Summary
Цинк-пальцев доменов по своей природе клеточных проницаемой и способны опосредовать доставку белка в широком диапазоне типов клеток млекопитающих. Здесь подробная шаг за шагом протокол для реализации технологии цинк-пальцем для внутриклеточной доставки белков представлена.
Introduction
Высокоэффективные и универсальные стратегии доставки белка имеют решающее значение для многих фундаментальных исследований и терапевтического применения. Прямые поставки очищенных белков в клетках является одним из самых безопасных и простых способов для достижения этой цели. 1,2 В отличие от стратегий, которые полагаются на экспрессию генов из нуклеиновых кислот, 3-5 поставка белок не представляет никакого риска инсерционного мутагенеза, не зависит от сотовая транскрипции / трансляции техника и позволяет для немедленного эффекта. Тем не менее, отсутствие простых и обобщению методов наделяя активности клеток проникающим на белки обычно смешивает их непосредственное вступление в клетках. Современные методы, способствующие внутриклеточной доставки белка основаны на использовании природного происхождения или 6-8-клеток, направленных проникающих пептидов, 9-12 наддувом трансдукции доменов, 13,14 наночастиц 15 и липосомы, 16 вирусоподобные частицы 17,18 19 К сожалению, многие из этих подходов мешает низких сотовых ставок поглощения, 20,21 плохую стабильность, 22 случайного типа клеток специфичности, 23 низкая эндосомные свойств эвакуации 24 и токсичность. 25 Кроме того, многие белок трансдукции технологии уменьшить биологическую активность доставленного белков. 14
Наша лаборатория ранее показали, что цинк-пальцем нуклеазу (ZFn) белки - химерные эндонуклеаз рестрикции, состоящее из блока программируемого Cys 2 -Его 2 цинк-пальцев ДНК-связывающего белка и области расщепления рестриктазой Фоки 26-28 - по сути своей Cell- проницаемой. 29 Это удивительное клеток проникающим деятельность было показано, что внутреннее свойство специально разработанный области цинк-пальцев, ДНК-связывающий платформы, которая возникла в качестве мощного инструмента для целенаправленного геном ENинженерии, 30-32 и считается результатом созвездии шесть положительно заряженных остатков на поверхности белка. В самом деле, несколько ДНК-связывающих белков, в том числе с-июне и N-ДЭК, как было показано, обладают врожденной способностью пересекать клеточные мембраны. 33 Совсем недавно в нашей лаборатории расширен на этих результатах, и показано, что клетки-проникающей активность цинковых палец (ZIF) домены могут быть использованы для внутриклеточной доставки белков. Генетическая слияние либо одно- или двумя пальцами ZIF доменов в специфических белковых грузов привело к поглощению эффективности, превышающие многие традиционные системы доставки пептидных клеток проникающим. 34 В частности, ЗИФ-опосредованной доставки не поставить под угрозу деятельность плавленого ферментативной груза и способствовало высокие уровни цитозольного доставки. В совокупности эти данные показывают потенциал области ZIF для облегчения эффективного и легкое доставку белков, и, возможно, более разнообразные типы макроМолекулы, в клетки.
Здесь подробная шаг за шагом протокол о том, как реализовать ZIF технологии для доставки белка в клетках млекопитающих представлена. Ранее мы построили набор одно-, двух-, трех-, четырех-, пяти- и шести пальцев ZIF домены, которые не обладают способностью связывать ДНК, в связи с заменой каждого из ДНК-связывающих остатков α-спиральные, но способных доставлять белки в клетках 34 (Рис 1). Производство и трансдукция Изумрудного GFP (EmGFP) в HeLa клеток, используя два пальца ZIF домен описано. Этот протокол является расширяемым почти любого белка, способного растворимого выражения в кишечной палочки и практически любой млекопитающих типа клеток. Ожидаемые результаты предоставляются и стратегии для максимизации производительности этой системы также обсуждается.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клонирование
- Получить аланин-замещенных двумя пальцами ZIF домены, которые были субклонировали в вектор экспрессии системы ПЭТ-28 и доступны по запросу (ПЭТ-2F-ZIF). 34
- ПЦР-амплификации EmGFP из плазмиды изумрудно-pBAD с праймерами 5 'XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; Xma сайт я жирным шрифтом) и 3 'SacI-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3 " ; Sac сайт я жирным шрифтом).
