Energi röntgen Tomography för 3D Elemental Kartläggning av enskilda nanopartiklar

Introduction

Syftet med denna metod är att tillhandahålla exakt bestämning av den tredimensionella fördelningen av element inom enstaka nanopartiklar. Detta utförs genom användning av energidispersiv röntgen (EDX) spektroskopi i kombination med en tomografisk rekonstruktion utförs i avsökningstransmissionselektronmikroskop (STEM).

Energidispersiv röntgenspektroskopi har länge använts som en teknik för att kvantifiera och rumsligt kartlägga element som förekommer i transmissionselektronmikroskopi prover. Med tillkomsten av hög vinkel ringformiga mörka fält (HAADF) STEM tomografi för tredimensionell avbildning av kristallina material ^1, var energiröntgen tomografi också föreslagits som en metod för att möjliggöra bestämning av elementära fördel i tre dimensioner ^2. Emellertid tidiga studier var begränsade på grund av utformningen av röntgendetektorer inom transmissionselektronmikroskop. Specifikt dessa traditionella deTector mönster hade relativt låg effektivitet insamling och mätte ingen signal på ett stort utbud av lutningsvinklar beror skuggning från provhållaren ^2,3. Införandet av nya geometriska mönster av röntgendetektorer inom (scanning) transmissionselektronmikroskop har gjort energiröntgen tomografi en livskraftig teknik och har lett till ett antal nya studier ^4-6.

HAADF STEM avbildning är en allmänt använd elektron tomografi bildåtergivningsläge och har möjlighet att tillhandahålla information om sammansättningen i specifika situationer som baseras på atomnummer känsligheten hos HAADF signalintensitet. Till exempel, är väl lämpat för studier av nanopartiklar med diskreta elementära regioner, t.ex. HAADF tomografi, väldefinierad kärna-skal-morfologier ^7, men kan inte användas när elementen har en mer komplicerad fördelning. Elektronenergiförlustspektroskopi (EELS) ger en kompletterande strategi för att bestämma tredimensionell elemespecialist- distributioner inom STEM ^8. I denna teknik förlusterna av infallande elektronstrålen energi används för att bestämma sammansättningen av provet och detta har fördelen av högre signal-brusförhållande än vad som ofta erhålls genom EDX spektroskopi ^9. Nackdelen med EELS är att flera spridnings överväganden införa strängare gränser på provet tjocklek, och i flera fall analys kompliceras av närvaron av fördröjd debut kanter eller överlappande spektrala egenskaper. Således är EDX spektroskopi ofta bättre lämpade för att studera tunga element såsom de ofta förknippas med katalytiska eller plasmoniska nanopartiklar system ^9. Dessutom, är det enkelt som ett fullt spektrum bild uppsamlas i EDX spektroskopi för att i efterhand identifiera oväntade element, vilket är svårare i energi filtreras transmissionselektronmikroskopi (EFTEM) och EELS grund av den frekvens av elementärt informationen överlappande eller ligga utanförspektralområdet av datamängden.

Den ideala provgeometri för EDX tomografi består av en nål format prov suspenderat i ett vakuum och inriktade längs tomografiska tiltaxeln ^4. Denna situation säkerställer att det inte finns någon skuggning av de EDX detektorer vid varje lutningsvinkel genom antingen provet eller preparathållaren. Emellertid är monteringen av de nödvändiga nålformade prover för nanopartiklar system utmanande ¹⁰ och provberedning består vanligen av bara överföra nanopartiklar på ett tunt kolfilm TEM stödgaller. Dessa nät används med en tomografi provhållare speciellt utformad så att den kan lutas till stora vinklar (≈ ± 75 °) men skuggning av EDX detektorer inom detta område av provlutningsvinklar är oundviklig och kan försämra kvaliteten på den resulterande tomografiska rekonstruktion. Denna skuggning är kännetecknande för en särskild mikroskop-detektor-hållare installation och kan därför avskräckabryts genom mätning av en korrekt kalibrering provet före förvärvet ^11. Enstaka sfäriska nanopartiklar är en idealisk kalibrerings exemplar som intensiteten av röntgen räknas från dessa prov bör förbli konstant över alla lutningsvinklar. Detektorn skuggning kan då kompenseras genom att antingen variera förvärvet tid vid varje vinkel eller genom multiplikation med korrektionsfaktor efter datainsamling. Den förstnämnda tillvägagångssättet används som detta minimerar elektron dos samtidigt maximera signal-brusförhållandet.

