Summary
人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。
Abstract
体細胞への成人皮膚線維芽細胞およびその後の分化の誘導多能性幹細胞（性IPSC）の生成は、組織適合性の障壁を回避する自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、所望の系統に多能性状態とその後の完全な差別化の進行が原因関連する新生物の可能性とゲノム不安定性のiPS細胞技術の臨床翻訳のための障害のままです。最近、我々及び他の体細胞だけそれによって多能性状態の進行を回避する、定義された係数を用いてiPS細胞にも多能体性幹細胞の別の型に変換することができないことを示しました。具体的には、誘発された神経前駆細胞（iNPCs）へのヒト線維芽細胞の直接変換は、そのような細胞置換、疾患モデルとして、さまざまな用途のための新規な自己細胞供給源の可能性を告げますおよび薬剤スクリーニング。ここでは、タイムリーな制限のOct4、Sox2の、Klf4の発現、ならびにC-MycのことでiNPCsに皮膚生検とその効率的な直接変換することにより、成人ヒト一次線維芽細胞の単離を記載しています。 SOX2陽性神経上皮コロニーは、誘導の17日後に表示され、INPCラインはモノクローナル単離および拡張することにより効率的に確立することができます。誘導期の間に感染し、白血病抑制因子の補充のウイルス多数の正確な調整は、最大0.2％の変換効率を達成するための重要な要素を表しています。これまでのところ、患者固有INPCラインは12以上の継代のために拡張することができ、均一に、このようなネスチンおよびSox2の発現などの神経幹/前駆細胞の形態学的および分子的特徴を表示します。それぞれ、TUJ1およびGFAPに対して染色することによって判断されるようにINPCラインは、ニューロンとアストロサイトに分化させることができます。結論として、我々は派生と悲惨のための堅牢なプロトコルを報告しますこのような自家神経細胞置換および疾患モデルとして、生物医学的用途のための細胞源を提供するかもしれない安定拡張可能な神経前駆細胞へのヒト線維芽細胞のCT変換。
Introduction
2006年に山中らは初めて多能性状態1への体細胞の再プログラミングの可能性を示すことができました。この脱分化は、4つの転写マウス線維芽細胞でのOct4、Sox2の、Klf4及びc-Myc因子の過剰発現によって達成されました。生成されたいわゆる人工多能性幹細胞（iPS細胞）は胚性幹細胞（ESC）に機能的な等価性を示し、したがって、成体生物のすべての細胞型に分化することができます。後で性IPSCに再プログラム一年は、ヒト線維芽細胞2のために達成することができます。動物モデルにおける実験は、iPS細胞由来の細胞は、一般に、パーキンソン病（PD）3-5に、例えば 、細胞置換療法に使用することができることを実証します。しかし、性IPSCの使用に関連するいくつかの制限は、それらの治療の可能性を完全に実現するための障害物を表します。まず第一に、多能性状態への細胞の再プログラミングとその後品質管理は、一般的に大規模なので、高価な細胞培養の手順で得た時間がかかり、非効率的なプロセスです。第二に、性IPSCは、生物医学アプリケーションの前に、目的の所望の細胞型に再分化される必要があり、分化した集団中の残留多能性細胞の確率がかなりの腫瘍形成能力を保有し、したがって、細胞移植後6高リスクが表示されます。第三に、初期化プロセスは、通常lenti-またはレトロウイルス感染によって、再プログラミング因子を誘導することによって達成されます。宿主ゲノムへのこれらのウイルスの統合は、挿入突然変異誘発および/ または導入遺伝子7,8の制御されない活性化につながる可能性があります。非統合システムが挿入突然変異及びトランスジーン活性化の危険性を最小限にする、標的細胞への再プログラミング因子を送達するために開発されてきました。これらの導入遺伝子のないアプローチの例は、非組み込みを用いた細胞の再プログラミングされていますアデノまたはセンダイウイルス9,10、DNAベースのベクター11または組換えタンパク質13,14の合成mRNAを12または形質導入のトランスフェクションなどのDNAフリー法の適用。導入遺伝子を含まないiPS細胞の誘導のためのもう一つの有望な方法は、loxP配列で修飾されたレンチウイルスの再プログラミングの構築物の使用とのCre-loxP配列のDNA組換えシステム15,16を用いて、導入遺伝子のその後の欠失です。
