Summary
Zinkfinger-domæner er uløseligt celle-permeable og i stand til at mediere protein levering i en bred række af mammale celletyper. Her er en detaljeret trin-for-trin-protokollen til gennemførelse zink-finger-teknologi til intracellulær protein levering fremlagt.
Introduction
Meget effektive og alsidige strategier protein levering er afgørende for mange grundforskning og terapeutiske anvendelser. Den direkte levering af oprensede proteiner i celler er et af de sikreste og letteste metoder til at opnå dette. 1,2 modsætning strategier, der er afhængige af genekspression fra nukleinsyrer, 3-5 protein levering udgør nogen risiko for insertionsmutagenese, er uafhængig af den cellulær transskription / translation maskiner og giver mulighed for en øjeblikkelig virkning. Men manglen på enkle og generalisere metoder til tilføre celle-gennemtrængende aktivitet på proteiner rutinemæssigt forvirrer deres direkte indrejse i celler. Nuværende fremgangsmåder til at lette intracellulær protein levering er baseret på anvendelsen af naturligt forekommende 6-8 eller konstrueret cellepenetrerende peptider, 9-12 trykladning transduktion domæner, 13,14 nanopartikler 15 og liposomer, 16 viruslignende partikler 17,18 19 Desværre har mange af disse metoder er hæmmet af lave celleoptagelse rater, 20,21 dårlig stabilitet, 22 utilsigtet celletype specificitet, 23 lav endosomale escape egenskaber 24 og toksicitet. 25 Endvidere er mange protein transduktion teknologier reducere bioaktiviteten af de leverede proteiner. 14
Vores laboratorium tidligere vist, at zink-finger nuclease (ZFN) proteiner - kimære restriktionsendonukleaser bestående af en programmerbar Cys 2 -His 2 zink-finger-DNA-bindende protein og spaltning domæne af Fokl restriktionsendonuklease 26-28 - er i sagens natur celle- gennemtrængelig. 29 Denne overraskende celle-gennemtrængende aktivitet viste sig at være en iboende egenskab ved specialdesignede zink-finger-domæne, et DNA-bindende platform, der er opstået som et effektivt redskab til målrettet genom enEngineering, 30-32 og anses for at være resultatet af konstellation af seks positivt ladede rester på proteinet overflade. Faktisk adskillige DNA-bindende proteiner, herunder c-Jun og N-DEK er blevet vist, at besidde en medfødt evne til at krydse cellemembraner 33 nylig vores laboratorium udvidet på disse resultater og demonstreret. At cellepenetrerende aktivitet zink- finger (ZIF) domæner kunne udnyttes til intracellulært protein levering. Genetisk fusion af enten et eller to finger ZIF domæner til specifikt protein last ført til optagelse effektivitetsgevinster, der oversteg mange konventionelle celle-gennemtrængende peptid leveringssystemer. 34 Mest bemærkelsesværdigt var ZIF-medieret levering ikke kompromittere aktiviteten af smeltet enzymatisk fragt og lettet høje niveauer af cytosolisk levering. Kollektivt, disse resultater demonstrere potentialet i ZIF-domænet for at lette en effektiv og let levering af proteiner, og potentielt mere forskelligartede former for makromolekyler i celler.
Her er en detaljeret trin-for-trin-protokollen om, hvordan man gennemfører ZIF teknologi til protein levering i pattedyrceller fremlagt. Vi har tidligere fremstillet en suite af en-, to-, tre-, fire-, fem- og seks-finger ZIF domæner, der mangler evnen til at binde DNA, som følge af substitution af hver af de α-helix DNA-bindende rester, men er i stand til at levere proteiner i celler 34 (figur 1). Produktion og transduktion af Emerald GFP (EmGFP) ind i HeLa-celler ved hjælp af en to-finger ZIF domænet er beskrevet. Denne protokol kan udvides til næsten ethvert protein i stand til opløselig ekspression i Escherichia coli og næsten enhver type pattedyrcelle. Forventede resultater leveres og strategier for at maksimere effektiviteten af dette system er også drøftet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning
- Opnå alaninsubstituerede to-finger ZIF-domæner, der er blevet sub-klonet i pET-28 ekspressionsvektorsystem og er tilgængelige efter anmodning (PET-2F-ZIF). 34
- PCR amplificere EmGFP fra plasmidet Emerald-pBAD med primerne 5'XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3 '; Xma I site i fed skrift) og 3' Sacl-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3 ' ; Sac I site i fed skrift).
