Summary
Dominios de dedos de zinc son células permeable intrínseca y capaz de mediar la entrega de proteínas en una amplia gama de tipos de células de mamíferos. Aquí, se presenta un protocolo detallado paso a paso para la implementación de la tecnología zinc-finger para la entrega de proteínas intracelulares.
Introduction
Altamente estrategias de suministro de proteínas eficientes y versátiles son críticas para muchos la investigación básica y las aplicaciones terapéuticas. La entrega directa de proteínas purificadas en las células representa uno de los métodos más seguros y más fáciles para lograr esto. 1,2 diferencia de las estrategias que se basan en la expresión de genes a partir de ácidos nucleicos, 3-5 de administración de proteínas no plantea ningún riesgo de mutagénesis de inserción, es independiente de la maquinaria celular de la transcripción / traducción y permite un efecto inmediato. Sin embargo, la falta de métodos simples y generalizables para dotar a la actividad de penetración celular en proteínas confunde habitualmente su ingreso directo en las células. Los métodos actuales para facilitar la entrega intracelular de proteínas se basan en el uso de origen natural o diseñados 6-8 péptidos de penetración celular, 9-12 dominios de transducción de sobrealimentados, 13,14 nanopartículas y liposomas 15, 16 partículas similares a virus 17,18 19 Desafortunadamente, muchos de estos enfoques se ven obstaculizados por las bajas tasas de absorción celular, 20,21 pobre estabilidad, 22 inadvertida especificidad de tipo celular, 23 propiedades de escape bajo endosomales 24 y toxicidad. 25 Además, muchas proteínas tecnologías de transducción de reducir la bioactividad de las proteínas entregados. 14
Nuestro laboratorio previamente demostró que nucleasa dedo de zinc (ZFN) proteínas - restricción endonucleasas quimérico que consiste en una proteína programable Cys2 -Su 2 dedos de zinc de unión a ADN y el dominio de la escisión de la endonucleasa de restricción FokI 26-28 - son inherentemente por células permeable. 29 Esta actividad de penetración celular sorprendente ha demostrado ser una propiedad intrínseca del dominio dedo de zinc de diseño personalizado, una plataforma de unión a ADN que ha surgido como una poderosa herramienta para apuntado genoma eningeniería, 30-32 y considera que es el resultado de la constelación de seis residuos de carga positiva en la superficie de la proteína. De hecho, varias proteínas de unión al ADN, incluyendo c-Jun N-DEK y se han demostrado poseer una capacidad innata para atravesar las membranas celulares. 33 Más recientemente, nuestro laboratorio ampliado en estos resultados y demostró que la actividad de las células de penetración de zinc dedo (ZiF) dominios podrían ser aprovechados para la entrega de proteínas intracelulares. Fusión genética de cualquiera de los dominios ZIF de uno o dos dedos a la carga de proteína específica llevado a la absorción eficiencias que superan muchos sistemas de suministro de péptidos de penetración celular convencionales. 34 En particular, la entrega mediada por ZiF no comprometió la actividad enzimática de la carga fundida y facilitó altos niveles de entrega citosólica. En conjunto, estos resultados demuestran el potencial del dominio ZiF para facilitar la prestación eficiente y fácil de proteínas, y potencialmente más diversos tipos de macromoléculas, en las células.
Aquí, se presenta un protocolo detallado paso a paso sobre cómo implementar la tecnología ZiF para la entrega de proteínas en células de mamíferos. Anteriormente hemos construido un conjunto de uno, dos, tres, cuatro, cinco y seis dedo dominios ZIF que carecen de la capacidad de unirse al ADN, debido a la sustitución de cada uno de los residuos de unión a ADN-α helicoidal, pero son capaces de entregar proteínas en células 34 (Figura 1). Se describe la producción y la transducción de Emerald GFP (EmGFP) en células HeLa utilizando un dominio ZiF con dos dedos. Este protocolo es extensible a casi cualquier proteína capaz de la expresión soluble en Escherichia coli y casi cualquier tipo de célula de mamífero. Resultados esperados se proporcionan y también se discuten estrategias para maximizar el rendimiento de este sistema.
