Summary
Zink-fingerdomäner är i sig själva cellpermeabel och förmåga att mediera protein leverans till ett brett spektrum av däggdjurscelltyper. Här är en detaljerad steg-för-steg-protokoll för att genomföra zinkfingerteknik för intracellulär proteinleverans presenteras.
Introduction
Högeffektiva och mångsidiga strategier proteinleverans är kritiska för många grundforskning och terapeutiska tillämpningar. Den direkt leverans av renade proteiner i celler representerar en av de säkraste och enklaste metoderna för att uppnå detta. 1,2 skillnad strategier som förlitar sig på genuttryck från nukleinsyror, inte utgör någon risk för insertionsmutationer 3-5 protein leverans, är oberoende av cellulär transkription / translation maskiner och möjliggör en omedelbar effekt. Men bristen på enkla och generaliserbara metoder för att förse cellpenetrerande aktivitet på proteiner confounds rutinmässigt deras direkta inträde i celler. Nuvarande metoder för att underlätta intracellulärt protein leverans är baserade på användning av naturligt förekommande 6-8 eller konstruerade cellpenetrerande peptider, 9-12 laddade transduktion domäner, 13,14 nanopartiklar 15 och liposomer, 16 virusliknande partiklar 17,18 19 Tyvärr har många av dessa metoder hämmas av låga cellulära upptag priser, 20,21 dålig stabilitet, 22 oavsiktlig celltyp specificitet, 23 låg endosomala utrymnings egenskaper 24 och toxicitet. 25 Dessutom har många protein transduktion tekniker att minska bioaktiviteten av de levererade proteiner. 14
Vårt laboratorium tidigare visats att zinkfinger nukleas (ZFN) proteiner - chimär restriktionsendonukleaserna bestående av en programmerbar Cys 2-His två zinkfinger DNA-bindande proteinet och klyvning domänen av Fokl restriktionsendonukleas 26-28 - är i sig cell- genomsläpplig. 29 Denna överraskande cellpenetrerande aktivitet visade sig vara en inneboende egenskap hos skräddarsydda zinkfingerdomän, en DNA-bindande plattform som har framträtt som ett kraftfullt verktyg för riktad genomet svEngineering, 30-32 och anses vara resultatet av konstellation av sex positivt laddade rester på proteinet ytan. I själva verket har flera DNA-bindande proteiner, inklusive c-Jun och N-DEK visats besitta en inneboende förmåga att korsa cellmembran. 33 Mer nyligen vårt laboratorium expanderade på dessa resultat och visade att den cellpenetrerande aktiviteten av zink finger (ZIF) domäner kan tas tillvara för intracellulär proteinleverans. Genetisk fusion av antingen en- eller två fingrar ZIF domäner till specifikt protein last ledde till upptag effektivitetsvinster som översteg många konventionella peptidleveranssystem cellpenetrerande. 34 Framför allt gjorde Zif-medierad leverans inte kompromissa aktiviteten av smält enzymatisk last och underlättas höga halter av cytosoliskt leverans. Tillsammans visar dessa resultat potential ZIF domän för att underlätta en effektiv och enkel leverans av proteiner, och potentiellt mer skiftande typer av makromolekyler, in i celler.
Här är en detaljerad steg-för-steg-protokoll om hur man genomför ZIF teknik för proteinleverans i däggdjursceller presenteras. Vi har tidigare konstruerat en svit av en-, två-, tre-, fyr-, fem- och sex-finger ZIF domäner som saknar förmågan att binda DNA, på grund av substitution av vardera av de α-helix DNA-bindande rester, men kan leverera proteiner i celler 34 (Figur 1). Produktionen och transduktion av Emerald GFP (EmGFP) till HeLa-celler med hjälp av en två fingrar ZIF-domänen beskrivs. Detta protokoll är töjbar till nästan alla protein som kan lösligt uttryck i Escherichia coli och nästan alla däggdjur celltyp. Förväntade resultat tillhandahålls och strategier för att maximera prestanda detta system diskuteras också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning
- Skaffa alanin-substituerade två fingrar ZIF domäner som har under klonade in i pET-28 expressionsvektorsystem och finns tillgängliga på begäran (PET-2F-ZIF). 34
- PCR amplifiera EmGFP från plasmiden Emerald-pBAD med primrama 5 'Xmal-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; Xmal-stället i fetstil) och 3 'Sacl-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' ; Sacl-stället i fetstil).
