Summary
Domínios dedo-de-zinco são intrinsecamente célula-permeável e capaz de mediar a entrega de proteína em uma ampla gama de tipos de células de mamíferos. Aqui, um protocolo detalhado passo-a-passo para a implementação da tecnologia de dedo de zinco para a entrega intracelular de proteínas é apresentada.
Introduction
Altamente estratégias de fornecimento de proteína eficientes e versáteis são críticos para muitos pesquisa básica e aplicações terapêuticas. A entrega directa das proteínas purificadas em células representa um dos métodos mais seguros e mais fáceis para alcançar este objectivo. 1,2 Ao contrário das estratégias que dependem de expressão de genes de ácidos nucleicos, 3-5 entrega proteína não apresenta nenhum risco de mutagénese de inserção, é independente do transcrição / máquinas e tradução celular permite um efeito imediato. No entanto, a falta de métodos simples e generalizáveis para dotar a atividade de penetração celular para proteínas confunde rotineiramente sua entrada direta nas células. Os métodos actuais para facilitar a entrega intracelular de proteínas são baseadas no uso de ocorrência natural ou 6-8 concebidos de penetração de células, péptidos 9-12 domínios de transdução de sobrealimentação, 13,14 nanopartículas 15, 16 e lipossomas partículas semelhantes a vírus 17,18 19 Infelizmente, muitas dessas abordagens são dificultados pelas taxas de captação celular baixos, 20,21 pobre estabilidade, 22 inadvertida tipo de célula de especificidade, 23 propriedades de escape baixo endossomais 24 e toxicidade. 25 Além disso, muitos proteína tecnologias de transdução de reduzir a bioactividade das proteínas entregues 14.
O nosso laboratório demonstrou anteriormente que zinc-finger nuclease proteínas (ZFN) - endonucleases de restrição quimérico que consiste de uma Cys His 2 2 zinc-finger programável proteína de ligação a ADN e domínio de clivagem da endonuclease de restrição FokI 26-28 - são inerentemente célula.dia permeável. 29 Esta actividade de penetração celular surpreendente mostrou ser uma propriedade intrínseca do domínio dedo-de-zinco personalizados, com uma plataforma de ligação de ADN que surgiu como uma ferramenta poderosa para o genoma segmentado enengenha-, 30-32 e ser considerada como o resultado da constelação de seis resíduos carregados positivamente na superfície da proteína. De facto, várias proteínas de ligação de ADN, incluindo c-Jun e N-DEK foram mostrados para possuir uma capacidade inata para atravessar as membranas celulares. 33 Mais recentemente, no nosso laboratório expandido estes resultados e demonstraram que a actividade da célula de penetração de zinco finger (ZIF) da domínios poderia ser aproveitado para a entrega de proteínas intracelulares. Fusão genética de ambos domínios ZIF de um ou dois dedos para carga proteína específica levou a absorção eficiências que superaram muitos sistemas de entrega de peptídeos convencionais de penetração celular. 34 Mais notavelmente, entrega ZiF mediada não comprometeu a atividade de carga enzimática fundido e facilitado altos níveis de entrega cytosolic. Colectivamente, estes resultados demonstram o potencial do domínio ZiF para facilitar a entrega eficiente e fácil de proteínas, e potencialmente mais diversos tipos de macromoléculas, em células.
Aqui, um protocolo detalhado passo-a-passo sobre como implementar a tecnologia ZiF para entrega de proteína em células de mamíferos é apresentada. Nós previamente construído um conjunto de um, dois, três, quatro, cinco e seis domínios dedo-Zif que não possuem a capacidade de se ligar ao ADN, devido a substituição de cada um dos resíduos de ligação ao ADN de hélice α, mas são capazes de fornecer proteínas em células 34 (Figura 1). A produção e a transdução de esmeralda GFP (EmGFP) em células HeLa usando um domínio ZiF de dois dedos é descrito. Este protocolo é extensível para quase qualquer proteína solúvel capaz de expressão em Escherichia coli e quase qualquer tipo de células de mamíferos. Os resultados esperados são fornecidos e estratégias para maximizar o desempenho do sistema também são discutidos.