- Использование 5 нг матричной ДНК, 10 мкл 10х буфера полимеразы, 1 единицы (и) полимеразы Taq ДНК, 0,2 мМ каждого дНТФ и 0,2 мкМ каждого праймера в 100 мкл раствора с остальной объем составил дистиллированной / деионизированной воды , Использование условий велосипедные: 95 ° C в течение 5 мин; 30 циклов 95 ° С в течение 30 сек, 55 ° С в течение 30 сек и 72 ° С в течение 1 мин; 72 ° С в течение 10 мин. Очищают продукт ПЦР с помощью гель-extracti, и определить концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра измерения ABS 260 х 50 мкг / мл.
- Дайджест ПЭТ-2F-ЗиФ и вставка, кодирующий EmGFP рестриктазами XMA I и Sac I, в рекомендуемой буфере в течение 3 ч при 37 ° С с использованием 10 U фермента на 1 мкг ДНК. Визуализация ДНК электрофорезом в агарозном геле с использованием флуоресцентного красителя интеркалирования, например, бромистым этидием.
- Очищают расщепленной ДНК через набора для экстракции геля и определяют концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра измерения ABS 260 х 50 мкг / мл.
- Перевязывать очищенный EmGFP-кодирующей ДНК в 50-100 нг ПЭТ-2F-ZIF с помощью 1 ед Т4 ДНК-лигазы, по крайней мере, 1 ч при комнатной температуре. Для достижения наилучших результатов, проводить реакцию лигирования с использованием 6: вставка изображений в векторные молярное соотношение 1.
- Оттепель 50 мкл любых химически компетентных XL-1 синий кишечной палочки клеток на льду и аккуратно перемешать с 10-20 нг лигированного рЕТ-2F-ЗИФ-EmGFP.
- Держите на льду в течение 30 мин. Тепловой удар смесь при 42 ° С в течение 90 сек и восстановления клеток в 2 мл Супер оптимального бульона с катаболитной репрессии (SOC) в течение 1 часа при 37 ° C при встряхивании.
- Распространение 100 мкл восстановления культуры на лизогении бульона (LB) агаром с 50 мкг / мл канамицина, и инкубируют O / N при 37 ° С.
- На следующий день, инокуляции 6 мл супер бульон (СО) или LB культуры, содержащей 50 мкг / мл канамицина с одной колонии с LB агаром и культуры O / N при 37 ° С.
Примечание: ПЦР колоний с использованием праймеров 5 'XmaI-EmGFP и 3' SacI-EmGFP может быть использован для идентификации положительных клонов до минипрепаративную. - Очищают ПЭТ-2F-ЗИФ-EmGFP по минипрепаративную и подтвердить плазмиды путем секвенирования ДНК с использованием промотора Т7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').
2. Экспрессия и очистка
- Оттепель 50 мкл химически компетентным BL21 Е. палочки клетки на льду и аккуратно перемешать с 100 нг ПЭТ-2F-ЗИФ-EmGFP плasmid. Transform, как описано в шагах 1,7-1,8.
- На следующий день, инокуляции 10 мл LB среды, содержащей 50 мкг / мл канамицина с одной колонии и расти O / N при 37 ° C при встряхивании.
- На следующий день, разбавить 10 мл O / N культуры в 1 л LB среде, содержащей 50 мкг / мл канамицина, 0,2% глюкозы и 100 мкМ ZnCl 2. Выращивают культуру при 37 ° С при встряхивании до оптической плотности при 600 нм (OD 600) 0,8 и индуцируют экспрессию белка с 2 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). После 6 ч роста при 37 ° С, урожай клеток путем центрифугирования при 5000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
Примечание: условия индукции сильно варьирует и зависит от стабильности белков выражается. не Монитор OD 600 каждые 30 мин до достижения OD 600 0,8 достигается. - Ресуспендируют осадок клеток в 5 мл буфера для лизиса (50 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 100 мкМ ZnCl 2, 1 мМ дитиотреитола (ДТТ), 1 мМ MgCl 2, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ), и 10 мМ имидазола, рН 8,0). Лизировать клетки на льду с помощью ультразвука со следующей установкой: 50% выходной мощности, 4 мин Время процесс с 5 сек на / 10 сек выкл промежутки времени. Избегайте перегрева решение.