細胞置換療法のための神経細胞を生成するために、より簡単な方法は、有糸分裂後のニューロン17-20への線維芽細胞の直接変換を表します。 Vierbuchen らは、転写の過剰発現は、マウス線維芽細胞17〜20％のニューロンの生成にASCL1、Brn2とMyt1l結果因子と報告しました。 2011年にはNeuroD1の過剰発現と組み合わせて、同じ3つの転写因子がノイへのヒト線維芽細胞の分化転換を可能にすることが、示されましたRONS 19。人為的なニューロンは、デュアルSMAD-とGSK3β-阻害20下ASCL1とNgn2の過剰発現によって生成することができます。注目すべきは、ニューロンへの線維芽細胞の直接変換をさらに拡大し、バイオバンクを許可していない非増殖性、有糸分裂後の細胞集団を生成します。
最近では、増殖性神経幹/前駆細胞集団への線維芽細胞の直接変換は、21-26を報告しました。明確にするために、すべてのこれらの細胞型は、このレポートに誘導される神経前駆細胞（iNPCs）と命名されます。 Han らは iNPCsを生成するBrn4、Sox2、c-Myc、およびKlf4を過剰発現します。一次組織または多能性細胞のいずれかに由来し、それらの神経幹細胞の対応と同様に、これらのiNPCsはtripotentialであり、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト21に分化することができました。当社グループは、Sox2の、Klf4の過剰発現を伴うわずかに異なる変換プロトコルを報告しました、およびc-Mycおよびわずか5日間誘導されたOct4-式。このアプローチでは、我々は再プログラミング22因子の完全な抑制を示し、マウス胚および成体の線維芽細胞から安定して増殖するiNPCsを生成することができます。性IPSCとは対照的に、iNPCsは、移植後の27腫瘍形成能を示さありません。我々はiNPCs 22臨床的に有用であることが実証された、脱髄の動物モデル、ミエリン欠損ラットに正常に変換細胞を使用しました。それまでは、NPCは唯一の多能性幹細胞または一次神経組織28-32から生成することができます。 iNPCsは凍結保存し、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトに分化することができますすることができ、安定拡張可能な細胞です。多くの努力は、ヒト細胞23,26,33,34に対するマウスから直接変換プロトコルを適応させるためになされています。 2012年には、線維芽細胞におけるSox2の単一因子の過剰発現は、マウスおよびヒトiNPCsを生成するのに十分であることが発表されました
いくつかの研究は、NSCの、または異なる動物疾患モデルにおけるそれらの分化対応の携帯の機能を実証します。ヒト多能性幹細胞から神経前駆細胞は、神経炎症性疾患、多発性硬化症35,36のマウスモデルに移植されています。 EAEにおけるhESC由来神経前駆細胞の適用性（実験的自己免疫性脳脊髄炎）-miceは最初2008年に示された35。多能神経前駆細胞は、マウスの脳の脳室に注入し、移植の結果EAEの臨床徴候の減少に編。 Kim らは、ヒトES細胞からのオリゴデンドログリア前駆体を生成し、EAE-マウスに脳室内のものを移植しました。移植は10日以上生存しなかったが、マウスは、神経機能および白質36において炎症誘発性免疫細胞の減少の有意な改善を示しました。幹細胞療法はまた、NPCのに成功し、それぞれの動物モデルで使用することができるように前臨床パーキンソン病の標的化のために適用されています。このために、前駆細胞は、いずれの多能性幹細胞38-40または41が使用された間葉系幹細胞から分化した胎児脳組織37から誘導しました。 2012年には、我々は、マウスiNPCsはミエリン欠損（MD）のラット22の脳に移植後のプロテオリタンパク質、主要ミエリンタンパク質成分を、生成することができることを示しました。その証明の原理実験治療applicabilによるiNPCsの性は、最初に証明され、すぐに別の研究32で確認しました。しかし、人間のiNPCsの治療的使用の完全な可能性が探求されていません。
ここでは、（i）皮膚生検を介して、成人患者からのヒト初代細胞の誘導、神経前駆状態にヒト線維芽細胞の（ii）の直接変換およびニューロンに分化するiNPCsの（iii）の能力の堅牢かつ統合されたプロセスを表示しますおよびグリア系統。このプロトコルの使用は、治療用途のための自家ヒト細胞の生成を高速化するのに役立ちます。