- Brug 5 ng template-DNA, 10 pi 10X polymerase-buffer, 1 enheder (U) Taq DNA-polymerase, 0,2 mM af hver dNTP og 0,2 uM af hver primer i en 100 pi opløsning med den resterende mængde udgøres af destilleret / deioniseret vand . Brug cykelforhold: 95 ° C i 5 min; 30 cykler af 95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek og 72 ° C i 1 min; 72 ° C i 10 min. Oprens PCR-produktet ved gel extractipå og bestemme DNA-koncentration ved anvendelse af et spektrofotometer måler Abs 260 x 50 ug / ml.
- Digest pET-2F-ZIF og insert, som koder EmGFP med restriktionsenzymerne Xmal og Sac I i anbefalede buffer i 3 timer ved 37 ° C ved anvendelse af 10 U enzym pr 1 ug DNA. Visualiser DNA ved agarosegelelektroforese under anvendelse af en fluorescerende interkalerende farvestof, såsom ethidiumbromid.
- Oprens det fordøjede DNA ved gelekstraktionskit og bestemme DNA-koncentration med et spektrofotometer måler Abs 260 x 50 ug / ml.
- Ligere oprenset EmGFP-kodende DNA i 50-100 ng af PET-2F-ZIF anvendelse af 1 U T4 DNA-ligase i mindst 1 time ved stuetemperatur. For de bedste resultater, skal du udføre ligeringsreaktionen ved hjælp af en 6: 1 insert-til-vektor molforholdet.
- Thaw 50 pi af enhver kemisk kompetente XL-1 Blå Escherichia coli-celler på is og bland forsigtigt med 10-20 ng ligeret pET-2F-ZIF-EmGFP.
- Hold på is i 30 min. Heat shock blandingen ved 42 ° C i 90 sek og inddrive cellerne i 2 ml Super Optimal bouillon med katabolitrepression (SOC) i 1 time ved 37 ° C med omrystning.
- Spred 100 pi recovery kultur på en lysogeni bouillon (LB) agar plade med 50 ug / ml kanamycin og inkuberes O / N ved 37 ° C.
- Den følgende dag, pode 6 ml Super Broth (SB) eller LB kultur indeholdende 50 ug / ml kanamycin med en koloni fra LB-agarplade og kultur O / N ved 37 ° C.
Bemærk: Colony PCR under anvendelse af primerne 5'-XmaI-EmGFP og 3 'Sacl-EmGFP kunne anvendes til at identificere positive kloner før miniprep. - Oprens pET-2F-ZIF-EmGFP ved miniprep og bekræft plasmid ved DNA-sekventering under anvendelse af T7-promotor (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').
2. Ekspression og oprensning
- Optø 50 pi kemisk kompetente BL21 E. coli-celler på is og bland forsigtigt med 100 ng af PET-2F-ZIF-EmGFP plasmid. Transform som beskrevet i trin 1,7-1,8.
- Den følgende dag inokulere 10 ml LB-medium indeholdende 50 ug / ml kanamycin med en enkelt koloni og vokse O / N ved 37 ° C med omrystning.