Protocol

1. Nanopartikel Syntes

1. Lös upp 10 g av Polyvinyl-pyrrolidon (PVP) (molekylvikt = 10000 g / mol) i 75 ml etylenglykol vid RT. Tillsätt 400 mg AgNOs ₃ till denna lösning.
2. Rör ihop lösning tills AgNOs ₃ är fullständigt upplöst och därefter värme på en värmeplatta till 100 ° C vid en konstant hastighet av 1 ° C min ^-1. Låt reaktionen fortgå vid 100 ° C under 1,5 h.
3. Lägg 175 ml destillerat vatten och kyl till rumstemperatur. Centrifugera vid 8000 xg, avlägsna supernatanten och återdispergering nanopartiklar i 50 ml destillerat vatten. Upprepa tre gånger.
4. Lös upp 500 mg PVP (55000 g / mol) i 500 ml etylenglykol vid RT. Tillföra denna lösning och 27,8 ml av Ag nanopartikelsuspension från föregående steg till en 1000 ml rundkolv. Upphetta kolven till 100 ° C under 10 min.
5. Lägga väte tetrachloroaurate trihydrat till 1000 ml vatten för att bilda en 0,2 mM lösning av AuCl ₄ ^- _(aq) 4 ^- _(aq) droppvis till lösningen som erhölls i det föregående steget för att erhålla Agau nanopartiklar av medelsammansättning Ag93Au7 (Ag 93 atom-% Au 7 atom-%), Ag82Au18 ( Ag 82 vid% Au 18at%), Ag78Au22 (Ag 78 vid% Au 22 på%) och Ag66Au34 (Ag 66 vid% Au 18 på%) respektive.
6. Kyl till RT och sedan tvätta med destillerat vatten tre gånger genom successiva omgångar av centrifugering vid 8000 xg, avlägsnande av supernatanten och återdispergering i 50 ml destillerat vatten. Lägga 0,05 ml av nanopartikellösning till 10 ml av DI-vatten.

2. TEM Provberedning

1. Pipettera cirka 0,05 ml av nanopartikellösning till en holey / kontinuerlig kol TEM rutnät. Använd en metall stöd används för TEM galler av beryllium att begränsa falska röntgenstrålar, även om en Cu eller Au rutnät räcker om det inte finns några överlappande toppar av intresse med Cu eller Au i provets EDX spektrum. Använda större migsh storlekar (t.ex., 200 mesh) för att minimera möjligheten av skuggning från nätet.
2. När nanopartiklar lösningen har torkat, rengör TEM galler genom att tvätta gallren i ren metanol eller etanol. Pipett 10-20 droppar över TEM galler medan den hålls med hjälp av anti-kapillära crossover pincett. Ta bort överflödig vätska efter varje droppe från nätet med hjälp av filterpapper rörde försiktigt på kanten av gallret.
3. Glödga rutnät på omkring 80 ° C (företrädesvis i vakuum) för att minska föroreningar i elektronstrålen genom att ta bort eller immobilisera eventuella kvarvarande föroreningar.

