limpa.
- Lavar a bolacha durante 20 segundos com água desionizada e secá-lo por 10 s com gás N2 (B3 na Figura 1b). Use o wafer fabricado como um molde mestre para polidimetilsiloxano (PDMS) fundição na Seção 2.
2. Fabricação do DMPB através Fundição PDMS
- Use o wafer padronizada obtida na Seção 1 como o molde mestre para fundição PDMS.
- Misturar o PDMS pré-polímero e um agente de cura de forma homogénea a uma proporção em peso de 10: 1; por exemplo, utilizar um g de agente de cura para 10 g de PDMS pré-polímerer.
- Verter o PDMS pré-polímero no interior do molde mestre e desgaseificar-lo durante 1 hora numa câmara de vácuo (B4 na Figura 1b).
- Coloque o molde mestre com o pré-polímero de PDMS em uma estufa a 65 ° C durante 3 h.
- Cortar o PDMS curados para o tamanho de um único chip, utilizando um bisturi afiado. Retire cuidadosamente a réplica PDMS curado do molde mestre com a mão.
- Repita os passos 2.2 a 2.5 para obter uma réplica idêntica PDMS.
- Perfurar orifícios de entrada e saída em uma das réplicas que utilizam um furo-perfurador com um diâmetro ligeiramente menor que o diâmetro exterior da tubagem de ligação.
- Aplicar tratamento com plasma de ar para a área de ligação de cada réplica usando um tratador de corona. 34
Cuidado: Use o tratador corona em uma área com boa ventilação para evitar a acumulação de ozono. - Queda de 5 mL de metanol para as áreas tratadas com plasma de ar. Finamente alinhar dois PDMS réplicas idênticas para fabricar o DMPB pela manipu lado mento, e verificar o alinhamento através de um microscópio (b5 na Figura 1b).
Nota: As réplicas tratados com plasma PDMS aéreos são bastante pegajoso e difícil de manipular. Assim, 5 mL de metanol é adicionado à superfície tratada por plasma a ar para funcionar como um lubrificante. - Coloque a DMPB num forno regulado para 65 ° C durante a noite para reforçar a ligação entre duas réplicas de PDMS (B6 na Figura 1b). Bond dois PDMS réplicas idênticas para aumentar a altura do microcanal do DMPB e evitar o entupimento das microgotículas no canal microfluídico durante a operação.
Figura 1: Visão Geral do Procedimento DMPB Fabrication (a) Projeto parâmetros da fotomáscara para o DMPB.. (B) Ilustração do processo de fabricação para o DMPB.ftp_upload / 52813 / 52813fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Preparação de NIPAAm-ricos (N-rico) e NIPAAm-pobres (N-pobres) Fases por separação de fases de Supersaturated NIPAAm
- Dissolver monómero NIPAAm em água desionizada a razão de W / W de 1: 1 utilizando um misturador de vórtice; por exemplo, dissolver-se 10 g de NIPAAm em 10 ml de água Dl (primeira imagem da Figura 2a).
Observação: Uma vez que o monómero NIPAAm está totalmente dissolvidos à temperatura ambiente, a solução é mais turvo (segunda imagem da Figura 2a). Este fenómeno é o primeiro sinal de que a separação de fases induzida pela solubilidade do monómero NIPAAm supersaturada ocorreu com sucesso. - Permitir que a solução de monómero a descansar numa posição vertical à temperatura ambiente durante pelo menos 15 min. A fase superior é a fase de N-rico, e a fase mais densa de fundo é a fase de N-pobres (terceira imagem da Figura 2a). As densidades de thfases e N-rico e N-pobres são 0,93 ± 0,01 e 0,99 ± 0,01 g cm -3, respectivamente 15.
- Quando a interface de separação das duas fases se torna claro, extrair cuidadosamente 2 mL de solução de monómero a partir das fases de n-ricas e N-pobres sem perturbar esta interface usando uma pipeta.
- Adicionar 4 mg de N, N '-methylenebisacrylamide (MBAAm) como um agente de reticulação e 4 mg de 4- (2-hidroxietoxi) fenil- (2-hidroxi-2-propil) cetona como um fotoiniciador para a extraída N-rico e N -pobres soluções de monômero para preparar fluidos do núcleo 1 e 2 para a baixa concentração de reticulação (2 mg ml -1) de amostra (B1 e B2 na Figura 2b).