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Protocol
本研究で用いたヒト線維芽細胞は、ヴュルツブルク、ドイツの大学の倫理委員会によって同意し、倫理的なクリアランスを通知取得後の皮膚のパンチ生検から得た（倫理的な報告なし：11分の96 2011年6月10日の日付）。
1.パンチ生検
- 患者の皮膚を消毒。皮内に0.5〜1ミリリットルメピバカイン塩酸塩を使用して生検を（優先あまり日光にさらされる領域）から採取されるの皮膚の一部を麻酔し、滅菌3ミリメートル生検パンチを使用して、皮膚生検を準備し、DPBSで生検+ 1μL/ 1ミリリットルゲンタマイシンをすすぎ、削除脂肪。完全DPBS +ゲンタマイシン、吸引DPBSで二回の生検をすすぎ、ディスパーゼII（2.4 U / ml）で生検をカバーし、16インキュベート - 4℃で18時間を。
- 吸引しディスパーゼは完全に、DPBSで二回洗浄し、ピンセットで表皮を取り除きます。 15mlチューブで、転送2ミリリットルのコラゲナーゼタイプ2（500 U / mlのCDU）を追加し、DPBSで二回の生検を洗浄しCollagenaを追加SE最大5 mlの全容量。 37℃、5％CO 2で45分間インキュベートします。
- 遠心分離機5 180×gで分、その後、上清を捨てます。 180×gで5分間、再び10ミリリットルDMEM-FCS-ゲンタマイシンメディア（10％FCS、1μL/ mlのゲンタマイシン）と遠心機でペレットを再懸濁。 1.5ミリリットルDMEM-FCS-ゲンタマイシンメディアに上清を再懸濁ペレットを捨てます。付着組織培養フラスコをT25、37℃、5％CO 2でインキュベートし移します。
- 3日ごとに培地を変更します。
- 約2週間後、細胞は、皮膚の部分の周りに、トリプシン/ EDTA（0.05％）を用いて分割細胞コンフルエントされる場合：DPBSで一度洗浄細胞を、37℃で5分間インキュベートし、5％CO 2×2 mlのトリプシン/ EDTAを添加した後（0.05％）、5分間180×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機に転送、DMEM-FCS-ゲンタマイシンメディアの2ミリリットルを追加します。 DMEM-FCS-ゲンタマイシンメディアの適切な量の上清と再懸濁ペレットを捨てます。
- さらに、培地ごとに3つのRを変更することにより、細胞を拡大細胞がコンフルエントである場合に上記のようなDの昼と分裂。ゲンタマイシンの添加は、通路2の後に停止することができます。
- 直接変換実験のために細胞を使用する前に、標準的なアッセイによってマイコプラズマ汚染を除外するようにしてください。
- 細胞が拡張されていたら、直接変換を開始または10％DMSO、90％FCSを用いて細胞を下にフリーズすることがあります。細胞を、2日間-80℃に保存し、その後長期保存のために液体窒素に移すべきです。
- 変換の調製のために、DPBS、吸引DPBSで細胞を1回洗浄し、2.5 mlのトリプシン/ EDTA（0.05％）を追加します。 37℃、5％CO 2で5分間おいてください。 、細胞を剥離するために静かにフラスコをタップし、線維芽細胞培地（DMEM込みL-Gluの+ 10％FCS + 1％NEAA + 1％のピルビン酸ナトリウム）の2.5ミリリットルで再懸濁し、15 mlチューブに移します。 5分間、180×gで遠心分離し、上清を吸引除去します。単一細胞懸濁液を生成するために、上下に1ミリリットル線維芽細胞培地とピペットで細胞を再懸濁し。</ LI>
- フックス-Rosenthal-またはノイバウアー細胞計数室とプレート24ウェルプレートのウェルあたり3×10 4個の細胞を用いて細胞数をカウントします。 37℃、5％CO 2でO / Nインキュベートします。
センダイウイルスや分化転換とヒト線維芽細胞の2感染
注：安全性を確保するために、ウイルスを処理する次の手順では、粘膜の露出を防止するために、特に外科用マスク、生物学的安全キャビネットと、層流フード中で、適切な個人の安全装置を用いて実施されなければなりません。