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Protocol
1. Clonación
- Obtener dominios ZIF con dos dedos de alanina-sustituido que se han clonado sub-en el sistema de vector de expresión pET-28 y están disponibles bajo petición (PET-2F-ZiF). 34
- Amplificar por PCR EmGFP del plásmido Esmeralda-pBAD con los cebadores 5 'XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; Xma sitio I en negrita) y 3 'Sac-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' ; Sac I sitio en negrita).
- Utilice 5 ng de ADN plantilla, 10 l de tampón 10x de la polimerasa, 1 unidades (U) de ADN Taq polimerasa, 0,2 mM de cada dNTP y 0,2 M de cada cebador en una solución de 100 l con el volumen restante compuestos de agua destilada / desionizada . Utilice las condiciones de ciclo: 95 ° C durante 5 minutos; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72 ° C durante 1 minuto; 72 ° C durante 10 min. Se purifica el producto de PCR por extracti gelen y determinar la concentración de ADN usando un espectrofotómetro de medición Abs 260 x 50 g / ml.
- Recopilación pET-2F-ZiF y el inserto que codifica EmGFP con las enzimas de restricción Xma I y Sac I en tampón recomendado durante 3 horas a 37 ° C utilizando 10 U de enzima por 1 g de ADN. Visualizar el ADN por electroforesis en gel de agarosa usando un colorante intercalante fluorescente, tal como bromuro de etidio.
- Se purifica el ADN digerido mediante el kit de extracción de gel y determinar la concentración de ADN mediante un espectrofotómetro de medición Abs 260 x 50 g / ml.
- Ligar el ADN que codifica EmGFP purificado en 50-100 ng de pET-2F-ZiF utilizando 1 U de T4 DNA ligasa durante al menos 1 h a TA. Para obtener los mejores resultados, realice la reacción de ligación utilizando un 6: 1 molar-inserción a vector.
- Descongelar 50 l de cualquier químicamente competentes XL-1 Azul de Escherichia coli células en hielo y mezclar suavemente con 10-20 ng de ligó pET-2F-ZiF-EmGFP.
- Mantenga en hielo durante 30 min. El choque térmico la mezcla a 42 ° C durante 90 seg y recuperar las células en 2 ml de caldo de Super óptima con represión catabólica (SOC) durante 1 hora a 37 ° C con agitación.
- Corre 100 l de la cultura de recuperación en un caldo lisogenia (LB) placa de agar con 50 g / ml de kanamicina y se incuba O / N a 37 ° C.
- El día siguiente, inocular 6 ml de caldo super (SB) o de cultivo LB que contiene 50 mg / ml de kanamicina con una colonia de la placa de agar LB y cultivo O / N a 37 ° C.
Nota: Colony PCR usando los cebadores 5 'XmaI-EmGFP y 3' SacI-EmGFP podría utilizarse para identificar los clones positivos antes de la miniprep. - Purificar pET-2F-ZiF-EmGFP por miniprep y confirmar mediante secuenciación de ADN plásmido utilizando el promotor T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').
2. Expresión y purificación
- Descongele 50 l de químicamente competente E. BL21 coli células en hielo y mezclar suavemente con 100 ng de pET-2F-ZiF-EmGFP plasmid. Transformar como se describe en los pasos 1.7 a 1.8.
- El día siguiente, inocular 10 ml de medio LB que contenía 50 mg / ml de kanamicina con una sola colonia y crecer O / N a 37 ° C con agitación.
- El día siguiente, diluir 10 ml de cultivo O / N en 1 L de medio LB suplementado con 50 g / ml de kanamicina, 0,2% de glucosa y 100 mM ZnCl2. Mantener el cultivo a 37 ° C con agitación hasta una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de 0,8 e inducir la expresión de la proteína con 2 mM isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Después de 6 horas de crecimiento a 37 ° C, las células de la cosecha por centrifugación a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C.