- Använd 5 ng av mall-DNA, 10 ^ il 10 x polymerasbuffert, 1 enheter (U) Taq DNA-polymeras, 0,2 mM av varje dNTP och 0,2 pM av varje primer i en 100 | il lösning med den återstående volymen består av destillerat / avjoniserat vatten . Använd cykelbetingelser: 95 ° C under 5 min; 30 cykler av 95 ° C under 30 sek, 55 ° C under 30 sekunder och 72 ° C under 1 min; 72 ° C under 10 min. Rena PCR-produkten genom gel extractipå och bestämma DNA-koncentrationen med användning av en spektrofotometer som mäter Abs 260 x 50 ^ g / ml.
- Digest pET-2F-Zif och insatsen kodande EmGFP med restriktionsenzymerna Xmal och SacI i rekommenderad buffert under 3 h vid 37 ° C med användning av 10 U av enzymet per 1 pg DNA. Visualisera DNA genom agarosgelelektrofores med användning av ett fluorescerande interkalerande färg, såsom etidiumbromid.
- Rena den digererade DNA genom gelextraktionskit och bestämma DNA-koncentrationen med en spektrofotometer mäter Abs 260 x 50 ^ g / ml.
- Ligate den renade EmGFP-kodande DNA i 50-100 ng av PET-2F-Zif använder 1 U T4 DNA-ligas i minst 1 timme vid RT. För bästa resultat, utför ligeringsreaktion med en 6: 1 insert-till-vektor molförhållandet.
- Tina 50 pl av eventuella kemiskt kompetenta XL-1 Blue Escherichia coli celler på is och blanda försiktigt med 10-20 ng ligerades pET-2F-Zif-EmGFP.
- Håll på is i 30 min. Värmechock blandningen vid 42 ° C under 90 sek och återhämta de celler i 2 ml Super Optimal buljong med katabolitrepression (SOC) under 1 h vid 37 ° C med skakning.
- Sprid 100 pl av återhämtning kultur på en lysogeni buljong (LB) agarplatta med 50 | ig / ml kanamycin och inkubera O / N vid 37 ° C.
- Följande dag, inokulera 6 ml Super Broth (SB) eller LB-odling innehållande 50 ug / ml kanamycin med en koloni från LB-agarplatta och kultur O / N vid 37 ° C.
Anm: koloni-PCR med användning av primrarna 5 'Xmal-EmGFP och 3' Sacl-EmGFP kunde användas för att identifiera positiva kloner före miniprep. - Rena pET-2F-ZIF- EmGFP genom miniprep och bekräfta plasmiden genom DNA-sekvensering med användning av T7-promotorn (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').
2. Uttryck och rening
- Tina 50 pl kemiskt kompetent BL21 E. coli-celler på is och blanda försiktigt med 100 ng av PET-2F-Zif-EmGFP plasmid. Trans enligt steg 1,7-1,8.
- Följande dag, inokulera 10 ml LB-medium innehållande 50 ug / ml kanamycin med en enda koloni och odla O / N vid 37 ° C med skakning.
- Följande dag, späd 10 ml av O / N-kulturen i 1 liter LB-medium kompletterat med 50 | ig / ml kanamycin, 0,2% glukos och 100 | iM ZnCl2. Odla kulturen vid 37 ° C med skakning till en optisk densitet vid 600 nm (OD 600) av 0,8 och inducera proteinexpression med 2 mM isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG). Efter 6 h av tillväxt vid 37 ° C, skörd celler genom centrifugering vid 5000 xg under 10 min vid 4 ° C.