- Den følgende dag, fortyndes 10 ml af O / N-kulturen i 1 L LB-medium suppleret med 50 ug / ml kanamycin, 0,2% glucose og 100 uM ZnCl2. Grow kulturen ved 37 ° C med omrystning til en optisk densitet ved 600 nm (OD600) på 0,8 og inducere proteinekspression med 2 mM isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). Efter 6 timer af vækst ved 37 ° C, høst cellerne ved centrifugering ved 5000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
Bemærk: Induktion betingelser er meget variabel og afhænger af stabiliteten af proteiner, der udtrykkes. Overvåg OD 600 hver 30 min, indtil en OD600 på 0,8 er nået. - Resuspender cellepelleten i 5 ml lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCI, 100 pM ZnCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM MgCl2, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og 10 mM imidazol, pH 8,0). Lysere cellerne på is ved lydbehandling med følgende indstilling: 50% effekt output, 4 min proces tid med 5 sek på / 10 sek off intervaller. Undgå overophedning af løsningen.
- Centrifugeres cellelysatet ved 25.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C og overføres supernatanten til en frisk opsamlingsrør. For de bedste resultater, foretage alle trin ved 4 ° C.
- Kør supernatanten gennem en kolonne præ-pakket med 1 ml ækvilibreret Ni-NTA opslæmning. Vask harpiksen med 20 ml vaskebuffer (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCI, 100 pM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 og 30 mM imidazol, pH 8,0).
- Elueres proteinet med 5 ml elueringsbuffer (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCI, 100 pM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 og 300 mM imidazol, pH 8,0).
- Buffer udveksle eluerede protein med opbevaring buffer (50 mMTris-HCI, 500 mM NaCI, 100 pM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCI2 og 10% glycerol, pH 8,0) og koncentrere proteinet til mindst 40 um ved anvendelse af en spin-koncentrator ved centrifugering ifølge producentens anvisninger.
- Bestem proteinkoncentration ved BCA eller Bradford assay. Bland 2 pi oprensede proteiner med 2 pi 2 x SDS-PAGE loading dye, koge ved 95 ° C i 10 minutter og derefter løse på 4% -20% Tris-Glycine SDS-PAGE for at vurdere proteinrenhed (figur 2).
3. Protein Opbevaring
- Alikvot den koncentrerede protein, flash fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C. For EmGFP fusionsproteiner, dække rør med aluminiumsfolie for at beskytte proteinet mod lys.
- Undgå gentagen nedfrysning og optøning af proteinopløsningen. Bemærk: ZIF-fusionerede proteiner er stabile under disse betingelser i mindst 1 måned. Upassende eller> 4 måneder opbevaring kan medføreprotein udfældning eller fotoblegning af EmGFP.
4. Protein Transduktion
- Oprethold HeLa-celler i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 10% (v / v) kalvefosterserum (FBS) og 1% antibiotisk-antimykotisk ved 37 ° C i en fuldt befugtet atmosfære med 5% CO2.
Bemærk: Celler passeret mere end 30 gange anbefales ikke til protein transduktion. - Pre-coat en 24-brønds plade med 500 pi af 50 ug / ml poly-lysin i 30 til 60 minutter ved 25 ° C. Seed celler på en plade med 24 brønde ved en densitet på 2 x 10 5 celler pr. Ved 24 timer efter podning, eller når celler er mellem 80% -90% sammenflydende, fjernes mediet fra hver brønd og vask med 500 pi forvarmet serumfrit DMEM (SFM).
- Til hver brønd tilsættes 250 pi SFM indeholdende 2 uM ZIF-EmGFP protein og 100 uM ZnCl2. Cellerne inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Bemærk: ZIF domæner indtaste celler primarily gennem macropinocytosis, 34, som er en energi-afhængig mekanisme. Derfor skal cellerne inkuberes ved 37 ° C til effektiv protein internalisering.
- Fjern medier fra cellerne og vaskes tre gange med 500 pi af calcium- og magnesium-fri Dulbeccos phosphatpufret saltvand (DPBS) suppleret med 0,5 mg / ml heparin. Bemærk: Heparin er nødvendigt at fjerne overflade-bundet protein, som kunne komplicere downstream analyser.
- (Valgfrit) Gentag behandlinger op til tre gange for øget levering.