Nota: Las condiciones de inducción son altamente variables y dependen de la estabilidad de las proteínas que se expresa. Supervisar el OD 600 cada 30 minutos hasta una DO 600 de 0,8 se alcanza. - Resuspender el sedimento celular en 5 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM de MgCl 2, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) e imidazol 10 mM, pH 8,0). Lisar las células en hielo por ultrasonidos con la siguiente configuración: potencia del 50%, 4 minutos de tiempo de proceso con 5 segundos de encendido / apagado 10 segundos intervalos. Evite el sobrecalentamiento de la solución.
- Centrifugar el lisado de células a 25.000 xg durante 30 min a 4 ° C y transferir el sobrenadante a un tubo de recogida fresco. Para obtener los mejores resultados, realice todos los pasos siguientes a 4 ° C.
- Ejecute el sobrenadante a través de una columna pre-envasados con 1 ml de suspensión equilibrada Ni-NTA. Lavar la resina con 20 ml de tampón de lavado (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl2, DTT 1 mM, 1 mM de MgCl imidazol 2 y 30 mM, pH 8,0).
- Eluir la proteína con 5 ml de tampón de elución (50 mM Tris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl2, DTT 1 mM, 1 mM de MgCl 2, e imidazol 300 mM, pH 8,0).
- Intercambio de tampón la proteína se eluyó con tampón de almacenamiento (50 mMTris-HCl, NaCl 500 mM, 100 mM ZnCl2, DTT 1 mM, 1 mM de MgCl 2 y 10% de glicerol, pH 8,0) y concentrar la proteína a al menos 40 mM utilizando un concentrador de giro por centrifugación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Determinar la concentración de proteína por el ensayo de Bradford o BCA. Mezclar 2 l de proteínas purificadas con 2 l 2 × colorante de carga SDS-PAGE, hierven a 95 ° C durante 10 min y luego resolver el 4% -20% Tris-glicina SDS-PAGE para evaluar la pureza de proteína (Figura 2).
3. La proteína de almacenamiento
- Alícuota de la proteína concentrada, congelación de flash en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Para las proteínas de fusión EmGFP, cubrir el tubo con papel de aluminio para proteger la proteína de la luz.
- Evite la congelación y descongelación repetida de la solución de proteína. Nota: Las proteínas fusionadas-ZiF son estables en estas condiciones durante al menos 1 mes. O almacenamiento inadecuado mes> 4 puede conducirpara la precipitación de proteínas o photobleaching de EmGFP.
Transducción 4. Proteína
- Mantener las células HeLa en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene 10% (v / v) de suero fetal bovino (FBS) y 1% de antibiótico-antimicótico a 37 ° C en una atmósfera totalmente humidificada con 5% de CO 2.
Nota: las pasaron más de 30 veces no se recomiendan para la transducción de la proteína. - Pre-capa de una placa de 24 pocillos con 500 l de 50 mg / ml de poli-lisina durante 30 a 60 min a 25 ° C. Sembrar las células en una placa de 24 pocillos a una densidad de 2 × 10 5 células por pocillo. A las 24 h después de la siembra, o una vez que las células son entre 80% -90% de confluencia, retirar el medio de cada pocillo y se lava con 500 l de DMEM libre de suero pre-calentado (SFM).
- A cada pocillo, añadir 250 l de SFM que contiene 2 M de proteína ZiF-EmGFP y 100 mM ZnCl2. Se incuban las células a 37 ° C durante 1 hr. Nota: Los dominios ZIF entran en las células primarily través macropinocytosis, 34, que es un mecanismo dependiente de la energía. Por lo tanto, las células deben ser incubadas a 37 ° C para la internalización de proteínas eficiente.
- Retire el medio de las células y lavar tres veces con 500 l de calcio y de magnesio libre de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) suplementado con 0,5 mg / ml de heparina. Nota: La heparina es necesario para eliminar la proteína unida a la superficie que pudiera complicar los análisis.
- (Opcional) repetir el tratamiento hasta tres veces para la entrega mejorada.