Anm: Induktionsförhållandena är mycket varierande och beror på stabiliteten av proteinerna som uttrycks. Övervaka OD 600 varje 30 min tills en OD 600 av 0,8 har uppnåtts. - Resuspendera cellpelleten i 5 ml lysbuffert (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 ^ M ZnCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM MgCl2, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) och 10 mM imidazol, pH 8,0). Lyse cellerna på is genom ultraljudsbehandling med följande inställning: 50% uteffekt, 4 min processtid med 5 sek på / 10 sek off intervaller. Undvik överhettning av lösningen.
- Centrifugera cellysatet vid 25.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C och överför supernatanten till ett rent provrör. För bästa resultat, genomföra följande steg vid 4 ° C.
- Kör supernatanten genom en kolonn packad med 1 ml till jämvikt Ni-NTA slurry. Tvätta hartset med 20 ml tvättbuffert (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 ^ M ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 och 30 mM imidazol, pH 8,0).
- Eluera proteinet med 5 ml elueringsbuffert (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 100 ^ M ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, och 300 mM imidazol, pH 8,0).
- Buffert utbyta det eluerade proteinet med lagringsbuffert (50 mMTris-HCl, 500 mM NaCl, 100 ^ M ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 och 10% glycerol, pH 8,0) och koncentrera proteinet till minst 40 | iM med användning av en spinn koncentrator genom centrifugering i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Bestäm proteinkoncentration genom BCA-eller Bradford-analysen. Blanda 2 pl av renade proteiner med 2 | il 2 x SDS-PAGE-laddningsfärg, kokar vid 95 ° C under 10 min och sedan besluta om 4% -20% Tris-glycin SDS-PAGE för att utvärdera proteinrenhet (fig 2).
3. Protein Förvaring
- Alikvotera koncentrerat protein, blixt frysa i flytande kväve och förvara vid -80 ° C. För EmGFP fusionsproteiner, täcka röret med aluminiumfolie för att skydda proteinet från ljus.
- Undvik upprepad frysning och upptining av proteinlösningen. Obs: ZIF-sammansmälta proteiner är stabila under dessa förhållanden under minst 1 månad. Olämpligt eller> 4 månaders lagring kan ledatill proteinutfällning eller fotoblekning av EmGFP.
4. Protein Transduktion
- Upprätt HeLa-celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) innehållande 10% (volym / volym) fetalt bovint serum (FBS) och 1% antibiotikum-antimykotikum vid 37 ° C i en fullständigt fuktad atmosfär med 5% CO2.
Obs: Celler passe mer än 30 gånger rekommenderas inte för protein transduktion. - Förbeläggning en 24-brunnsplatta med 500 | il av 50 | ig / ml av poly-lysin under 30 till 60 min vid 25 ° C. Seed celler på en 24-brunnsplatta vid en densitet av 2 x 10 5 celler per brunn. Vid 24 h efter sådd, eller när celler är mellan 80% -90% konfluenta, avlägsna media från varje brunn och tvätta med 500 | il av förvärmt serumfritt DMEM (SFM).
- Till varje brunn, tillsätt 250 ìl av SFM innehållande 2 ^ M Zif-EmGFP protein och 100 iM ZnCl2. Inkubera cellerna vid 37 ° C under 1 h. Obs: ZIF-domäner in i celler primarily genom macropinocytosis, 34 som är ett energiberoende mekanism. Därför måste cellerna inkuberas vid 37 ° C för effektiv proteininterna.
- Avlägsna media från celler och tvätta tre gånger med 500 | il av kalcium- och magnesiumfritt Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) kompletterat med 0,5 mg / ml av heparin. Obs: Heparin är nödvändigt att ta bort ytan bundet protein som kan komplicera analyser nedströms.
- (Valfritt) Upprepade behandlingar upp till tre gånger för ökad leverans.