- 100μlの線維芽細胞培地（ステップ1.9）に細胞を切り替えます。 Oct4-、Klf4-、Sox2-およびc-MYC-センダイウイルスのアリコートを解凍し、1mlの線維芽細胞のメディアをそれぞれのウイルスを再懸濁します。細胞への3のMOI（ウイルス力価はロット毎に異なるが、各ウイルスの1つのアリコートは、一般的に24ウェルプレートの10ウェルの感染のために使用することができます）で、各ウイルスを加え、穏やかに混合。 37℃、5％CO 2でO / Nインキュベート
- 24後の時間媒体を吸引し、neuroinductionメディアの500μlを添加する（1：1 DMEM / F-12：神経基礎、1×N2、1×B27、1％グルタ、10 ngの/ mlののhLIF、3μMCHIR99021、2μMSB431542）および今から39°C、5％CO 2で培養。一日おきにメディアを変更します。
- ラミニンコーティングした6ウェルプレートを準備し、感染後6日目：6ウェルプレート上に溶液1mlを添加し、4℃で24時間維持し、DPBS中1μg/ mlのラミニンを希釈します。
- 感染後7日目にDPBS / EDTAを用いて細胞を分割：その後、DPBS / EDTAの500μlを添加し、37℃、5％CO 2で10分間インキュベートし、培地を吸引し、DPBSで細胞を1回洗浄します。
- DMEM / F12の500μlを添加して、5分間、180×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機でプレートからサスペンションを削除します。
- 上清を吸引し、neuroinductionメディア、ラミニン被覆6ウェルプレート上にプレートを1.5 ml中にペレットを再懸濁し、最終conceでROCK阻害剤Y27632を追加細胞に10μMのntration、39℃、5％CO 2で培養。
- 一日おきにメディアを変更します。
- 感染培養後14日目から37°C、5％CO 2で細胞。神経上皮コロニーは、位相差顕微鏡によって感染後17日目の周りに明らかとなります。彼らは、感染後20日目の周りを取り出すことに十分大きくなければなりません。
推定上INPCコロニーの3分離
- 、DPBS中1μg/ mlのラミニンを希釈プレート上の溶液300μlを添加し、4℃で24時間維持：ある日、ラミニンでコート1 48ウェルプレートを選ぶ前に。一日後吸引ラミニンプレートから、ウェルにneuroinductionメディアの200μlを添加します。
- DPBSで一度ピックアップするコロニーを含む6ウェルプレートを洗浄し、6ウェルプレートのウェルあたり2mLのDPBSを追加します。機械的にコロニーを選択してください：周囲の細胞を取り除くために細い針を使用して、コロニーの周りにこすり。 200を設定します1;50μlの上のLピペットマンとそれぞれのピペットチップを使用してコロニーを選択します。
- ラミニン被覆48ウェルプレートの1ウェルに1つのコロニーそれぞれを転送し、ダウン10回ピペッティングして機械的に単一細胞懸濁液を生成します。細胞への10μMの最終濃度で、ROCK阻害剤Y27632を追加します。
- 2日間、37℃、5％CO 2で48ウェルプレートに細胞を増殖させます。 90％の集密度（約3 - - 4日）細胞が80に到達するまで、一日おきにメディアを変更します。
4.拡張とiNPCsの凍結保存
- 継代とiNPCsの拡大
- 培地を吸引し、DPBSで細胞を洗浄。 DPBSを吸引し、200μlのDPBS / EDTAを添加し、37℃、5％CO 2で10分間インキュベートし、追加のDMEM / F12の200μLを、5分間180×gで、15ミリリットルチューブにプレートから遠心分離機をサスペンションを削除。
- 上清を吸引し、neuroi 0.5mlにペレットを再懸濁nductionメディア（2.2ステップ）、ラミニン被覆12ウェルプレートにプレートし、細胞に10μMの最終濃度で、ROCK阻害剤Y27632を追加し、37℃で培養、5％のCO 2。細胞が80に到達した後に - 90％の集密度を、彼らはいずれかをさらに拡大することができるか、次のようにダウンして凍結しました。
- iNPCsの凍結
- 培地を吸引し、DPBSで細胞を洗浄。吸引しDPBSおよび300μlのDPBS / EDTAを添加し、37℃、5％CO 2で10分間インキュベートし、DMEM / F12の300μlを添加し、5分間180×gで、15ミリリットルチューブにプレートから遠心分離機をサスペンションを削除します。
- 上清を吸引し、商業NSC凍結培地0.5mlにペレットを再懸濁します。凍結バイアルに移し、懸濁液を、細胞凍結容器に入れました。 2日間-80℃で保存し、長期保存のために液体窒素に移します。