- Repita a etapa anterior de 3,3 e adicionar 80 mg de MBAAm e 4 mg de 4- (2-hidroxietoxi) fenil- (2-hidroxi-2-propil) cetona, em cada uma solução de monómero de N-rico e pobre N-extraídos para preparar fluidos do núcleo 1 e 2 para a alta concentração de agente de reticulação (40 mg ml -1) amostra (B3 e B4 na Figure 2b).
- Dissolve-se 10% em peso de agente tensioactivo de óleo em óleo mineral para preparar o fluido de revestimento (b5 na Figura 2b).
Figura 2:. Preparação de Material para Janus Microhydrogel Síntese (a) Preparação de soluções de N-N-ricas e pobres de monómero por meio de separação de fases de NIPAAm supersaturada. (B) Os detalhes dos materiais e montagem experimental utilizada no protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Síntese de Janus Microhydrogels Usando o DMPB
- Carga 2 ml de fluidos do núcleo 1 e 2 (B1, B2 B3 ou B4 na figura 2b) e o fluido de revestimento (b5 na Figura 2b) separados em três seringas de 3 ml. Montar as seringas para as bombas de seringa e ligar cada seringa para a entrada de fluido apropriado do DMPB utilizando tubagem (figura (b). Use tubagem para ligar a saída de fluido do DMPB para um reservatório de recolha.
- Definir as bombas de seringa e infundir fluidos do núcleo 1 e 2 e o fluido de revestimento a velocidades de fluxo de 2, 2, e 10 ul min -1, respectivamente.
- (Opcional) Ajustar a velocidade de fluxo de fluidos do núcleo 1 e 2 para ajustar os rácios de volume relativo de cada lado da microgotícula Janus.
- Posicionar a fonte de luz UV na perpendicular de cerca de 1 cm de distância do reservatório de recolha. Ligar a fonte de luz UV e monitorizar visualmente a produção contínua de microhydrogels Janus.
Cuidado: Use proteção UV-óculos de proteção quando o monitoramento da produção microhydrogel. - Recolher os microhydrogels Janus fabricadas em um tubo cônico e lavá-los usando IPA. Em seguida, centrifugar o tubo cônico (780 g por 5 min) para liquidar amicrohydrogels.
- Repita Passo 4.6 várias vezes para remover o óleo mineral em torno das microhydrogels Janus completamente.
- Repita Passo 4.6, mas o uso de água DI, com um agente tensioactivo água de 0,005% (v / v) em vez de IPA para remover o restante IPA em torno dos microhydrogels Janus.
- Armazenar microhydrogels Janus completamente lavada num frasco de 10 ml contendo água Dl.
5. Análise da anisotrópica Thermo-responsividade de Janus Microhydrogels
- Usar uma pipeta para colocar microhydrogels Janus sintetizados a partir da Secção 4 numa placa de 24 poços. Permitir que as microhydrogels em repouso durante 15 segundos até uma monocamada é formada na superfície do fundo do poço.
- Obter uma imagem do microhydrogel Janus a 24 ° C usando um microscópio óptico na posição vertical com uma lente objectiva 5X.
- Definir um módulo termoeléctrico, sob a placa e assim controlar a tensão de este módulo para aumentar a temperatura da solução contendo Janus microhidrogéis a 32 ° C.
- Obter uma imagem do microhydrogel Janus a 32 ° C, mais uma vez usando um microscópio óptico vertical com uma lente objetiva de 5X.
- Repita os passos 5,2-5,4 24 vezes, tendo o cuidado de escolher um microhydrogel Janus diferente para análise estatística.
- A partir das 25 imagens de diferentes microhydrogels Janus, de 24 e 32 ° C, medir o raio das partes PN-ricas e pobres-PN dos microhydrogels Janus usando software de análise de imagem de acordo com as instruções do fabricante.