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Protocol
1. Clonagem
- Obter de dois dedos domínios ZIF substituído por alanina que foram sub-clonados no sistema de expressão vector pET-28 e estão disponíveis mediante pedido (PET-2F-ZiF). 34
- EmGFP amplificar por PCR a partir do plasmídeo pBAD-esmeralda com os iniciadores 5 'Xmal-EmGFP (3-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC 5'-GGAAATTG CCCGGG'; sítio Xmal em negrito) e 3 'Saci-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' site eu Sac em negrito);.
- Use 5 ng de ADN molde, 10 ul de tampão de polimerase 10x, 1 Unidades (U) de Taq DNA polimerase, 0,2 mM de cada dNTP e 0,2 pM de cada iniciador numa solução de 100 uL com o restante volume constituídos de água destilada / desionizada . Use as condições dos ciclos: 95 ° C durante 5 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 1 min; 72 ° C durante 10 min. Purifica-se o produto de PCR por gel extractie em determinar a concentração de ADN utilizando um espectrofotómetro de medição Abs 260 x 50 ug / ml.
- Digest pET-2F-ZiF e a inserção que codifica EmGFP com as enzimas de restrição Xmal e Sac I em tampão recomendado durante 3 horas a 37 ° C utilizando 10 U de enzima por 1 ug de ADN. Visualizar o ADN por electroforese em gel de agarose, utilizando um corante fluorescente intercalante, tal como brometo de etídio.
- Purifica-se o ADN digerido por gel extraction kit e determinar a concentração de DNA por um espectrofotómetro Abs medindo 260 x 50 ug / ml.
- Ligadura o ADN que codifica EmGFP purificado em 50-100 ng de pET-2F-ZiF usando 1 U de T4 DNA ligase durante pelo menos 1 h à TA. Para melhores resultados, realizar a reacção de ligação utilizando uma razão de 6: molar de inserção-para-um vector.
- Descongelar 50 ul de quaisquer células XL-1 azul de E. coli quimicamente competentes de Escherichia em gelo e misturar suavemente com 10-20 ng de ligado pET-2F-ZiF-EmGFP.
- Manter em gelo durante 30 min. O choque térmico a mistura a 42 ° C durante 90 seg e recuperar as células em 2 ml de caldo super óptima com repressão catabólica (SOC) durante 1 hora a 37 ° C com agitação.
- Espalhe 100 ul de cultura de recuperação em um caldo lisogenia (LB) placa de ágar com 50 ug / ml de canamicina e incubar O / N a 37 ° C.
- No dia seguinte, inocula 6 ml de Super Broth (SB) ou cultura LB contendo 50 ug / ml de canamicina com uma colónia da placa de agar LB e a cultura O / N a 37 ° C.
Nota: Colony PCR utilizando os iniciadores 5 'e Xmal-EmGFP 3' Saci-EmGFP poderia ser usado para identificar os clones positivos antes de miniprep. - Purificar pET-2F-ZiF-EmGFP por miniprep e confirmar plasmídeo por sequenciação de ADN utilizando o promotor de T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').
2. Expressão e purificação
- Descongelar 50 ul de quimicamente competentes BL21 de E. coli células no gelo e misture delicadamente com 100 ng do PET-2F-ZiF-EmGFP plasmid. Transformação como descrito nos passos 1,7-1,8.
- No dia seguinte, inocular 10 ml de meio LB contendo 50 ug / ml de canamicina com uma única colónia e crescer O / N a 37 ° C com agitação.
- No dia seguinte, dilui-se os 10 ml da cultura D / N para 1 L de meio LB suplementado com 50 ug / ml de canamicina, 0,2% de glucose e 100 mM de ZnCl2. Crescer a cultura a 37 ° C com agitação até uma densidade óptica a 600 nm (OD 600) de 0,8 e induzir a expressão da proteína com 2 mM de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Após 6 horas de crescimento a 37 ° C, as células da colheita por centrifugação a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C.