- Aislar las células tratadas inmediatamente después de la heparina de lavado por digestión con 0,05% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 2 min. Vuelva a suspender las células desprendidas en 0,5 ml de DPBS suplementado con 1% de SFB.
- Medir la intensidad de fluorescencia de cada muestra por citometría de flujo 35 utilizando el canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Figura 3). Ajuste la dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) para colocar la población deinterés en la escala, asegurando que las poblaciones con diferentes propiedades se resuelven el uno del otro.
- Recoge 10.000 eventos en directo para cada muestra y analizar los datos mediante citometría de flujo análisis de datos de software. 36 Normalizar la fluorescencia de las células HeLa tratadas con ZiF-EmGFP a esas células tratadas sólo con SFM.
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Representative Results
Con dos dedos proteínas de fusión ZiF-EmGFP pueden expresarse en E. coli con> 95% de homogeneidad y altos rendimientos (> 25 mg / ml) (Figura 2). En general, de uno y dos dedos proteínas de fusión ZIF pueden ser producidos en cantidades casi idénticas a las de la proteína no modificada de tipo salvaje. Sin embargo, en algunos contextos, proteínas de fusión ZiF de cinco y seis dedos no son capaces de ser producidos en rendimientos suficientemente altos para aplicaciones posteriores.
La aplicación directa de dos dedos proteína ZiF-EmGFP sobre células HeLa durante 90 minutos a 37 ° C conduce a un aumento dependiente de la dosis en EmGFP fluorescencia (Figura 3A). Fundamentalmente, no se observa fluorescencia en ausencia del dominio ZiF. Hemos observado anteriormente que casi el 100% de las células son fluorescentes después del tratamiento con sólo 2 M de dos dedos proteína ZiF-EmGFP, y que las células HeLa tratadas con proteína de fusión ZiF son positivos para EmGFP fluorescencia a concentraciones de proteínas tan bajo como 0.25 mM (Figura 3B).
Figura 1. Estructura y secuencia de la proteína dedo de zinc. Estructura (Top) Crystal de un dominio único dedo de zinc (ZiF). Las cadenas laterales de la Cys conservados y sus residuos en coordinación con el Zn 2 + iones se muestran como palos (AP ID: 2I13). 37 (Abajo) Secuencia del dominio ZiF. Flechas y cilindros indican Β hojas y α-hélice estructuras secundarias, respectivamente. Los residuos de unión a ADN-α helicoidal que han sido sustituidos con alanina se resaltan de color rosa. Residuos cargados positivamente predichos para mediar la internalización celular se resaltan de color azul claro. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. SDS-PAGE de purificados de una, dos, tres y cuatro dedos proteínas de fusión ZiF-EmGFP. Proteínas de fusión ZiF-EmGFP se expresaron en E. coli y se purificó por resina de agarosa Ni-NTA. La proteína eluida se analizó la pureza mediante SDS-PAGE usando un 4% -20% Tris-Glicina gel. No se observó degradación o truncamientos de las proteínas de fusión ZiF-EmGFP significativo.
Figura 3. ZiF suministro mediado por la proteína en células HeLa. (A) la intensidad de fluorescencia de las células HeLa tratadas con cantidades crecientes de dos dedos proteína ZiF-EmGFP. Células HeLa tratadas con la proteína EmGFP solo se solapan por completo con las células no tratadas. (B) la intensidad de fluorescencia normalizada de células HeLa tratadas consecutivamente con 2 mM ocon dos dedos proteína ZiF-EmGFP f. La intensidad de fluorescencia se determinó por citometría de flujo.
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Discussion
Aquí, se presenta un protocolo paso a paso para la entrega de proteínas utilizando zinc-finger (ZiF) dominios de células permeable. El dominio ZiF no reduce la actividad enzimática de la carga fundida 34; permite la producción y purificación de proteínas en rendimientos casi idénticos a los observados con proteína no modificada; y puede transportar proteínas y enzimas en una amplia gama de tipos de células con eficiencias que superan los sistemas de dominio de transducción de proteína o péptido de penetración celular tradicionales. En conjunto, estos hallazgos indican el amplio potencial de dominios ZIF para mediar la entrega directa de proteínas en células para una amplia gama de aplicaciones.