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Representative Results
A Figura 3a apresenta um esquema da montagem experimental utilizada para sintetizar microhydrogels Janus através do DMPB. As fases de n-ricas e pobres N-precisamente foram injectados no DMPB como fluidos do núcleo 1 e 2 e, em seguida, fundiram-se e divididos em microgotículas Janus no orifício pelo fluido de revestimento de óleo mineral por causa da instabilidade Rayleigh capilar. Consequentemente, microgotículas Janus compostas por fases de N-N-ricas e pobres foram gerados com sucesso, como mostrado na Figura 3b. O diâmetro das microgotículas era 190 uM com coeficiente de variação (CV) de menos do que 2%. A morfologia interna claramente compartimentado das microgotas Janus foi observada desde ambas as fases são separadas de forma estável. Deve notar-se que cada fase é imiscível na outra e de difusão entre as fases é quase desprezável. A proporção em volume das fases de n-ricas e pobres-N dentro de um microgotículas era Controlled, alterando a taxa de fluxo de cada solução de monómero por meio da bomba de seringa, como mostrado na Figura 3c. O fotoiniciador adicionado nas soluções de N-N-ricas e pobres de monómero foi, em seguida, desencadeada por exposição a radiação UV-luz, induzindo desse modo a polimerização das fases de n-ricas e N-pobres para PN-rico e PN-pobre, respectivamente.
Figura 3: Geração de microgotículas Janus usando o DMPB (a) Diagrama esquemático do DMPB para gerar microgotículas Janus.. (B) micrografia óptica das microgotículas Janus compostas por fases de N-rico e N-pobre. Microgotas (c) Janus obtidos com diferentes proporções de volume das fases N-ricos e N-pobres (1: 3, 1: 1, 3: 1). Por favor clique aqui para ver uma maiorversão desta figura.
A Figura 4 representa o comportamento anisotrópico térmico de resposta dos microhydrogels causadas por diferenças de concentração de monómero NIPAAm entre as partes PN-ricas e PN-pobres do microhydrogel Janus. Microhydrogels Janus com diferentes concentrações de agente reticulante de 2 e 40 mg ml-1 foram fabricados para examinar o efeito da concentração de agente de reticulação sobre o comportamento de resposta térmica dos hidrogeles resultantes. Como mostrado na Figura 4, o aumento da concentração de agente de reticulação resultou em diminuições na variação de volume reversível das microhydrogels acima e abaixo da TCIS.
Figura 4: Resposta temperatura do Microhydrogels Janus mudanças de volume anisotrópicos nas microhydrogels Janus em resposta a.variação de temperatura foram induzidas por diferenças na concentração de monômero NIPAAm entre as partes PN-ricos e PN-pobres. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 5a mostra diagramas esquemáticos e micrografias ópticas das Janus microgotículas / microhydrogels em resposta a alterações ambientais e de temperatura: 24 ° C em óleo, 24 ° C, em água, e 32 ° C em água. Para quantificar termo-responsividade, medimos o raio das Janus microgotículas / microhydrogels, conforme mostrado na Figura 5b. A barra de erro na Figura 5b representa o desvio padrão do raio medido em 25 microhydrogels Janus. O raio de cada parte dos microhydrogels Janus foi determinada a partir das imagens captadas usando software de análise de imagem. No estado monômero gota(A1 na Figura 5A e Figura 5b), o raio das fases de n-ricas e pobres-N era quase idêntico. Observou-se uma ligeira diferença de raio entre as partes PN-ricas e PN-pobres dos microhydrogels Janus após polimerização (A2 na Figura 5A e Figura b) devido à menor concentração de monómero NIPAAm na fase N-baixa comparado com os do fase rica em N. Ambas as partes PN-ricas e pobres-PN dos microhydrogels Janus foram totalmente inchado em água desionizada à temperatura ambiente. Na fase de inchaço, o inchaço da parte PN-rico era maior do que a da parte PN-pobre; consequentemente, snow-man em forma microhydrogels Janus foram obtidos (a3 na Figura 5a e Figura b). Curiosamente, o raio das microhydrogels pós-encolhimento a 32 ° C foi semelhante ao raio das microgotículas gerados no DMPB (A4 na Figura 5a e a Figura 5b).