Nota: As condições de indução são muito variáveis e dependem da estabilidade das proteínas a ser expressa. Monitorar a OD a 600 a cada 30 min até uma DO600 de 0,8 seja alcançado. - Ressuspender o sedimento celular em 5 ml de tampão de lise (50 mM Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 mM de ZnCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM de MgCl 2, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) e 10 mM de imidazol, pH 8,0). Lisar as células no gelo por ultra-sons com a seguinte configuração: 50% de potência, 4 min de tempo de processo com 5 sec on / off intervalos de 10 segundos. Evitar o sobreaquecimento da solução.
- Centrifuga-se o lisado celular a 25000 xg durante 30 min a 4 ° C e transferir o sobrenadante para um tubo de recolha de fresco. Para melhores resultados, executar todos os passos seguintes a 4 ° C.
- Executar o sobrenadante através de uma coluna pré-embalada com 1 ml de suspensão equilibrada de Ni-NTA. Lava-se a resina com 20 ml de tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 fiM de ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de MgCl 2 e 30 mM de imidazol, pH 8,0).
- Elui-se a proteína com 5 ml de tampão de eluição (50 mM Tris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 fiM de ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de MgCl2, e 300 mM de imidazole, pH 8,0).
- Tampão de trocar a proteína eluída com tampão de armazenamento (50 mMTris-HCl, 500 mM de NaCl, 100 mM de ZnCl2, 1 mM de DTT, 1 mM de MgCl2 e glicerol a 10%, pH 8,0) e concentrar a proteína de pelo menos 40 jiM utilizando um concentrador de rotação por centrifugação de acordo com as instruções do fabricante.
- Determinar a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford ou BCA. Misturar 2 ul de proteínas purificadas com 2 ul 2 × SDS-PAGE de corante de carga, ferver a 95 ° C durante 10 min e em seguida resolver a 4% -20% de Tris-Glicina SDS-PAGE para avaliar a pureza de proteína (Figura 2).
3. Proteína de armazenamento
- Alíquota da proteína concentrada, congelamento de flash em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. Para as proteínas de fusão EmGFP, cobrir o tubo com folha de alumínio para proteger a proteína da luz.
- Evite congelamento e descongelamento da solução de proteína repetido. Nota: ZiF proteínas fundidas são estáveis sob estas condições durante pelo menos 1 mês. Ou armazenamento inadequado mês> 4 pode levara precipitação de proteínas ou de fotobranqueamento EmGFP.
Transdução 4. Protein
- Manter as células HeLa em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% (v / v) de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico-antimicótico a 37 ° C em uma atmosfera totalmente humidi ficada com 5% de CO 2.
Nota: As células passadas mais de 30 vezes não são recomendados para a transdução de proteína. - Pré-revestimento de uma placa de 24 poços com 500 ul de 50 ug / ml de poli-lisina para 30 a 60 min a 25 ° C. Semear as células num prato de 24 cavidades a uma densidade de 2 x 10 5 células por poço. Em 24 horas após a sementeira, ou uma vez que as células são entre 80% -90% confluentes, retirar o suporte de cada poço e lava-se com 500 ul de DMEM isento de soro pré-aquecido (SFM).
- Para cada poço, adicione 250 mL de SFM contendo 2 uM de proteína ZiF-EmGFP e 100 uM de ZnCl2. Incubar as células a 37 ° C durante 1 h. Nota: domínios ZIF entrar nas células primarily através de macropinocitose, 34, o qual é um mecanismo dependente de energia. Portanto, as células devem ser incubados a 37 ° C durante internalização proteína eficiente.
- Remover meios a partir de células e lava-se três vezes com 500 ul de cálcio e sem magnésio salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) suplementado com 0,5 mg / ml de heparina. Nota: A heparina é necessário remover a proteína ligada à superfície que pode complicar análises a jusante.
- (Opcional) tratamentos repetidos até três vezes para maior entrega.
