Summary
סחר קולט מודולציה היענות איתות ותא לligands והוא, עצמו, מגיב לתנאי תא, כוללים איתות מושרה ליגנד. כאן אנו מתארים טכניקה חזקה וגמישה לכמותית הערכת סחר קולט תוצאת משימוש בסמים באמצעות immunolabeling וניתוח colocalizational.
Introduction
קולטנים, במיוחד קולטני חלבון G בשילוב (GPCRs), באופן שיגרתי נסחרים intracellularly, ומתא השטח 1. תהליכי complexly מתוזמרים ופיקוח הדוק אלה מכתיבים משלים קולט זמין של התאים ולהסדיר את פעילות קולטן זמנית, הפחתת רגישות, וresensitization 2-4. חשוב לציין, תהליכים אלה מגיבים לסביבות סלולריות כוללים פעילות קולט תוצאת משימוש בסמים או חוסר פעילות. כלומר, הפעולות של ligands בקולטנים יכולות לשנות סחר תאיים של קולטנים אלה, ובכך לשנות את היענות תא. באופן זה, ligands החיצוני להפעיל עוד יותר השפעות על תפקוד תא, אפילו מעבר למפלי שליח למפעיל קלאסיים 5,6.
בחינת שינויים בסחר קולט מושרה היא קשה. כל הטכניקות הזמינות כרוכות מגבלות. מבחני הגנת ביוטין שימשו למוניםאוכלוסיות קולטנים משטח טור. קולטנים אלה biotinylated וtimecourse של immunoprecipitations מתבצע לכמת את הירידה בקולטנים biotinylated לאורך זמן. טכניקה זו בעצם עוקבת אחר השפלה ההדרגתית של ראשונית, שכותרתו, אוכלוסייה של קולטנים 7, והוא מאוד שימושי בבניית קורסים של תהליך זה זמן. למרבה הצער, assay זה אינו יכול לפקח על כל תהליך אחר מאשר השפלה של הבריכה המקורית של קולטנים, כגון הפנמה, מחזור, או קולטנים חדשים. כמו כן, התוספת של נוגדנים בטווח 150kDa לקולטן בטווח 50kDa יכולה לשנות הסחר של קולט 8,9, וטכניקה זו עלולה להיות קשה לשימוש עם קולטנים נמוכים ברמת ביטוי.
נהלים אחרים להשתמש בשיטות שונות כדי לזהות תאי סחר תאיים (למשל, endosomes, וכו ') ולהעריך colocalization עם קולטנים של עניין. זה כולל אותנודואר של מערכות Heterologous להביע ניאון חלבון מתויג מבני chimeric של קולטנים וסמני תא (GTPases למשל, ראב-המשפחתי). זה פוטנציאל מאפשר שימוש בLive- תא הדמיה, הסרת נושאים הקשורים לקיבעון וpermeabilization. בעוד רב עוצמה, אסטרטגיה כזו סובלת מאותן המגבלות של מערכות Heterologous באופן כללי: השפעות תג ורמת ביטוי בסחר בהתנהגות וחוסר תאימות עם סוגים יותר מבחינה פיזיולוגית נציג תא. יותר עממי, צבעים משמשים לתייג תאים תאיים בקלות (למשל, lysosomes, לכאורה) 10. צבעים, לעומת זאת, יכולים חסרי ייחוד (כל האברונים חומצי במקרה של צבעים לlysosomes) ולא להעריך סחר באמצעות תאים אחרים. ובכל זאת, טכניקות אלו מאפשרות שליטה רבה יותר במערכת ותנאי ניסוי ועשויות להפיק תועלת משיטות ניתוח colocalization שהוצגו כאן, למטה.
שיטת wדואר נוכח כאן מזקק את המעקב של סחר קולט ידי colocalization. באמצעות immunocytochemistry (ICC) לתייג סמנים מתאימים, ניתן לזהות תאים תאיים שונים מרובים. זה גם מאפשר השימוש בתרביות תאים ראשוניים מבחינה פיזיולוגית-רלוונטיות במקום של מערכות Heterologous. פרוטוקול ICC זה כרוך תיקון התאים של עניין לפני התיוג; זה מאפשר תיוג בנקודת זמן ספציפי הבאים טיפול תרופתי (ים). זה מייצר "תמונת מצב" של עמותות קולט-תא העולמיים בנקודת הזמן ש. עם נקודתי זמן מרובים, timecourse של שינויי סחר יכול גם להיות בנוי.