Máximo de entrega de proteína se logró previamente usando sólo un dominio ZiF con dos dedos, a pesar del hecho de que se extendía matrices de dominios de tres y cuatro dedos ZIF llevar a una mayor carga positiva. Estos hallazgos indican que la entrada en la célula mediada ZiF podría estar influenciado por factores distintos de carga, incLuding estabilidad de la proteína o la rigidez conformacional. Administración de proteínas mediada por dominio ZiF también se encontró que era dependiente de la energía y por lo tanto requiere que todas las células tratadas con la proteína se incubaron a 37 ° C. A través del uso de inhibidores de moléculas pequeñas de diferentes vías endocítica, macropinocytosis, y en menor medida la caveolina-dependiente endocitosis, estaban decididos a ser las principales vías de entrada a la célula mediada ZiF. 34 Cabe destacar que, a diferencia de otros sistemas de transducción de proteínas, dominios ZIF son capaz de escapar de manera eficiente endosomas mediar altos niveles de prestación de citosólica de la carga macromolecular fusionada, lo que subraya el potencial de estos dominios para lograr la entrega de proteínas robusto.
En nuestra experiencia, la densidad de siembra de células es un paso crítico para lograr altos niveles de transducción de proteínas. Se recomienda el tratamiento de las células una vez que alcanzan el 80% y el 90% de confluencia y previamente observado que las células sembradas en> 95% de confluencia espectáculo sub-capacidad óptima transducción, mientras que las células sembradas a densidades bajas (<50%) son susceptibles a la toxicidad inducida por proteínas. Es importante destacar que, para los tipos de células con altas tendencias desprendimiento de placas de cultivo de células pre-revestidas con poli-lisina se recomiendan. Poli-lisina facilita la unión de las células a través de interacciones electrostáticas con componentes de la superficie celular cargados negativamente. Aunque los residuos de unión a ADN-α helicoidal de cada dominio ZiF se han eliminado para eliminar cualquier posibilidad de reconocimiento de ADN, la cisteína e histidina que se coordinan con el ion Zn 2+ para estabilizar el dominio veces ΒΒα ZiF permanecen intactos. Por lo tanto, se recomienda que cualquier tampón de almacenamiento se complementará con un mínimo de 100 M de ZnCl2 para mantener la integridad de la proteína.
Aunque el dominio ZiF se demostró anteriormente para administrar proteínas y enzimas en una variedad de tipos de células, la eficiencia de la entrega ZiF también podría ser dependiente de la tanto macromocarga lecular y la concentración de proteínas. Por ejemplo, las células tratadas con proteína de fusión luciferasa-ZiF de dos dedos se observaron para mostrar máximo de luminiscencia cuando son tratados con la proteína 0,5 M, con disminución de la actividad a concentraciones más altas, mientras que las células tratadas con dos dedos EmGFP exhibió un aumento dependiente de la dosis en la fluorescencia intensidad de hasta 8,0 proteína M, y sobre los tratamientos de proteína consecutivos. Por ello, recomendamos evaluar la capacidad de penetración celular de cada dominio único de fusión ZiF a través de una gama de concentraciones.
Por último, aunque todavía no se ha demostrado, anticipamos que la entrega de dominio ZiF es una plataforma muy flexible, capaz de ofrecer una amplia gama de macromoléculas en las células. Por ejemplo, puede ser posible tanto para el ADN y ARN para ser funcionalizados químicamente sobre la superficie del dominio ZiF través de un enlazador hidrolizable, o transfectadas transitoriamente en las células mediante la encapsulación de los dominios ZIF. Además, el efficirencia de la entrega de proteínas ZiF podría mejorarse aún más por los esfuerzos de diseño racional centrado en la optimización de carga superficial.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (DP1CA174426 a Carlos F. Barbas) y la Universidad ShanghaiTech, Shanghai, China (a JL). Se generaron gráficos moleculares utilizando PyMOL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
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