- Isolar células tratadas imediatamente depois de heparina de lavagem por digestão com 0,05% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 2 min. Re-suspender as células isoladas em 0,5 ml de DPBS suplementadas com 1% de FBS.
- Medir a intensidade de fluorescência de cada amostra por 35 citometria de fluxo utilizando o isotiocianato de fluoresceína (FITC) canal (Figura 3). Ajuste a dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) para colocar a população deinteresse na escala, assegurando que as populações com propriedades diferentes são resolvidos um do outro.
- Colete 10.000 eventos ao vivo para cada amostra e analisar os dados utilizando citometria de fluxo de análise de dados software. 36 Normalize fluorescência de células HeLa tratadas com ZiF-EmGFP a essas células tratadas apenas com SFM.
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Representative Results
Dois dedos de proteínas de fusão ZiF-EmGFP pode ser expresso em E. coli com> 95% de homogeneidade e rendimentos elevados (> 25 mg / ml) (Figura 2). Em geral, de um e de dois dedos proteínas de fusão ZiF pode ser produzido em quantidades quase idênticas às de proteína não modificada tipo selvagem. No entanto, em alguns contextos, as proteínas de fusão ZiF cinco e seis dedos não são capazes de ser produzidos em rendimentos elevados o suficiente para aplicações a jusante.
A aplicação directa de dois dedos proteína ZiF-EmGFP em células HeLa, durante 90 min a 37 ° C conduz a um aumento dose-dependente na EmGFP fluorescência (Figura 3A). Fundamentalmente, qualquer fluorescência é observado na ausência do domínio ZiF. Observou-se anteriormente que quase 100% de células são fluorescentes após tratamento com apenas 2 uM de dois dedos proteína ZiF-EmGFP, e que as células HeLa tratadas com a proteína de fusão ZiF são positivas para fluorescência EmGFP em concentrações proteicas tão baixo quanto 0.25 uM (Figura 3B).
Figura 1. Estrutura e seqüência de proteína zinc-finger. Estrutura (Superior) de cristal de um domínio de dedo de zinco única (ZiF). As cadeias laterais de Cys conservado e resíduos His coordenados com o ião Zn2 + são mostrados como varas (PDB ID: 2I13). 37 (parte inferior) da sequência do domínio ZiF. Setas e cilindros indicam estruturas secundárias Β folhas e α-hélice, respectivamente. Os resíduos de ligação ao ADN de hélice α que foram substituídos com alanina são destacadas rosa. Resíduos carregados positivamente previstos para mediar a internalização celular são destacadas azul claro. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. SDS-PAGE de purificado de um, dois, três e quatro dedos proteínas de fusão ZiF-EmGFP. Proteínas de fusão ZiF-EmGFP foram expressos em E. coli e purificado por meio de resina de Ni-NTA agarose. Proteína eluída foi analisada quanto à pureza por SDS-PAGE utilizando um 4% -20% de gel de Tris-Glicina. Não foi observada qualquer degradação significativa ou truncagens de proteínas de fusão ZiF-EmGFP.
Figura 3. ZiF entrega mediada por proteína em células HeLa. (A) da intensidade da fluorescência de células HeLa tratadas com quantidades crescentes de dois dedos proteína ZiF-EmGFP. Células HeLa tratadas com proteína EmGFP sozinho sobrepõem totalmente com células não tratadas. (B) a intensidade de fluorescência de células HeLa Normalizada tratados consecutivamente com 2 uM of dois dedos proteína ZiF-EmGFP. A intensidade da fluorescência foi determinada por citometria de fluxo.
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Discussion
Aqui, um protocolo passo-a-passo para a entrega de proteína utilizando dedo de zinco (ZiF) domínios de células-permeável é apresentado. O domínio ZiF não reduz a atividade de carga enzimática fundido 34; permite a produção e purificação de proteínas em rendimentos quase idênticos aos observados com a proteína não modificada; e pode transportar proteínas e enzimas para uma ampla gama de tipos de células, com as eficiências que excedem os sistemas tradicionais de penetração de células de péptido ou de proteína de domínio de transdução. Juntos, estes resultados indicam o amplo potencial de domínios Zif para mediar a entrega directa de proteínas em células de uma vasta gama de aplicações.