בקצרה, התאים שטופל בתרופה, שכותרתו לקולט והתא תאית של עניין, confocally צילם, וphotomicrographs מנותחים לכמת colocalization של קולט ותא 11 מתמטי. בשימוש שלנו, בדקנו את colocalization של קולט עם ראB5, Rab11, וlysosomal הקשורים חלבון הקרום 1 (LAMP1). סמנים אלה לזהות endosomes המוקדם, endosomes מחזור, וlysosomes, בהתאמה. צעדי colocalization אלה פועלים כשליחים לתהליכי העל של הפנמה, מחזור, והשפלה 12.
כמו בכל הטכניקות, כמה מגבלות יש לשקול. בשל הצורך לתמונה כל נוירון הבודד ניתח, טכניקה זו יכולה להיות די עתירת עבודה בהתאם למספר התנאים ונקודתי הזמן המעורב. גם כל immunolabeling חייב להתמודד עם ההשפעות על ultrastructure הסלולרי, לוקליזציה חלבון, ונגישות epitope נגרמות על ידי קיבוע וpermeabilization 13.
למרות מותאם במקור לשימוש עם תרבויות עיקריות של נוירונים חושיים ראשוניים, שיטה זו היא רחב תואמת עם מודלים תרבות מצופה monolayer אחרים.
השימוש בmeasur לכמת באופן מתמטידואר של colocalization הוא, בעיקר, הרבה יותר מאשר מתודולוגית קפדני טכניקות קודמות שימשו להערכת שינויים בסחר בקולט, שלעתים קרובות יש לסמוך על אמצעים מעורפלים, סובייקטיבי כגון שכבות רב-ערוצים חזותי-בדקו 14.
טכניקה זו שימושית במיוחד עבור תאימות רחבה עם in vivo התערבויות (לפני דור התרבות העיקרי), במבחנה התערבויות (בצמיחת התרבות), ותיוג שונים מטרות 15. ככזה, הוא יכול להיות מותאם לשאלות מחקר רבות ושונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה הוא רחב תואם עם מודלים שונים מצופה monolayer תא / רקמת תרבות, משטרי טיפול תרופתי, ומטרות תיוג. כך בשימוש בפועל, פרמטרים ספציפיים רבים ישתנו בהתאם לעיצוב ניסיוני. כאן, אזכור של הפרמטרים המוגדרים על ידי משתמש אלה הם גנרי. תנאי דוגמא, כפי שכדי להשיג את תוצאות הנציג, כלולים בכתב נטוי.
1. פתרונות
- הכן חיץ כביסה ידי ערבוב 0.1M טריס שנאגרו hypertonic (300 מ"מ) ותמיסת מלח 0.05% Polysorbate 20; pH 7.4 ב RT.
- הכן חיץ חסימה. ל0.05 M טריס שנאגרו hypertonic (300 מ"מ) מלוח להוסיף 0.05% Polysorbate 20, 3% הסרום אלבומין שור (BSA) ושל 0.1% ג'לטין עור דג קר ולהתאים את ה- pH 7.4 ב RT.
- הכן diluent נוגדן ידי הוספת 0.05% Polysorbate 20, BSA 1%, 0.1% ג'לטין עור דג קר ל0.05 M טריס שנאגרו hypertonic (300 מ"מ) מלוח ולהתאים את ה- pH 7.4 ב 4 o C.
הערה: pH של מאגרי טריס הוא טמפרטורה תלויה. כלומר, שינוי בטמפרטורה ישנה את ה- pH של התמיסה. לעקביות, מאגרים אלה תמיד צריכים להיות מותאמים pH בטמפרטורה שבה הם ישמשו.