- Isolera behandlade celler omedelbart efter heparin tvätt genom digerering med 0,05% trypsin-EDTA vid 37 ° C under 2 min. Återsuspendera lösgjorda celler i 0,5 ml DPBS supplementerat med 1% FBS.
- Mät fluorescensintensiteten hos varje prov genom flödescytometri 35 med användning av fluorescein-isotiocyanat (FITC) kanal (figur 3). Justera framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) för att placera populationen avränta på skalan, se till att populationer med olika egenskaper löses från varandra.
- Samla 10.000 live-evenemang för varje prov och analysera data med hjälp av flödescytometri uppgifter analysprogram. 36 Normalisera fluorescens från HeLa-celler som behandlats med ZIF-EmGFP till de celler som behandlats enbart med SFM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Två fingrar Zif-EmGFP fusionsproteiner kan uttryckas i E. coli med> 95% homogenitet och höga utbyten (> 25 mg / ml) (Figur 2). I allmänhet, en- och två fingrar kan produceras Zif fusionsproteiner i mängder nästan identiska med vildtyp omodifierade proteinet. Men i vissa sammanhang, fem- och sex-finger ZIF fusionsproteiner inte kan produceras i avkastningen tillräckligt hög för tillämpningar efter.
Direkt tillämpning av två fingrar ZIF- EmGFP proteinet på HeLa-celler under 90 minuter vid 37 ° C leder till en dosberoende ökning av EmGFP fluorescens (figur 3A). Kritiskt är ingen fluorescens observerades i frånvaro av ZIF-domänen. Vi observerade tidigare att nästan 100% av cellerna är fluorescerande efter behandling med endast 2 pM av två fingrar ZIF- EmGFP protein och att HeLa-celler behandlade med ZIF-fusionsprotein är positiva för EmGFP fluorescens vid proteinkoncentrationer så lite som 0,25 ^ M (Figur 3B).
Figur 1. Struktur och sekvens av zink-fingerprotein. (Top) Kristallstruktur av en enda zinkfinger (ZIF) domän. Sidokedjorna av den konserverade Cys och His-rester samordnade med Zn2 + jonen visas som pinnar (PDB ID: 2I13). 37 (Botten) Sekvens av ZIF-domänen. Pilar och cylindrar indikerar Β ark och α-helix sekundära strukturer, respektive. De α-helix DNA-bindande rester som har substituerats med alanin markeras rosa. Positivt laddade rester förutspådde att förmedla cellinterna markeras ljusblå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. SDS-PAGE av renat en-, två-, tre- och fyra-finger ZIF- EmGFP fusionsproteiner. ZIF- EmGFP fusionsproteiner uttrycktes i E. coli och renades genom Ni-NTA-agarosharts. Eluerade proteinet analyserades med avseende på renhet genom SDS-PAGE med användning av en 4% -20% Tris-glycin-gel. Ingen signifikant försämring eller trunkeringar av Zif-EmGFP fusionsproteiner observerades.
Figur 3. Zif-medierad proteinleverans i HeLa-celler. (A) Fluorescens intensitet HeLa-celler som behandlats med ökande mängder av två fingrar Zif-EmGFP protein. HeLa-celler som behandlats med EmGFP protein lappar ensam helt med obehandlade celler. (B) Normaliserad fluorescensintensitet HeLa-celler behandlade i följd med 2 ^ M of två fingrar Zif-EmGFP protein. Fluorescensintensitet bestämdes genom flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här, är en steg-för-steg-protokoll för proteinleverans användning av cell-permeabla zinkfinger (Zif) domäner presenteras. ZIF-domänen minskar inte aktiviteten av smält enzymatisk last 34; möjliggör produktion och rening av proteiner i avkastningen nästan identiska med de som observerats med omodifierade proteinet; och kan transportera proteiner och enzymer till ett brett spektrum av celltyper med effektivitetsvinster som överstiger traditionella cellpenetrerande peptid eller protein transduktion domänsystem. Tillsammans utgör dessa fynd tyder den breda potentialen i ZIF-domäner för att förmedla direkt proteinleverans till celler för ett brett spektrum av applikationer.