- Центрифуга клеточного лизата при 25000 х г в течение 30 мин при 4 ° С и передачи супернатант в свежую пробирку. Для достижения наилучших результатов, выполните все следующие шаги при 4 ° С.
- Запуск супернатанта через колонку, заполненную предварительно 1 мл, уравновешенную Ni-NTA суспензии. Промыть смолу с 20 мл промывочного буфера (50 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 100 мкМ ZnCl 2, 1 мМ DTT, 1 мМ MgCl 2 и 30 мМ имидазола, рН 8,0).
- Элюируют белок с 5 мл буфера для элюции (50 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 100 мкМ ZnCl 2, 1 мМ DTT, 1 мМ MgCl 2, и 300 мМ имидазола, рН 8,0).
- Буфер обмена элюированную белок с буфером памяти (50 ммТрис-HCl, 500 мМ NaCl, 100 мкМ ZnCl 2, 1 мМ ДТТ, 1 мМ MgCl 2 и 10% глицерина, рН 8,0) и концентрируют белок, по крайней мере, 40 мкм с использованием спиновой концентратор центрифугированием в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Определить концентрацию белка в BCA или Бредфорда. Смешайте 2 мкл очищенных белков с 2 мкл 2 × SDS-PAGE красителем, кипятить на 95 ° С в течение 10 мин, а затем решить на 4% -20% Трис-Глицин SDS-PAGE для оценки чистоты белка (Рисунок 2).
3. Белки хранения
- Алиготе концентрированный белок, флэш-замораживание в жидком азоте и хранят при -80 ° С. Для слитых белков EmGFP, охватывают трубу с алюминиевой фольгой, чтобы защитить белок от света.
- Избегайте повторного замораживания и оттаивания раствора белка. Примечание: ЗИФ-слитые белки являются стабильными при этих условиях, по крайней мере 1 месяц. Пожаловаться или> 4 месяц хранения может привестидля осаждения белка или фотообесцвечивание EmGFP.
4. Белки трансдукции
- Поддержание HeLa клеток в среде Игла в модификации Игла (DMEM), содержащей 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков противогрибковое при 37 ° C в полностью влажной атмосфере с 5% CO 2.
Примечание: Клетки пассировать более чем в 30 раз не рекомендуется для белка трансдукции. - Предварительное покрытие 24-луночный планшет с 500 мкл 50 мкг / мл поли-лизина от 30 до 60 мин при 25 ° С. Семенной клеток на 24-луночный планшет при плотности 2 × 10 5 клеток на лунку. В 24 ч после посева, или только клетки между 80% -90% сливной, извлекайте носитель из каждой лунки и промыть 500 мкл подогретого бессывороточной DMEM (SFM).
- В каждую лунку добавьте 250 мкл SFM, содержащего 2 мкМ ЗИФ-EmGFP белка и 100 мкМ ZnCl 2. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 1 часа. Примечание: ZIF доменов проникать в клетки прimarily через макропиноцитозом, 34, который является механизмом энергии зависит. Таким образом, клетки должны быть инкубировали при 37 ° С в течение эффективного интернализации белка.
- Удалить носитель из клеток и мыть три раза 500 мкл кальцием и магнием, свободных забуференный фосфатом физиологический раствор Дульбекко (DPBS) с добавкой 0,5 мг / мл гепарина. Примечание: Гепарин необходимо удалить поверхностно-св занный белок, который может осложнить вниз по течению анализов.
- (Необязательно) Повторные обработки до трех раз за повышенной доставки.