תרבות 2. תא
הערה: פרוטוקולי תרבות התא מתאימים ישתנו בהתאם לסוג תא (ים) המשמש. נהלים אלה חייבים להיות מותאמים בנפרד. מתודולוגיות תרבית תאים מפורטות זמינות, כולל 16. הליך דומה שימש כדי להשיג את תוצאות הנציג, עם ההבדלים הראויים לציון:
- נוירונים גרעיני שורש הגבי תרבות מבעלי החיים מבוגרים כפי שתוארו 12. השתמש מדיום גידול המבוגר-נוירון לתרבות התאים. להפחית את צפיפות תאי גלייה ידי preplating, ולא גלוטמט. התוצאה היא תרבות נוירון גליה מעורבת גדלה על coverslips זכוכית 12 העגול עם לפחות 30-60 נוירונים לכל צלחת ותאי גלייה הנלווית גדלה approximatconfluency 40% איליי. יש לציין כי תאי עצב בתרבות עיקרי לא לשכפל ויהיה דחפו את הצלחת על ידי גליה תרבותית משותפת אם גליה מותרת לגדול יתר על המידה. על מנת להימנע המשפיע על תאי העצב, הפחתה פיזית של מספרי גליה עדיפה על שיטות תרופתיות כימיות /.
הערה: למטרות פרוטוקול זה, אנו מניחים כי התאים של ריבית גדלו בניסוי-רצוי מדינה ומצופית שכבה. אנו מוצאים כי ציפוי על coverslips זכוכית 12-סיבוב ב 24 צלחות גם להיות נוח ביותר. כל הכרכים והנהלים שתוארו מתאימים לcoverslip אחד ובאחד מצלחת גם 24.
3. טיפול התרופתי של תאים בתרבית
הערה: רציף מרובה, או חופף, טיפולים תרופתיים אפשריות. התרופות, מינונים / ריכוזים, ומשכי חשיפת שימוש יהיה תלוי בניסוי הספציפי.
- הסר את מדיום גידול המקורי 16 הערה: חשוב שכל אחד לשכפל עצמאי (בדרך כלל תרבות צלחת 24 גם יחידה) מכילים את אותו מצב שליטה משותף. זה יאפשר נורמליזציה של נתונים במשכפל, אשר מתקנת לשונות הבין-משפט.
- דגירה התאים בתנאי גידול המקורי 16 ל- 48 שעות.
- לטיפולים תרופתיים שלאחר מכן, חזור על שלבים 3.1 ו -3.2 עם 1 Deltorphin מיקרומטר, 1 SNC80 מיקרומטר, או רכב ודגירה של 60 דקות 12. Solubilize deltorphin השני במים וsolubilize SNC80 ב 10 מ"מ ב -40 מיקרומטר HCl וsonicate, בדילול מלא עד 1 מ"מ במים.
הערה: פרוטוקול זה מניח את התרופה (ים) כבר solubilized כזה שהם יכולים להיות מומסים בריכוז הרצוי (ים) במדיום הגידול שנבחר. נהלים מתאימים לsolubilization כזה ישתנה בהתאם לסמים בשאלה וחייב להיות מותאם בנפרד. - לשטוף את התאים בעדינות, שלוש פעמים, עם ~ 1 מיליליטר של חיץ כביסה לכביסה. לבצע כל לשטוף בעדינות על ידי aspirating הנוזל מהבאר, ואז מייד, ובעדינות, מילוי היטב עם פתרון טרי, כרצוי (במקרה זה עם חיץ כביסה).
4. קיבוע וImmunocytochemistry
הערה: מטרות התיוג הספציפיות תשתנה על ידי ניסוי. בשימוש שלנו, אנחנו כותרת קולטנים דלתא אופיואידים (דור) וRab5, 11 ראב, וLAMP1, כפי שנדון. הנוגדנים הספציפיים המשמשים יהיו תלויים בניסוי הספציפי. תנאי תיוג אופטימליים תלויים בנוגדן הספציפי (ies) משמש. דיון מלא יותר של נושא זה הוא בהמשך.
- תקן את התאים על ידי טבילה ב~ 300 paraformaldehyde μl 4% בנאגרו מלוח 0.1 M פוספט במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
הערה: חשוב שסעיף 4%פורמלדהיד להיות מוכן טרי בגלל autofluorescence שנגרם על ידי השימוש בparaformaldehyde בעבר-הקפוא. - לשטוף את התאים בעדינות, 3 פעמים, עם ~ 1 מיליליטר של חיץ כביסה לכביסה, כפי שתואר ב3.3.
- דגירה התאים ב300 μl חיץ חסימה לשעה 2 ב RT.