Maximal proteinleverans tidigare uppnås med bara två fingrar ZIF-domän, trots att förlängas matriser av tre- och fyrafinger ZIF domäner bär större positiv laddning. Dessa fynd tyder på att Zif-medierad cell posten kan påverkas av andra än laddning, inc faktorerluding proteinstabilitet eller konforma styvhet. ZIF-domän-förmedlad protein leverans befanns också vara energiberoende och kräver därför att alla celler som behandlats med protein inkuberas vid 37 ° C. Genom användning av småmolekylära hämmare av olika endocytiska vägar, macropinocytosis, och i mindre utsträckning caveolin beroende endocytos, hade bestämt sig för att vara de stora banor för Zif-medierad cell posten. 34 Noterbart till skillnad från andra protein transduktion system, Zif domäner är kapabla att effektivt fly endosomer att förmedla höga halter av cytosoliskt leverans av smält makromolekylära last, stryker potentialen hos dessa domäner för att uppnå robusta proteinleverans.
Enligt vår erfarenhet är det såddtäthet av celler ett kritiskt steg för att uppnå höga nivåer av protein transduktion. Vi rekommenderar att behandla celler när de når 80% -90% konfluens och tidigare observerats att celler seedade på> 95% sammanflyt show sub-optimal transduktion kapacitet, medan celler sådda vid låga tätheter (<50%) är mottagliga för protein-inducerad toxicitet. Viktigt för celltyper med höga lösgör tendenser, cellodlingsplattor förväg belagd med poly-lysin rekommenderas. Poly-lysin underlättar cellbindning genom elektrostatiska interaktioner med negativt laddade cellytan komponenter. Även om α-helix DNA-bindande rester av varje ZIF-domän har tagits bort för att eliminera alla möjligheter till DNA erkännande, cystein och histidinresterna som samordnar med Zn 2+ jon att stabilisera domän gånger ΒΒα Zif förblir intakt. Således rekommenderar vi att alla lagringsbuffert kompletteras med minst 100 iM av ZnCl2 för att bibehålla proteinintegritet.
Fastän ZIF domänen visades tidigare att leverera proteiner och enzymer i en mängd celltyper, kan effektiviteten i Zif leverans också vara beroende av både macromolecular last och proteinkoncentration. Till exempel, celler behandlade med två fingrar ZIF-luciferas-fusionsprotein observerades för att visa maximal luminiscens när de behandlades med 0,5 ^ M-protein, med minskad aktivitet vid högre koncentrationer, medan celler som behandlats med två fingrar EmGFP uppvisade en dosberoende ökning i fluorescens intensitet upp till 8,0 iM protein, och vid konsekutiva proteinbehandlingar. Vi rekommenderar därför att utvärdera cellpenetrerande förmåga varje unik Zif domänfusion i en rad koncentrationer.
Slutligen, men ännu inte visat, räknar vi med att ZIF domän leveransen är en mycket flexibel plattform, som kan leverera en mångfald av makromolekyler i celler. Till exempel kan det vara möjligt för både DNA och RNA som skall kemiskt funktionaliserad på ytan av ZIF-domänen via en hydrolyserbar linker, eller transfekterades transient in i celler genom inkapsling av Zif domäner. Dessutom, den efficirens i ZIF proteinleverans kan stärkas ytterligare genom rationella designinsatser inriktade på ytladd optimering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (DP1CA174426 till Carlos F. Barbas) och ShanghaiTech University, Shanghai, Kina (till JL). Molekylära grafik genererades med hjälp PyMOL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
- Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
- Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
- Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
- Elliott, G., O'Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
- Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
- Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
- Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
- Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
- Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
- Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
- Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
- Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
- Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
- Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
- Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
- Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
- Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188, 773-782 (2011).
- Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
- Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
- Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
- Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
- Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
- Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
- Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
- Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).