3. Karakterisering av Detector Skuggning

1. Lastnanopartiklar på TEM stödgaller i tomografi hållare och sedan in hållaren i TEM.
2. Vänta mikroskop vakuum för att nå en lämplig stabilt värde (under ca 1,8 x 10 ^-7 Torr). Öppna kolonn ventiler och säkerställa elektronstrålen kan ses på mikroskop fluorescerande screen.
3. Rikta in STEM.
   Obs: Här anpassningar för en Titan G2 sond sida aberration korrigerade STEM instrument som använts vid 200 kV tillsammans med en 2020 tomografi hållare beskrivs. Optimala procedurer inriktnings för andra mikroskop kan avvika från dem som beskrivs.
   1. I STEM diffraktion läge, använd en out-of-fokus skuggbild för att få provet till eucentric höjd. För att göra detta, luta scenen mellan ± 15 ° genom att trycka på Alpha Wobbler på fliken Sök och minimera alla rörelser av funktioner i provet genom att justera z-höjd.
   2. Flytta provet så att balken är över ett hål i provet och säkerställa att rätt kondensatoröppningen är korrekt linje med centre skuggan av öppningen i en under fokuserad bild av sonden. Vingla intensiteten och säkerställa en fokuserad sond inte rör sig för att kontrollera balk lutning förskjutning.
   3. Flytta provet så att ett område av amorft kol är i sikte och fokusera den varaär i diffraktion läge för att uppnå Ronchigram. Wobble fokus att observera avvikelser inom Ronchigram, och korrigera för dessa (t.ex. astigmatism och axiell koma) om det behövs.
4. Spåra konturerna av ruta (en nära centrum av nätet) genom att välja "Visa spår" i "Sök" fliken och efter konturerna av ruta medan avbildning. Detta gör det enkelt att säkerställa efterföljande mätningar utförs för nanopartiklar som är i mitten av gallerkvadrat i syfte att minska sannolikheten för skuggning från stödgallret. Om förvärvet utförs på en partikel i närheten av ett gallerstång ett par detektorer kommer att skuggas över ett mycket större område av provet lutningsvinklar.
5. Hitta en representativ partikel i den mellersta delen av ruta. Luta till maximal lutning utbud av hållaren (vanligtvis ± 70 °) medan bildbehandling för att säkerställa att nanopartiklar inte skyms av GRId barer på stora hållare lutar.
6. Förvärva HAADF och EDX spektrum bilder med hjälp av en konstant förvärvs tid (t.ex. 5 min) över hela skalan av lutningsvinklar (vanligtvis ± 70 °) med hjälp av vinkelsteg på mellan 5-10 °. Först få en översikt HAADF bild genom att klicka på Hämta i bildfönstret. Välj en kartläggning fönster runt nanopartiklar genom att dra lådan över bilden och tryck förvärva.
7. Utdrag karakteristiska röntgen räknas från EDX spektrumbilder för att bestämma tidsintervall för datainsamling genom att öppna de spektrala datacubes i bildbehandlingsprogram (som RAW-filer). Då, summera intensiteten i skivor av den datacube som motsvarar de kanaler av energin av topparna av intresse genom att använda slice2D och summan funktioner, skript ingår som kompletterande kod 1-3.

4. EDX Tomography Acquisition

1. Upprepa steg 3,1-3,5 för nanopartikel exemplar av intresse.
2. Förvärva HAADF ennd EDX spektrum bilder med tidsintervall som bestäms från detektorn skuggning karakterisering av föregående avsnitt för en rad prov lutning vinklar (± vanligen 70 °), på samma sätt som steg 3,6.

5. Rekonstruktion och visualisering

1. Samman lutning serie HAADF bilder i MRC-filen format genom en av följande metoder:
   1. Använd MRC författare i bildvisualiseringsprogram ¹² (Arkiv> Spara som> MRC författare) efter import HAADF Tifs som en "bildsekvens.
   2. Alternativt kan du använda tif_to_mrc funktion i tomografi programpaketet ^13.
2. Cross-korrelat HAADF bilder i det valda programmet för att få en grov inriktning av lutning serien. Spara inriktnings uppgifter som antingen en .sft fil eller som filen xcorr.txt. I tomografi programvara skapa ett filter i filter fönstret Setup som ger den skarpaste toppen i korskorrelationsfönstret. <ol>
3. Därefter trycker Gör på Beräkna Alignment Flyttar fönstret för att utföra korskorrelation för hela lutning serien. Upprepa justeringen tills lokala skift är under en pixel, vilket garanterar att spara alla skift filer vid varje steg som text.
   Obs: Noggrann inställning av filter som används när man utför korskorrelation är ibland nödvändig för att säkerställa en god anpassning av data tilt-serien.