- דגירה התאים עם נוגדנים עיקריים ב300 μl של diluent נוגדנים במשך 48 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. בשימוש שלנו, נוגדנים עיקריים נגד דור (ארנב נגד דור) ואחד: Rab5 (עכבר אנטי-Rab5), ראב 11 (עכבר אנטי-Rab11), וLAMP1 (עז נגד LAMP1).
- לשטוף את התאים בעדינות, שלוש פעמים, עם ~ 1 מיליליטר של חיץ כביסה לכביסה, כפי שתואר ב3.3.
- דגירה התאים עם נוגדנים משני מצומדת לfluorophores שונה (ראה דיון בהמשך) ב300 μl של diluent נוגדן עבור שעה 1 ב RT. בזה, וכל השלבים הבאים, להגן על התאים מפני אור. כדי להשיג את תוצאות הנציג, להשתמש ירוק פולטות נגד ארנב fluorophore מצומדות וeithאה אנטי עכבר fluorophore מצומדות פולטות אדום או אנטי-עז fluorophore מצומדות פולטות אדום.
- לשטוף את התאים בעדינות, 3 פעמים, עם ~ 1 מיליליטר של חיץ כביסה לכביסה, כפי שתואר ב3.3.
- הסר את coverslips 12 העגול מ -24 צלחות גם על ידי השארה ~ 1 מיליליטר של חיץ כביסה בכל טוב, מחזיקה את הצלחת ב ~ 45 מעלות, ולמנף את coverslip מעל הרצפה גם באמצעות מלקחיים בסדר. Coverslip יבוא לנוח על הקיר גם, מהמקום שבו יכול בקלות להסיר באמצעות המלקחיים.
- הר coverslips, תא בצד למטה, על שקופיות מיקרוסקופ עם אנטי דהייה הרכבה בינונית.
5. הגדרות מיקרוסקופ
- באמצעות מטרת הגדלה גבוהה (100X), אתר ראשון תא נציג להיות צילם באמצעות epifluorescence.
- הגדר את ההגדרות לכידת תמונה כדי להקליט 8 ביט תמונות TIFF דחוסות של כל ערוץ שכותרתו (לצורך זיהוי של כל fluorophore משמש דוגמא, 488 ננומטר ו -594 ננומטר), לתמונה כל רצף ערוץ (או על ידי קו או מסגרת), ו4-6 סריקות ממוצעת לתמונה הסופית. רזולוציית תמונה אופטימלית תהיה מיקרוסקופ ספציפי, אבל 1024 x 1024 בדרך כלל מניבה תוצאות טובות.
- לעבור לנתיב ההדמיה confocal ולהתמקד לZ-מטוס דרך מרכז התא.
- לייעל (בדרך כלל יחידת 1 אוורירי) חריר, כוח הלייזר, ומתח צינור מכפיל (רווח) וקוזז לכל ערוץ. לשמור / להקליט את ההגדרות האלה. השתמש באותן הגדרות מיקרוסקופ הדמיה כל התאים שכותרתו לכל זוג יעד נתון באותו לשכפל.
הערה: תהליך זה בדרך כלל יגרום photobleaching די בכך שתא זה לא צריך להיות צילם לניתוח.
6. הדמיה
- באמצעות מטרת הגדלה גבוהה (למשל, 100X), אתר ראשון תא להיות צילם באמצעות epifluorescence.
- לעבור לנתיב ההדמיה confocal ולהתמקד לZ-מטוס דרך מרכז התא. אניו זמין, זום תוכנת שימוש / יבול כדי להגביל את אזור הסריקה לתא של עניין.
- צלם תמונות בכל ערוץ שכותרתו באמצעות ההגדרות שנקבעו בעבר. חזור על שלבים 6.1-6.3 לתמונה 15 או יותר תאים לכל מצב ללשכפל כדי להבטיח מדגם מספיק.
7. colocalization ניתוח
- פתח את הזוג של תמונות (לדוגמא, 'ירוק' ו 'אדום') של תא בImageJ. השתמש בתמונה> צבע> מיזוג ערוצים ... הפקודה כדי ליצור תמונת RGB.
- צייר בחירה סביב התא של עניין. השתמש בתוסף ImageJ "PSC colocalization" (11; זמין מhttps://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) לכמת colocalization של המטרות בתא שנבחר.