iNPCs 5.分化
- ニューロンへの分化アル系譜
- ラミニン被覆プレート上の培養細胞は、上記のように。細胞が約70％であるニューロ差分メディア（DMEM / F-12、1×N2、1×B27、300 ngの/ mlのcAMPを、200μMのビタミンC、10 ngの/ mlのBDNF、10 ngの/ mlのGDNF）にメディアを変更コンフルエント。 3週間一日おきにメディアを変更します。分化中の細胞を分割しないでください。
- 3週間後、細胞は、神経マーカーTUJ1を表現する必要があります。より成熟した神経細胞と神経細胞のサブタイプを得るためには、3ヶ月までの分化を続けています。
- グリア細胞系列への分化
- グリア誘導培地（1にメディアを変更します。1 DMEM / F-12：神経基礎、1×N2、1×B27、10μMのβメルカプトエタノール、100μMの非必須アミノ酸、1.5mMのL-グルタミン、5μg/ mlのインスリン、 40 ng / mlでのT3）を20ng / mlのEGFは、グリア前駆細胞への分化を誘導することを含みます。メディアの半分を削除し、約2週間、一日おきに新鮮な培地により交換してください。この期間中に細胞を分割する必要があります1：100％コンフルエントで10μMROCK阻害剤Y27632の存在下での3に達したとき。
- 細胞は、市販のアストロサイトのメディアにほぼコンフルエント変化媒体である場合には、一日おきにメディアを変更します。2週間後、さらに星状細胞への細胞を分化します。約7日後、細胞は、星状細胞マーカー（ 例えば、GFAP）を発現し始めます。 10μMのROCK阻害剤Y27632の存在下で2比：細胞が分化プロトコルの間に100％コンフルエントを取得する場合、1でそれらを分割します。
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Representative Results
ここでは、以下の8週間（ 図1）内に皮膚からパンチ生検により得られたヒト線維芽細胞から誘導された神経前駆細胞（iNPCs）の生成を可能にする統合されたプロセスの説明を提示します。患者specifc iNPCsはさらに、ニューロンとグリア系統に分化し、細胞置換療法および疾患モデリングのための大きな可能性を保有することができます。
Oct4-、Klf4-、Sox2-およびc-myco-の異形仙台neuroinductive培地条件22,31で23と文化をウイルスによる線維芽細胞の感染は17日、感染後の線維芽細胞の形態、コロニーのその後の出現の変化をもたらした（ 図2）。彼らはpluripotency-を発現しないのに対し、生成されたモノクローナル細胞株は、拡大し、Sox2の、SOX1、ネスチン、ビメンチン、のOtx2およびPax6のような神経幹細胞マーカーに陽性染色、ならびに増殖マーカーKi67にすることができます関連マーカーのOct4（ 図3）。
また、細胞培養培地に神経成長因子を添加することによって、神経前駆細胞はニューロンに分化させることができます。 42およびその後の最終分化。イズラエリらに基づく分化プロトコルを適用することにより（ 図4、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）に対する典型的な形態学的変化および染色の分析によって判断されるように、星状細胞誘導培地の細胞株はまた、グリア細胞系統に分化させることができると）。
三段階のプロトコルの略図を図1は、本研究に適用した。線維芽細胞は、パンチ生検によって患者から単離され、拡大することができます。これらの細胞株は、直接誘導される多能神経前駆細胞（iNPCs）とMoに変換することができますnoclonally拡大しました。 INPCラインは（反復または標準化された使用のためのバイオバンク）長期保存のために使用することができ、またはそれらは、ニューロンとグリア細胞系統に分化させることができる。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2形態を位相差顕微鏡を用いて誘導された神経前駆細胞へのヒト線維芽細胞の直接変換の解析（A）ヒト線維芽細胞を三日間OKSM感染後-センダイウイルスとneuroinduction培地の添加後2日。細胞は、典型的な線維芽細胞様の形態を示す。（B）の7日が変更された形態のショーを上にして感染細胞を投稿してください。