I bildbehandlingsprogram, ladda förvärvade spektrala datacubes och extrahera kartor som är de summerade skivor av energikanaler som motsvarar de delar av intresse med hjälp av slice3d och summa skriptfunktioner, manus ingår som kompletterande kod 4 & 5.

Applicera anpassningar bestäms från HAADF bilder till de extraherade EDX elementär kartor. Utför detta i tomografi återuppbyggnadsprogram på fliken Applicera Justering genom att välja "Använd Växlar från Alignment Datavy".

Om det är nödvändigt, utföra lutnings axel justering avtomografi rekonstruktion programvara på HAADF bildserie och gäller både HAADF bilder och kartor EDX genom att markera "Använd Rättelser från Tilt Axis justering Task" i "Apply Justering fliken.

Rekonstruera tomografisk datauppsättning för varje extraherade elementära signaler EDX med hjälp av en samtidig iterativ rekonstruktionstekniken (SIRT) algoritm genomföras inom en tomografi programpaket, se till att de dimensioner återuppbyggnaden är densamma för alla element. I tomografi återuppbyggnadsprogram, ställa in parametrar i Rekonstruera volymfönstret (storlek volym, 20 iterationer, etc.) och tryck på Fortsätt. Säkerställa att rekonstruktionsparametrarna är desamma för varje element.

Utdrag orthoslices av de separata elementära rekonstruktioner genom att välja Bild> Staplar> ortogonala i bildvisualiseringsprogram ^12.

Konstruera och visualisera ytterligare orthoslices, volym och yta renderings från rekonstruktioner med hjälp av visualiseringsprogram. Ladda alla elementära rekonstruktioner och se till att vågen är korrekt inställd eftersom detta ofta inte överförs från .rec filer.

1. Välj återuppbyggnaden objektet i objekt poolen och högerklicka och välj orthoslice modulen för att extrahera en orthoslice. Högerklicka på återuppbyggnaden och välj volym rendering för att extrahera en volym rendering. Extrahera ett isosurface genom att högerklicka på återuppbyggnaden och välja isosurface.
   Obs: Automatisk segmentering genom tröskling är en mer robust metod men där signalbrusförhållandet är dålig manuell segmentering kan vara nödvändigt att avlägsna bullriga voxlar från utsidan av nanopartikelvolymen för isosurface visualisering.

Representative Results

Karakterisering av detektorn skuggning för en 2020 tomografi hållare i en Titan G2 ChemiSTEM visas i figur 1A. Detektorerna som användes här är den för den Super-X-detektor, i vilken fyra detektorer användes med lika azimutala vinklar av 90 ° runt den optiska axeln, vilket resulterar i en detektor rymdvinkel av större än 0,6 sR ^14. Karakterisering av detektorerna tillät bestämning av betald tomografiska hämtningstider som visas i figur 1B. Efter applicering av dessa förvärvs gånger räknas vid varje lutningsvinkel bör förbli ungefär konstant för enstaka nanopartiklar, som visas i figur 1C.

Bimetall Agau nanopartiklar, syntetiserade genom galvanisk ersättning reaktion undersöktes med hjälp av EDX tomografi i STEM. I denna reaktion, en lösning av AuCl ₄ ^- ärläggas till Ag nanopartiklar frön. Au reduceras på ytan av nanopartiklarna som Ag oxideras, vilket resulterar i en bimetallisk sammansättning och urholkning av den initiala fröet. Tidigare trodde man att Ag och Au bildade en homogen legering under denna process och att variationer i katalytiska och optiska egenskaper var helt enkelt på grund av urholkning och bulksammansättningsvariationer. Emellertid tredimensionell elementärt kartläggning utförs med hjälp av EDX tomografi avslöjade yta segregering inom de Agau nanopartiklar som syntetiseras av den galvaniska reaktionen (fig 2). Vid kompositioner med låg Au, nanopartiklarna uppvisar tydliga Au yta segregation. Eftersom innehållet ökar Au denna yta segregation växlar så att för de högsta Au innehåll det finns tydliga Ag yta segregation (Figur 3). Denna omkoppling av ytan segregation korrelerar med förändringar i utbytet av propargylamines i ett tre-komponent kopplingsreaktion syntetiserade av olikaent kompositioner av dessa Agau nanopartiklar.