- רשום את המידה הרצויה colocalization (בדרך כלל r של פירסון 17). חזור על שלבים 7.1-7.3 לכל תא הדמיה. 8. נתונים נורמליזציה
- לחשב את הממוצע של ערכי colocalization המוקלטים של תנאי שליטה המשותפים של כל לשכפל של כל מצב תיוג.
הערה: לדוגמא, הממוצע של ערכי colocalization של נוירונים ב" רכב 48 שעות, רכב 60-דק "מצב סמים בכל אחד מ3 משכפל עצמאי בכל אחד מתנאי 3 תיוג (קולטן וכל אחד מתאים 3). - הכפל את האמצעים (-1) להניב לקזז עבור כל לשכפל בכל מצב תיוג. הוסף את הקיזוז לכל לשכפל בכל מצב תיוג לכל ערך colocalization בלשכפל את זה.
הערה: זה לנרמל את הנתונים כך שמדד colocalization ממוצע למצב שליטה המשותף הוא 0 בכל אחד לשכפל של כל מצב תיוג. - בריכה את הנתונים מכל משכפל של כל תנאי תיוג.
הערה: שינויים בcolocalization כעת ניתן לנתח על פני משכפל. אנאלי סטטיסטייסיס יהיה תלוי עיצוב ניסיוני, אבל יהיה בדרך כלל כרוך בניתוח-של-שונות (ANOVA) ואחרי בדיקות מתאימות פוסט הוק (למשל, Tukey). למשאבים סטטיסטיים, ראה, למשל, 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש בטכניקה זו, ניתן לכמת שינויים בסחר בהודעת הפנמת קולטן הבאים שני טיפולים תרופתיים כרוניים / ממושכים וחריפים. לאחר טיפולים תרופתיים, קיבעון, ותיוג, photomicrographs שני ערוצים ברזולוציה גבוהה נלכדים של כל תא של עניין. נציג תמונות עשויות להיות משולבות עם colocalization כוזב בצבע כדי ליצור דמויות המחשה (איור 1). ניתוח colocalizational שלאחר מכן, כפי שתואר, תניב תוצאות כמותיות של colocalization יעד היעד (למשל סמן קולט-תא,). נתונים אלה עשויים לשמש כדי להשוות שינויים ב, במקרה זה, סחר קולט הנגרם על ידי הטיפול התרופתי (ים) (איור 2).
איור 1. photomicrographs נציג של תיוג הקולטן ותא-מרקר עם FALמפות colocalization SE-צבע. תרבויות עיקריות של נוירונים חושיים גרעיני שורש הגבי נחשפו לממושך (48 שעות) וטיפולים אקוטיים (שעה 1) סמים (תוויות ציר שמאלית). רק מצב אחד ממושך מוצג תוצאות נציג. התאים אז היו immunolabeled לקולטנים אופיואידים דלתא (דור) וסמן של endosomes המיחזור (ראב 11) עם מובחן עיקרי-תיכוני (fluorophore מצומדות) זוגות נוגדן (תוויות ציר עליונה). התאים היו צילמו על ידי מיקרוסקופ שני ערוצים רציף confocal (עמודה שמאלית, עמודה במרכז). נציג תמונות להראות שתי מטרות שכותרתו בשני תאי עצב. טופל נוירון אחד עם מורפיום הממושך ואחריו רכב חריף (למעלה). טופל נוירון האחר עם מורפיום הממושך אחריו deltorphin החריף השני (delt, אגוניסט דור; תחתון). בנוסף לניתוח הכמותי colocalizational לאחר מכן, תמונות נציג אלה עובדו ליצירת מפות בצבעים המלאכותיים colocalization (עמודה ימנית). sho ברים סולםw 10 מיקרומטר. מעובד מתוך 12 לפי הוראות CC BY-NC 3.0. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2. ציוני colocalization כמותי איור ניתן להשתמש כדי להשוות שינויים בסחר קולט הודעה הפנמה. תרבויות עיקריות של נוירונים חושיים גרעיני שורש הגבי נחשפו לממושך (48 שעות) וטיפולים אקוטיים (שעה 1) סמים (תוויות ציר x). רק מצב אחד ממושך מוצג תוצאות נציג. התאים אז היו immunolabelled לדור וסמנים של endosomes המוקדם, endosomes מחזור, וlysosomes. לאחר עשרות colocalization הדמיה נקבעו, מנורמל, ונקווה על פני 3-4 חזרות עצמאיות. הנתונים נותחו לאחר מכן על ידי ניתוח דו-כיוונית של שונות (ANOVA) עם פוסט הוק-HSD של Tukey. הנתונים מוצגים כמרווח ביטחון +/- 95% ממוצעים. * מציין p <0.05. כפי שניתן לראות, טכניקה זו אפשרה זיהוי של שינויים בסחר בהודעת הפנמה-דור הנגרמים על ידי טיפול אקוטי עם deltorphin השני, אבל לא SNC80 (שני אגוניסטים דור שונים). מעובד מתוך 12 לפי הוראות CC BY-NC 3.0. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו מותאם פרוטוקול זה לניתוח תרבויות העיקריות של נוירונים גנגליון שורש הגבי בוגרים (תאי עצב תחושתיים ראשוניים). גם זה יכול לשמש, עם שינוי קטן או לא, לתאים בתרבית מצופה monolayer רחב. ניתוח colocalizational ניתן גם בחתכי רקמה והכנות אחרות כגון 11, לעומת זאת רכיבי הטיפול התרופתי וקיבוע רקמה / הכנה לא יהיו מתאימים.