Figura 5:. Microhydrogels Janus com anisotrópica Thermo-responsividade (a) diagramas esquemáticos e micrografias ópticas de microgotas Janus / microhydrogels (Barras de escala são 100 mm). (B) alteração do raio das Janus microgotas / microhydrogels em resposta às alterações ambientais e de temperatura: 24 ° C em óleo, 24 ° C em água, e 32 ° C em água. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A figura 6a mostra as propriedades de dissolução das soluções de N-N-ricas e pobres monoméricas. corantes solúveis em gordura (óleo vermelho O e óleo azul N) e corante solúvel em água (corantes alimentares amarelo e verde) preferem fortemente a dissolver-se na N-rich e soluções de monómeros N-pobres, respectivamente. Com base nestas características de dissolução, microgotículas de monómeros que contêm NIPAAm Janus gordura- e corantes solúveis em água sem inter-mistura foram gerados utilizando o protocolo proposto. O óleo vermelho e corante alimentar verde foram respectivamente seleccionados como materiais de organof e hidrofílicos representativos, como se mostra na Figura 6b. Após a polimerização UV, microhydrogels Janus contendo ambos os corantes foram sintetizados com sucesso, mostrado na Figura 6c. Estes resultados revelam que o microhydrogel Janus poderia ser aplicada como veículos hidrofílicos / organof dupla de material.
Figura 6: Microhydrogels Janus com Organophilic / hidrofílico Carregando Capability (a) propriedades de dissolução de soluções N-ricos e pobres N-monómeros.. corantes engorda e solúveis em água fortemente PREFERREd a dissolver-se nas soluções de N-N-ricas e pobres monoméricas, respectivamente. (B) A geração de Janus microgotículas contendo corantes da FAT e solúveis em água sem inter-mistura. (C) microhydrogels Polymerized Janus contendo corantes da FAT e solúveis em água. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Dois materiais de base imiscíveis são geralmente utilizados para sintetizar os microhydrogels Janus. Até recentemente, microhydrogels Janus constituídos do mesmo material de base foram raramente reportados e os microhydrogels Janus relatados não tinha uma morfologia interna clara devido à perturbação causada pela miscibilidade dos materiais componentes. 35, 36 Neste protocolo, demonstramos um método para sintetizar microhydrogels Janus compostos inteiramente de material de base única, PNIPAAm, com uma estrutura compartimentada claramente.
Como um passo crítico para sintetizar os microhydrogels Janus, introduzimos o fenómeno de separação de fases da solução supersaturada monômero NIPAAm. As soluções de fase N-ricos e N-pobres coletados a partir do fenômeno da separação de fases são imiscíveis e a perturbação entre a fase de N-rico e N-pobres é quase insignificante. Este imiscibilidade das fases N-ricos e N-pobres em microgotículas Janus foi maintained na DMPB ea morfologia dos microhydrogels Janus foi preservada mesmo após polimerização.
Aplicou-se o DMPB como um método para sintetizar os microhydrogels Janus porque o protocolo permite a produção fácil de microhydrogels Janus monodispersas com uma taxa de 10 5 microhydrogels Janus por hora. O DMPB recém-projetado neste trabalho foi devidamente fabricados para produzir microhydrogels Janus com tamanhos dentro da ordem de cem micrómetros; futuros desenhos de DMPB pode ser capaz de produzir microhydrogels Janus de um tamanho mais pequeno.
Um estudo mais aprofundado dos microhydrogels Janus revelou duas características distintas originadas de diferentes concentrações NIPAAm nas fases N-ricos e N-pobres. Em primeiro lugar, os microhydrogels Janus compostas de diferentes concentrações NIPAAm exibiu anisotrópicas comportamentos de resposta térmica, em resposta à variação de temperatura. O monómero reticulante à relação é bem conhecida a directly influenciar o grau de inchamento de um hidrogel 37 A quantidade de moléculas de NIPAAm na fase N-rico é geralmente muito maior do que na fase N-pobre.; Assim, o monómero e o agente de reticulação na proporção de fase rica em N é maior do que na fase N-pobre quando uma concentração idêntica de agente de reticulação é utilizado em ambas as fases. Consequentemente, a parte rica em PN do hidrogel Janus passa por uma mudança de volume maior em comparação com a parte PN-pobres em resposta à mudança de temperatura. Em segundo lugar, os microhydrogels Janus exibiram capacidade de carga de argilas / hidrofílica sem cross-mistura. O corante solúvel em gordura foi bem dissolvido na solução de monómero de N-rico enquanto que o corante solúvel em água foi bem dissolvido na solução de monómero de N-pobre. As propriedades de dissolução contrastantes das soluções de N-N-ricas e pobres monoméricas são derivados a partir de diferenças na disponibilidade das moléculas de água livre deixado ao longo depois de interagir com moléculas de NIPAAm em cada solução de monómero. Porque possESSES um nível comparativamente maior número de moléculas de água livre do que a restante solução de monómero de N-rico, a solução de monómero de N-pobre pode facilmente dissolver moléculas polares hidrófilos no interior do corante solúvel em água. Em contraste, o corante solúvel em água exibiram fraca solubilidade na solução de monómero rico-N, que pode interagir somente com algumas moléculas de água livre. Por conseguinte, as soluções de N-N-ricas e pobres monoméricas mostraram resultados opostos quando misturado com corante solúvel em gordura. Os microhydrogels Janus sintetizados podem ser utilizados como transportadoras / materiais hidrofílicos organofilicas dupla com uma morfologia interna compartimentado sem cross-mistura.