- Isoler behandlede celler umiddelbart efter heparin vask ved fordøjelse med 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 2 min. Resuspender løsnede celler i 0,5 ml DPBS suppleret med 1% FBS.
- Mål fluorescensintensiteten af hver prøve ved flowcytometri 35 ved hjælp af fluoresceinisothiocyanat (FITC) kanal (figur 3). Juster forward scatter (FSC) og sidespredning (SSC) for at placere befolkningrenter på skalaen, der sikrer, at befolkninger med forskellige egenskaber er løst fra hinanden.
- Saml 10.000 live events for hver prøve og analysere dataene ved anvendelse af flowcytometri dataanalyse software. 36 Normalize fluorescens fra HeLa-celler behandlet med ZIF-EmGFP disse celler behandlet kun med SFM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To-finger ZIF-EmGFP fusionsproteiner kan udtrykkes i E. coli med> 95% homogenitet og høje udbytter (> 25 mg / ml) (figur 2). Generelt en- og to-finger ZIF fusionsproteiner kan fremstilles i mængder næsten identiske med dem af vildtype umodificeret protein. Men i nogle sammenhænge, fem- og seks-finger ZIF fusionsproteiner er i stand til at blive produceret i udbytter er høje nok til efterfølgende anvendelser.
Direkte anvendelse af to fingre ZIF-EmGFP protein på HeLa-celler i 90 minutter ved 37 ° C fører til en dosisafhængig stigning i EmGFP fluorescens (figur 3A). Kritisk observeres ingen fluorescens i fravær af ZIF domæne. Vi har tidligere bemærket, at næsten 100% af celler er fluorescerende efter behandling med kun 2 pM to fingre ZIF-EmGFP protein, og at HeLa-celler behandlet med ZIF fusionsprotein er positive for EmGFP fluorescens ved proteinkoncentrationer så lavt som 0,25 uM (figur 3B).
Figur 1. Struktur og sekvens af zink-finger-protein. (Top) krystalstruktur en enkelt zink-finger (ZIF) domæne. De kæder af den konserverede Cys og His-rester side koordineret med Zn2 + ion er vist som sticks (PDB ID: 2I13). 37 (nederst) Sekvens af ZIF domæne. Pile og cylindre angiver Β-ark og α-helix sekundære strukturer hhv. De α-helix DNA-bindende rester, der er blevet substitueret med alanin er fremhævet pink. Positivt ladede rester forudsagt at mediere celle internalisering er fremhævet lyseblå. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. SDS-PAGE af renset en-, to-, tre- og fire-finger ZIF-EmGFP fusionsproteiner. ZIF-EmGFP fusionsproteiner blev udtrykt i E. coli og oprenset ved Ni-NTA agarose resin. Eluerede protein blev analyseret for renhed ved SDS-PAGE under anvendelse af en 4% -20% Tris-Glycine gel. Ingen væsentlig forringelse eller trunkeringer af ZIF-EmGFP fusionsproteiner blev observeret.
Figur 3. ZIF-medieret protein levering ind i HeLa-celler. (A) Fluorescensintensitet af HeLa-celler behandlet med stigende mængder af to fingre ZIF-EmGFP protein. HeLa-celler behandlet med EmGFP protein alene overlapper helt med ubehandlede celler. (B) Normalized fluorescensintensitet af HeLa-celler behandlet konsekutivt med 2 um of to fingre ZIF-EmGFP protein. Fluorescensintensitet blev bestemt ved flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her er en trin-for-trin-protokol for protein levering ved hjælp af celle-permeable zink-finger (ZIF) domæner præsenteres. ZIF-domænet ikke reducere aktiviteten af smeltet enzymatisk fragt 34; giver mulighed for produktion og oprensning af proteiner i udbytter næsten identiske med dem observeret med umodificeret protein; og kan transportere proteiner og enzymer i en lang række celletyper med en virkningsgrad, der overskrider traditionelle cellepenetrerende peptid- eller proteintransduktionsdomæne systemer. Tilsammen indikerer disse resultater, det brede potentiale ZIF domæner for at mediere direkte protein levering til celler til en bred vifte af anvendelser.