O débito máximo de proteína foi anteriormente conseguida utilizando apenas um domínio ZiF de dois dedos, apesar do facto de que se estendia matrizes de três e quatro domínios dedo-Zif transportam maior carga positiva. Estes resultados indicam que a entrada na célula ZiF mediada pode ser influenciado por outros que carga, inc factoresluding a estabilidade da proteína ou rigidez conformacional. Entrega proteína ZiF domínio mediada também foi encontrada para ser dependente de energia e, assim, requer que todas as células tratadas com a proteína ser incubadas a 37 ° C. Através do uso de inibidores de moléculas pequenas de várias vias de endocitose, macropinocitose, e em menor grau dependente da caveolin endocitose, foram determinadas como sendo as principais vias para a entrada na célula ZiF-mediada. 34 Em particular, ao contrário de outros sistemas de transdução de proteína, os domínios são ZiF capaz de escapar para mediar eficientemente endossomas níveis elevados de entrega citosólica da carga macromolecular fundido, ressaltando o potencial destes domínios para conseguir a entrega de proteína robusto.
Em nossa experiência, a densidade de semeadura de células é um passo fundamental para alcançar altos níveis de transdução de proteína. Recomendamos tratamento de células, uma vez que chegar a 80% -90% de confluência e anteriormente observado que células semeadas em> 95% de confluência espetáculo sub-capacidade de transdução óptimo, enquanto que as células semeadas em densidades baixas (<50%) são susceptíveis à toxicidade induzida por proteína. Importante, para tipos de células com altos tendências de descolamento, placas de cultura de células pré-revestidas com poli-lisina são recomendados. Poli-lisina facilita a fixação das células através de interacções electrostáticas com os componentes da superfície da célula carregada negativamente. Embora os resíduos de ligação ao ADN de hélice α de cada domínio ZiF ter sido removida para eliminar qualquer possibilidade de reconhecimento de DNA, os resíduos de cisteína e histidina que coordenam com o ião Zn2 + para estabilizar a dobra domínio ΒΒα ZiF permanecem intactos. Assim, recomenda-se que qualquer tampão de armazenamento, ser suplementado com, pelo menos, 100 uM de ZnCl 2 para manter a integridade da proteína.
Embora o domínio ZiF foi anteriormente mostrado para administrar proteínas e enzimas para uma variedade de tipos de células, a eficiência de entrega ZiF também pode ser dependente da tanto macromoléculaslecular carga e concentração de proteína. Por exemplo, as células tratadas com dois dedos ZiF-proteína de fusão de luciferase foram observados a exibir luminescência máxima quando tratada com 0,5 fiM de proteína, com a diminuição da actividade a concentrações mais elevadas, enquanto que as células tratadas com dois dedos EmGFP exibiu um aumento dependente da dose na fluorescência intensidade até 8,0 proteína? M, e sobre tratamentos de proteína consecutivos. Recomendamos, portanto, avaliar a célula penetrante capacidade de cada domínio de fusão única ZiF através de uma gama de concentrações.
Finalmente, embora ainda não demonstrou, prevemos que a entrega de domínio ZiF é uma plataforma altamente flexível, capaz de fornecer uma gama diversificada de macromoléculas em células. Por exemplo, pode ser possível, tanto no DNA e RNA para ser funcionalizados quimicamente sobre a superfície do domínio ZiF hidrolisável através de um ligante, ou transfectadas transientemente em células por encapsulação de Zif domínios. Além disso, o efficirência de entrega proteína ZiF poderá ser reforçada por esforços de design racionais com foco em otimização de carga de superfície.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (DP1CA174426 para Carlos F. Barbas) e da Universidade ShanghaiTech, Shanghai, China (a JL). Gráficos moleculares foram gerados utilizando pymol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
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