- Изолировать обработанных клеток сразу же после того, как гепарин мыть расщеплением 0,05% трипсин-ЭДТА при 37 ° С в течение 2 мин. Повторное приостановить отдельные клетки в 0,5 мл DPBS с добавлением 1% FBS.
- Измерьте интенсивность флуоресценции каждого образца с помощью проточной цитометрии 35, используя флуоресцеинизотиоцианат (FITC) канала (рисунок 3). Отрегулируйте вперед рассеяния (FSC) и боковое рассеивание (SSC), чтобы поместить населениепроценты по шкале, гарантируя, что популяции с различными свойствами решаются друг от друга.
- Сбор 10000 живые события для каждого образца и анализировать данные с помощью проточной цитометрии анализа данных программного обеспечения. 36 Нормализация флуоресценции HeLa клеток, обработанных ЗИФ-EmGFP с этими клетками, обработанными только SFM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Двумя пальцами ЗИФ-EmGFP слитые белки могут быть выражены в E. палочка с> 95% гомогенности и высокой урожайности (> 25 мг / мл) (Рисунок 2). В общем, одно- и двумя пальцами слитые белки ZIF могут быть получены в количествах, почти идентичных тем, которые дикого типа немодифицированного белка. Тем не менее, в некоторых случаях, пяти- и шести пальцев белки ЗиФ слияния не могут быть произведены в доходности достаточно высоких для последующих применений.
Непосредственное применение два пальца ЗИФ-EmGFP белка на HeLa клетки в течение 90 мин при 37 ° С приводит к увеличению зависимости от дозы в EmGFP флуоресценции (3А). Важно отметить, что нет флуоресценции не наблюдается при отсутствии домена НПЧ. Ранее мы наблюдали, что почти 100% клеток флуоресцентные после обработки только 2 мкМ двумя пальцами ЗИФ-EmGFP белка, и что HeLa клетки, обработанные НПЧ слитого белка являются позитивными для EmGFP флуоресценции при концентрации белка столь же низко как 0,25 мкм (рис 3б).
Рисунок 1. Структура и последовательность белка цинка пальца. (Top) Кристаллическая структура домена одного цинк-пальцем (ZIF). Боковые цепи консервативного Cys и его остатков согласованные с Zn 2+ ионов показаны как палочки (PDB ID: 2I13). 37 (внизу) Последовательность области НПЧ. Стрелки и цилиндры указывают Β-листы и α-спирали вторичные структуры, соответственно. В α-спиральной ДНК-связывающий остатки, которые были замещены аланином выделены розовым. Положительно заряженные остатки, предсказанные в качестве посредника клеток интернационализации выделены светло-голубой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. SDS-PAGE очищенных одно-, двух-, трех- и четырех пальцев ЗИФ-EmGFP слитые белки. Были высказаны слитые белки ЗИФ-EmGFP в E. палочки и очищали с помощью Ni-NTA агарозы смолы. Элюированный белок анализировали на чистоту с помощью SDS-PAGE с использованием 4% -20% Трис-глицин гель. Не было отмечено значительное ухудшение или укороченные слитых белков ЗИФ-EmGFP.
Рисунок 3. ЗИФ-опосредованной доставки белка в HeLa клеток. () Интенсивности флуоресценции из HeLa клеток, обработанных с увеличением количества двумя пальцами ЗИФ-EmGFP белка. HeLa клетки, обработанные EmGFP белка одна перекрываются полностью с необработанными клетками. (В) нормированной интенсивности флуоресценции клеток HeLa обрабатывали последовательно с 2 мкМ OF два пальца ЗИФ-EmGFP белок. Интенсивность флуоресценции определяли с помощью проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь шаг за шагом протокол для доставки белка с помощью мобильного проницаемым цинка палец (ZIF) домены представлена. Домен ЗиФ не снизить активность плавленого ферментативной груза 34; позволяет для производства и очистки белков урожайности почти идентичны тем, которые наблюдаются при немодифицированного белка; и может транспортировать белки и ферменты в широком диапазоне типов клеток с эффективностью, которые превышают традиционные пептид или белок системы домена трансдукции клеток-проникающей. Вместе, эти данные свидетельствуют о широкой потенциал ZIF доменов за посредничество прямые поставки белка в клетках для широкого спектра применений.