Skär genom återuppbyggnaden som är normala till riktningen för elektronstrålen ger en jämförelse med standard tvådimensionella elementära kartor. De initiala kartorna innehåller uppgifter om sammansättningen summeras längs riktningen för strålen och detta kan ofta vara svårt att tolka på grund av överlappande regioner av olika kompositioner eller, i fallet med den Agau nanopartiklar undersöks här, på grund av inkluderandet av toppen och botten ytor i utsprånget (Figur 3A-C). Ta skivor genom rekonstruktion tillåter avlägsnandet av den intensitet i samband med de övre och undre ytorna av partiklarna och resulterar därför i en mycket tydligare visning av ytan segregering i detta fall (figur 3D-F).

Karakterisering av detektor skuggning med användning av en enda Agau nanopartikel. (A) De räkningar av Ag och Au röntgentoppar som en funktion av lutningsvinkeln från en enda Agau nanopartikel när som utnyttjar en uppsättning uppsugningstid (5 min). (B) Den hämtningstider bestäms från (A) och därefter användas för att förvärva tilt-serien. (C) De räkningar av Ag och Au röntgentoppar som en funktion av lutningsvinklar från en enda Agau nanopartikel Vid användning av hämtningstider från (B). Räkningarna förblir i stort sett konstant över alla lutningsvinklar. Från et al. Slater ^15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Rekonstruktion av en låg Au halt Agau nanopartiklar. (A) Orthoslice genom Au rekonstruktion. (B) Orthoslice via Ag rekonstruktion. (C) Linjeprofiler tagna genom orthoslices (A) och (B) visar tydligt Au yta segregation i nanopartiklar. (D) Yta visualisering av Ag och Au rekonstruktioner. Från et al. Slater ^15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Rekonstruktion av en hög Au halt Agau nanopartiklar. (A) 2D EDX karta över Au och (B) 2D EDX karta över Ag. (C) Linje profile tagen genom kartorna 2D EDX (A) och (B) visar att det är svårt att bestämma ytan segregationen i denna nanopartiklar från 2D-kartor ensam. (D) Orthoslice genom Au rekonstruktion. (E) Orthoslice via Ag rekonstruktion. (F) Linjeprofiler tagna genom orthoslices (D) och (E) visar den klara Ag yta segregation i nanopartiklar. (G) Yta visualisering av Ag och Au rekonstruktioner. Från et al. Slater ^15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Protokollet presenteras här ger en metod för att bestämma den elementära distribution av flera element nanopartiklar i tre dimensioner. I fallet med Agau nanopartiklar som presenteras här, är ytan segregering av båda elementen tydligt identifierade och har visat sig vara korrelerade katalytisk avkastning i en tre-komponent kopplingsreaktionen. Detta visar tydligt användbarheten av denna teknik för att hjälpa till att förklara de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos nanopartiklar system.

Som alltid är fallet i TEM, bör man i provberedning för att säkerställa bästa möjliga resultat. Noggrann tvättning och glödgning av gallren efter avsättning av nanopartikel lösning är särskilt viktigt att undvika uppbyggnad av föroreningar kol genom den stora elektron dos som behövs för EDX tomografi. Den stora dosen som användes kan också leda till allvarliga skador på Holey kol filmer, särskilt om den tunna sektioner ofta mellan håls, men kiselnitrid stödfilmerna kan gynna oxidation av nanopartiklar ^16.