aplicação futura
As características novas do microhydrogels Janus pode ser utilizada para desenvolver micropartículas funcionais e conseguir o encapsulamento a múltiplas drogas. Acreditamos que o protocolo de síntese para estes microhydrogels Janus baseado em separação de fases do NIPAAm supersaturada introduz um novo material plataforma com o potencial para a síntese avançado de microhydrogels Janus multi-funcionais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer | LG Siltron | 4", Test grade | Wafer for master mold fabrication |
| Acetone | Samchun Pure Chemical | A0097 | Cleaning silicon wafer |
| Isopropyl alcohol (IPA) | Daejung Chemicals & Metals | 5035-4404 | Cleaning silicon wafer |
| Water purification system | Merck Millipore | EMD Millipore RIOs Essential 5 | Prepering deionized water |
| O2 plasma machine | Femto Science | VITA-A | Cleaning silicon wafer |
| SU-8 2150 negative photoresist | MicroChem | Y111077 0500L1GL | Photoresist for master mold fabrication |
| Hot plate | Misung Scientific | HP330D, HP150D | Baking SU-8 |
| SU-8 developer | Microchem | Y020100 4000L1PE | Developing SU-8 |
| Mask aligner system for photolithograpy | Shinu Mst Co. | CA-6M | Photolithography |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 1064891 | PDMS casting |
| Laboratory Corona Treater | Electro-technic Products Inc. | Model BD-20AC | PDMS air plasma treatment |
| N-isopropylacrylamide (NIPAAm) | Sigma-Aldrich | 415324-50G | Monomer |
| N,N'-methylenebisacrylamide (MBAAm) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | Crosslinker of NIPAAm |
| 4-(2-hydroxyethoxy)phenyl-(2-hydroxy-2-propyl)ketone, Irgacure 2959 | BASF | 55047962 | Photoinitiator of NIPAAm |
| ABIL EM 90 | Evonik Industries | 201109 | Sufactant for oil |
| Vortex mixer | Scientific Industries Inc. | Vortex-Genie 2 | Mixing |
| Tygon tubing | Saint-Gobain | I.D. 1/32", O.D. 3/32", Wall 1/32" | Connecting tube between syringes and HFMD |
| UV light source | Hamamatsu | Spot light source LC8 | Polymerization from NIPAAm to PNIPAAm |
| Syringes, NORM-JECT (3 ml) | Henke-Sass Wolf GmbH | 22767 | Loading of materials |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS model 200 | Perfusion of materials |
| Tegitol Type NP-10 | Sigma-Aldrich | NP10-500ML | Surfactant for water |
| Oil red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dye for N-rich phase |
| Oil Blue N | Sigma-Aldrich | 391557-5G | Dye for N-rich phase |
| Yellow food dye | Edentown F&B | NA | Dye for N-poor phase |
| Green food dye | Edentown F&B | NA | Dye for N-poor phase |
| Power supply | Agilent | E3649A | Power source for thermoelectric module |
| Thermoelectric module | Peltier | FALC1-12710T125 | Temparature control |
| Centrifuge machine | Labogene | 1248R | Settling down microhydrogels |
| 24-well plate | SPL Life Sciences | 32024 | Reservoir for observation |
| Optical microscope | Nikon | ECLIPSE 80i | Optical observation |
| Image analysis software | IMT i-Solution Inc. | iSolutions DT | Measurement of radius |
References
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