Maksimal protein levering blev tidligere opnået ved hjælp af kun to finger ZIF domæne, til trods for at udvides arrays af tre- og fire-finger ZIF domæner bærer større positiv ladning. Disse resultater viser, at ZIF-medieret entry celle kan være påvirket af andre end google, inc faktorerluding proteinstabilitet eller konformationel stivhed. ZIF domæne-medieret protein levering blev også fundet at være energiafhængige og således kræver, at alle celler behandlet med protein inkuberes ved 37 ° C. Gennem brugen af små molekyle inhibitorer af forskellige endocytiske veje, macropinocytosis, og i mindre grad caveolin-afhængig endocytose, var bestemt til at være de vigtigste veje for ZIF-medieret celleindtastning. 34 Især i modsætning til andre protein transduktion systemer ZIF domæner i stand til effektivt at undslippe endosomer at mediere høje niveauer af cytosolisk levering af det fusionerede makromolekylære last, hvilket understreger potentialet af disse domæner for at opnå robust protein levering.
Det er vores erfaring, at såning tæthed af celler er et afgørende skridt for at opnå høje niveauer af protein transduktion. Vi anbefaler at behandle celler, når de når 80% -90% konfluens og tidligere observerede, at celler podet ved> 95% konfluens Vis under-optimal transduktion kapacitet, mens celler podet ved lave densiteter (<50%) er modtagelige for protein-induceret toksicitet. Vigtigere er det, for celletyper med høje udstationeringsprocedurer tendenser cellekulturplader pre-coatet med poly-lysin anbefales. Poly-lysin letter cellebinding gennem elektrostatiske interaktioner med negativt ladede celleoverflade-komponenter. Selvom α-helix DNA-bindende rester af hver ZIF domæne er blevet fjernet for at eliminere enhver risiko for DNA-genkendelse, cystein og histidinrester, der koordinerer med Zn2 + ion at stabilisere ΒΒα ZIF domæne fold forbliver intakt. Derfor anbefaler vi, at enhver oplagring buffer suppleres med mindst 100 uM ZnCI2 at bevare protein integritet.
Selv ZIF domænet tidligere blev vist at afgive proteiner og enzymer i en række celletyper, kan effektiviteten af ZIF levering også være afhængig af både macromolecular fragt og protein koncentration. For eksempel, celler behandlet med to fingre ZIF-luciferase fusionsprotein blev observeret at vise maksimal luminescens, når de behandles med 0,5 uM protein med nedsat aktivitet ved højere koncentrationer, mens celler behandlet med to fingre EmGFP udviste en dosisafhængig stigning i fluorescens intensitet op til 8,0 uM protein, og efter hinanden følgende protein behandlinger. Vi anbefaler derfor, at evaluere cellepenetrerende evne hver unik ZIF domæne fusion på tværs af en række koncentrationer.
Endelig, selv om der endnu ikke påvist, forventer vi, at ZIF domæne levering er en meget fleksibel platform, der kan levere en bred vifte af makromolekyler i celler. For eksempel kan det være muligt for både DNA og RNA til kemisk funktionaliseret på overfladen af ZIF domæne via en hydrolyserbar linker eller forbigående transficeret ind i celler ved indkapsling af ZIF domæner. Derudover efficitighed af ZIF protein levering kunne forbedres yderligere ved rationelt design indsats fokuseret på overfladeladning optimering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (DP1CA174426 til Carlos F. Barbas) og ShanghaiTech University, Shanghai, Kina (til JL). Molekylære grafik blev dannet ved anvendelse PyMOL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
- Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
- Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
- Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
- Elliott, G., O'Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
- Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
- Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
- Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
- Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
- Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
- Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
- Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
- Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
- Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
- Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
- Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
- Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
- Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188, 773-782 (2011).
- Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
- Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
- Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
- Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
- Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
- Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
- Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
- Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).