Korrigering av detektorskuggningseffekter är viktigt att få fram en exakt rekonstruktion, i synnerhet om den teknik som skall appliceras för kvantitativ kartläggning av elementära fördelningar i framtiden. Detta kan åstadkommas genom korrekta karakterisering av detektor skuggning och därefter variera elektrondosen till nanopartikeln. Alternativt kan skuggning kompenseras genom att multiplicera bilder spektrum med en korrektionsfaktor efter förvärvet. Men tillämpningen av denna teknik för att ge kvantitativ information i tre dimensioner är ännu inte möjligt på grund elektronstråle skador på nanopartiklar som begränsar röntgen räknar uppnås i varje spektrum bild.

Kalibrering krävs för att kompensera för EDX detektor skuggning som en funktion av lutningsvinkeln för en speciell mikroskop-detektor-hållare kombination. shadowing bör inledningsvis bestämmas med hjälp av ett prov som ger ingen variation i röntgen räknas för olika provlutningsvinklar och enskilda sfäriska nanopartiklar förväntas uppfylla dessa kriterier, när deras sammansättning är stabil under elektronstrålen över den tid det tar att förvärva tilt serier. Dessutom, för kristallina nanopartiklar, vinklar någon lutning vid vilken elektronstrålen är orienterad längs en större zon-axeln i nanopartikeln bör tas bort och nanopartikel bör vara tillräckligt liten för att undvika signifikant röntgenabsorption. Därför, när EDX spektrum bilder av en enda nanopartikel förvärvas över hela skalan av möjliga provlutningsvinklar med hjälp av en konstant förvärv tid, kommer alla variationer i den uppmätta karakteristiska röntgenintensitet bero på detektorn skuggning ensam. Förvärvs gånger, och därför dosen, sedan varieras i efterföljande förvärv för att kompensera för skuggning betyder att den totala signalen räknas är ungefär conkonstant för alla spektrumbilder som förvärvats i lutning serien.

I jämförelse med HAADF eller ål bildåtergivningslägen, är EDX tomografiska datainsamling fortfarande i ett mycket tidigt stadium. Trots införandet av röntgendetektorer med högre rymdvinklar huvud begränsning av EDX tomografi, vilket ofta är fallet för tvådimensionell EDX avbildning, är den låga signalen. Trots detta är en fördel att EDX spektroskopi kan hålla över EELS för vissa nanopartikelsystem i bestämningen av små mängder av tunga grundämnen i ganska stora nanopartiklar. Större flernanopartiklar (> 100 nm) är ofta väl lämpade för EDX studier eftersom de ger fler räknas och det finns färre problem med deconvolving spektrala överlappningar, men försiktighet bör vidtas för att använda högenergetiska röntgentoppar som genomgår liten absorption.

Totalt sett är EDX tomografi en utmärkt metod för att bestämma grundämnesfördelningar inom nanopartiklar i tre dimensioner, although begränsad till nanopartiklar som tål en relativt hög elektrondosen utan väsentlig skada. Ytterligare ökningar i de fasta vinklar röntgendetektorer inom STEM och ytterligare optimering av tomografiska provhållare kommer att tillåta denna teknik för att avancera ytterligare och bli en viktig metod i karakterisering av enskilda nanopartiklar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Titan G2 80-200 STEM	FEI		With Super-X detector
2020 tomography holder	Fischione
Carbon film on 200 mesh copper grid	Agar Scientific	AGS160
EDX Acquisition software	Bruker		Esprit
Tomographic alignment and reconstruction software	FEI		Inspect3D, alternatives available
Tomographic alignment and reconstruction software package	University of Colorado		IMOD, alternatives available
Visualisation software	FEI		Avizo, alternatives available
Image processing software	Gatan		Digital Micrograph, alternatives available
Image visualisation software	Open Source		Fiji, alternatives available
Polyvinyl-pyrrolidone	Sigma-Aldrich	856568
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich	V900208
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	209139
Benchtop Centrifuge	Thermo Scientific	75007200
Round bottom flask	Sigma-Aldrich	Z41,452-2	1,000 ml
Hydrogen tetrachloroaurate trihydrate	Sigma-Aldrich	520918