Максимальная высота подачи белок, достигнутой ранее, используя только домен ZIF два пальца, несмотря на то, что продлен массивы трех- и четырех пальцев ZIF доменов несут больший положительный заряд. Эти результаты показывают, что ЗИФ-опосредованной запись клеток может зависеть от других, чем атаковать, Inc факторовЛУДИНГ стабильность белка или конформационные жесткость. ЗиФ домена опосредованной доставки белка также обнаружено, что зависит от энергии и, следовательно, требует, чтобы все клетки, обработанные белка инкубируют при 37 ° С. За счет использования низкомолекулярные ингибиторы различных эндоцитических путей, макропиноцитозом, и, в меньшей степени кавеолина зависит от эндоцитоза, были полны решимости быть основные пути для ЗИФ-опосредованного ввода данных в ячейку. 34 Примечательно, что в отличие от других белковых систем трансдукции, ZIF домены способен эффективно избежать эндосомы посредником высокие уровни цитозольного доставки расплавленного макромолекул груза, что подчеркивает потенциал этих областей, для достижения надежную доставку протеина.
По нашему опыту, плотность посева клеток является важным шагом для достижения высоких уровней белка трансдукции. Мы рекомендуем обработке клеток, когда они достигают 80% -90% слияния и ранее наблюдали, что клетки высевают на> 95% слияния шоу суб-Оптимальная мощность трансдукции, в то время как клетки высевали при низкой плотности (<50%) подвержены белково-индуцированные токсичности. Важно отметить, что для типов клеток с высоким отрыва тенденций, клетки культуральные планшеты, предварительно покрытые поли-лизина рекомендуется. Поли-лизин способствует прикрепление клеток через электростатические взаимодействия с отрицательно заряженными компонентами клеточной поверхности. Несмотря на то, α-спиральные ДНК-связывающие остатки каждого домена ZIF были удалены, чтобы устранить любую возможность признания ДНК, цистеина и гистидина, которые координируют с ионом Zn 2+, чтобы стабилизировать домена раза ΒΒα ZIF остаются нетронутыми. Таким образом, мы рекомендуем, чтобы любой буфер хранения быть дополнен по меньшей мере, 100 мкМ ZnCl 2, чтобы сохранить целостность белка.
Хотя область ЗиФ Ранее было показано, для доставки белков и ферментов в различных типах клеток, эффективность НПЧ доставки может также зависеть от обоих macromoлярные грузов и концентрация белка. Например, клетки обрабатывают двумя пальцами НПЧ-люциферазы слитого белка наблюдались для отображения максимума люминесценции при обработке 0,5 мкМ белка, со снижением активности при более высоких концентрациях, в то время как клетки, обработанные двумя пальцами EmGFP выставлены дозозависимое увеличение флуоресценции Интенсивность до 8,0 мкМ белка, и при последовательных обработок белка. Поэтому мы рекомендуем оценке способности клеток проникающего каждого уникального домена синтеза НПЧ во всем диапазоне концентраций.
Наконец, хотя еще и не продемонстрировали, мы ожидаем, что поставки домена ЗиФ является очень гибкой платформой, способной доставлять разнообразный спектр макромолекул в клетки. Например, это может быть возможно как ДНК и РНК, которые будут химически функционализированных на поверхность области НПЧ помощью гидролизуемого линкера, или временно трансфицировали в клетки путем инкапсуляции НПЧ доменов. Кроме того, efficiобразность ZIF доставки белка могла бы быть повышена путем рациональных усилий проектных, направленных на оптимизацию поверхностного заряда.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (DP1CA174426 Карлоса Ф. Barbas) и ShanghaiTech университета, Шанхай, Китай (до JL). Молекулярные графика были получены с использованием PyMOL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
- Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
- Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
- Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
- Elliott, G., O'Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
- Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
- Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
- Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
- Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
- Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
- Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
- Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
- Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
- Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
- Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
- Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
- Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
- Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188, 773-782 (2011).
- Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
- Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
- Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
- Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
- Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
- Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
- Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
- Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).