של עניין, יכולות לשמש גם שיטות ICC הציגו כאן, עם קיבוע מתאים והכנת רקמה, לבצע אימונוהיסטוכימיה כותרת כפולה בחתכי רקמה, ללא קשר לניתוח שלאחר מכן (למשל, 19).
פרוטוקול זה הוא רחב תואם מטרות תיוג שונות. כל coverslip של תאים מצופים יהיה כותרת כפולה. בדרך כלל, זה יהיה לקולטן של ריבית וסמן של אחד מהתאים של עניין. ישיהיו בדרך כלל תנאי תיוג מרובים על מנת לבחון colocalization קולט עם תאים שונים מרובים.
נוגדנים הם מטבעו משתנים. פרוטוקולי תיוג מתאימים ישתנו בין נוגדנים שונים. זה כולל ריכוזים מתאימים נוגדן, מתכוני חיץ, ונקודתי זמן. צריך גם לציין שהרבה שונה של אותו הנוגדן נחשבים הטוב ביותר להיות נוגדנים שונים. ככזה, שיטות תיוג וספציפיות נוגדנים צריכים להיות מאומתות, ובמידת הצורך מותאמת, לכל צירוף של רקמת נוגדן והיעד. השיטות המשמשות כאן הן נקודת התחלה שימושית. כאשר אימות תיוג, חשוב לבצע בקרה נאותה: זה כולל דוגמאות מעובד ללא תוספת של נוגדנים משני (לשליטה לautofluorescence) וללא נוגדנים ראשוניים (כדי לשלוט על תיוג המשני שאינו ספציפי).
ישנם גורמים רבים המשפיעים עלעיצוב של שיטות תיוג. שיקולי חלק מפתק המשפיע על השיטות שהוצגו כאן כוללים השימוש במאגרי טריס, מלוח hypertonic, Polysorbate, BSA, וג'לטין עור דג הקר. מאגרי פוספט יכולים לגרום לתיוג שאינו ספציפי גבוה יותר ועלולים ליצור אינטראקציה עם כמה conjugates נוגדנים המשמש פחותה. עם זאת, מאגרי טריס הם, כאמור, הטמפרטורה רגישה. ריכוזי מלח hypertonic להפחית תיוג שאינו ספציפי ע"י שיבוש אינטראקציות יוניות. ניתן להגביר עוד יותר את ריכוז מלח מעבר למה שצוין בפרוטוקול זה, אם תרצה בכך. Polysorbate 20 משמש כחומרים פעילי שטח / חומר ניקוי עדין יחסית. זה עדיף על פני Triton X-100, אשר כבר דיווח לשבש באופן משמעותי, או אפילו לפזר, קרומים ובכך לעוות את מבנה subcellular. ההכללה של ריכוז נמוך Polysorbate 20 בכל המאגרים שימושית בהפחתת תיוג שאינו ספציפי, כפי שהוא משפר את היסודיות של שוטף. BSA הוא סוכן חסימה נפוץ מיועדלכבוש אתרי חלבון מחייב שאינם ספציפיים ברקמות היעד. חלקם דיווחו כי BSA יכול לצבור ולהוביל לתיוג punctate שאינה ספציפי. אם בעיה זו מתעוררת, אפשר להחליף BSA עם חלב יבש ללא שומן או ג'לטין עור דג קר נוסף. ג'לטין עור דג הקר הוא מקור חלבון שאינו יונקים גם נועד לכבוש אתרי חלבון שאינו ספציפי מחייב תוך הצגת תגובתיות נמוכה לנוגדנים המכוונים נגד חלבונים יונקים 20.
למרות שלא צוין בפרוטוקול זה, זה אופייני להוספה, למאגר החסימה, סרום נורמלי מהמינים שבנוגדנים משני הועלה. ריכוזים אופייניים הם 1-3%. כפי שנראה להלן, טיפול בבחירת מין חייב להיות מופעל כדי למנוע reactivities הצולב.
כאשר גילוי שתיים או יותר מטרות fluorescently שכותרתו, הבחירה של שילובי fluorophore המתאימים היא חשובה במיוחד. זה חיוני שיהיה לי SEPA רפאים טובמנה על מנת למנוע crosstalk. יתר על כן, הבחירה של fluorophores תהיה תלויה בתצורה של מיקרוסקופ כדי לשמש (מסננים זמינים, קווי לייזר, וכו '). ספקי נוגדן fluorophore מצומדות יציעו ייעוץ על השילובים הטובים ביותר של המוצרים שלהם (למשל, 21). אנו מוצאים 488 nm- וfluorophores 594 ננומטר-נרגש להיות הזוג הטוב ביותר עבור כפול תיוג וניתוח colocalizational.
נוגדנים משני הם בדרך כלל מינים-reactive. כלומר, הם יהיו תווית כל נוגדנים המיוצרים על ידי מיני היעד. ICC פעמיים תיוג לכן דורש שטיפול יש לנקוט בבחירת מין המארח של הנוגדנים הראשוניים ומשניים על מנת להימנע מתגובה צולבת. לדוגמא, אם הפריימריס גדלים בארנב ועז, זה לא יהיה מתאים לשימוש משני-העלה עז. אם זמינות נוגדן אינו מאפשר הפרדת מינים כאלה, יש פרוטוקולים זמינים להשיג תיוג עם multipנוגדנים ראשוניים אותו מארח le (למשל, 22), אם כי יש לצפות באופן משמעותי יותר אופטימיזציה ואימות.
כשיטת זו מכמתת colocalization בphotomicrographs, זה הוא ביסוד הכרחי שכל מיקרוסקופיה להיות עקבית, באיכות גבוהה, ובאופן מדויק נציג של הדגימות צילמו. זה כולל גם את החומרה המשמשת (איכות אופטית, וכו ') ונהלים מסוימים ופרמטרים שנבחרו. יש משאבים מעולים זמינים להדרכה במיקרוסקופ המתאים 23,24, כוללים מיקרוסקופיה במיוחד עבור ניתוח colocalizational 11,17,25.
למרות עליונות מתודולוגיים רבה לשיטות כיסוי חזותיות, מדדי כמותיים של colocalization לא כמו יפה להשאיל את עצמם לדור של דמויות המחשה לפרסום. דמויות המחשה כאלה הן לעתים קרובות מועילות לקוראים והיעדרם עשוי להיות ביקורת על ידי revieweRS. מצאנו כי הכללת colocalization 'heatmaps' חזותי שווא הצבע להיות מועילה בבניית דמויות. תוסף ImageJ "colocalization מפת הצבעים" (זמינים מhttps://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/) שימושי ביצירת דימויים אלה. חשוב לציין, עם זאת, כי תמונות אלה יהיו המחשה אך ורק בהקשר של הטכניקה המתוארת כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מCIHR (MOP394808) וקנדה מחקר קתדרה לCMCEWO היה הנמען של מלגת פוסט-בוגר מNSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1,500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
References
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -B., Guan, J. -S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -Q., Zhang, Z. -N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. Discovering Statistics Using R. , SAGE Publications. Los Angeles, CA. (2012).
- Mattioli, T. -A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- The Molecular Probes Handbook. Johnson, I., Spence, M. , Life Technologies. Carlsbad, CA. (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , Springer. New York, NY. (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