細胞を、同じ日に密集度を低減するために分割される。（C）十日の感染後にのみ変更形態を有する細胞が存在している。（D）第1の小神経上皮様コロニーは17日、感染後に見つけることができます。これらのコロニーの大きさ（E）の増加、および外部増殖細胞を、（F）は 、3日後に見ることができます。細胞は感染後21および拡張可能な細胞株は、それらの（GI）から生成することができる日に採取されています。異なるクローンは、それぞれ、ピッキング後通路1（G）、継代3（H）及び通路10（I）に示されています。スケールバー=200μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
生成された神経前駆セルの神経幹細胞マーカー遺伝子発現の分析図3L行。細胞株の抗体染色10継代細胞は神経幹細胞マーカーSOX1、Sox2の（A）並びにネスチン及びPax6の（B）を発現することが明らかになった後。細胞は、多能性（C）が存在しないことを示す多能性マーカーOct4のために陰性です。細胞の大部分は、高増殖状態を示すマーカーKi67を、（C）について陽性に染色します。スケールバー=50μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
のNPCの図4.分析の後、ニューロンとグリア系統への分化を指示しました。神経仕様iNPCsを達成するために、（A）は、BDNF、GDNF、ビタミンCおよびcAMPの存在下で7日間分化させた。（B） この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、単離および拡張可能な導入遺伝子を含まない神経前駆細胞へのヒト線維芽細胞の直接変換および細胞補充療法や薬物スクリーニング分析に適用するための推定上の基礎として、その分化した子孫を示します。 NPCの中に体細胞の直接の系譜変換は系統特異的転写の強制発現26,33,34を要因によって達成されました。それにもかかわらず、多くの場合、胎児の線維芽細胞は、分化転換実験33,34のために使用しました。この細胞源は自己由来細胞置換療法のための臨床的な使用を妨げるような生物医学的用途のために、これらの細胞の使用は不適当です。最近、研究はそのような造血細胞43,44のような、より簡単にアクセスできる組織から神経前駆細胞の生成を記載している出版されました。 tripotent神経幹細胞株の生成が成功した誘導overexprによってマウス血液由来のB細胞を示すことができ8導入遺伝子43のesion。また、Castanoのらは 、ヒトSox2-を使用して、造血細胞およびc-MYC-センダイウイルス44からの神経前駆細胞を誘導するためのアプローチを発表しました。プロトコルは、CD133 +臍帯血細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成を可能にします。しかし、成人の末梢血単核細胞プロトコルの変換に適用されるときは、低い効率をもたらし、生成細胞株の増殖能力は44非常に限られていました。従って、44日に人間システムにおける末梢血細胞と公開だけ研究が明らかに直接変換実験において、この特定の細胞型の限界を示しています。患者特異的細胞の利用可能性は、自己細胞置換のために重要であるので、好ましい細胞タイプは、まだ我々の研究で説明したように容易に皮膚パンチ生検を介して誘導することができる成体線維芽細胞を表します。
overexpre分化転換のために必要な導入遺伝子のssionは、主に組込み型ウイルスベクター26,33,34によって達成されました。宿主ゲノムへのウイルスの統合は、挿入突然変異または導入遺伝子7,8の不要な再活性化につながる可能性がありますので、これは生物医学的用途のための由来細胞株の適用を妨げます。化学的処理に基づいて、導入遺伝子の過剰発現のないのNPCへの転換が、ヒト線維芽細胞は、45について記載されています。研究の目的は、成熟したシュワン細胞45の発生したとしてしかし、この研究では、これらの前駆細胞は、過渡状態でのみ存在していました。最近では、センダイウイルスの適用に基づいて、他の導入遺伝子を含まないアプローチはNPCの23,44へのヒト線維芽細胞の直接変換のために記載し、これまでの得意な作戦のように思われてきました。続いて、ニューロンおよびグリア細胞系統に分化することができる拡張可能なのNPCを導出するために、以下で説明するように、私たちは重要な修正を加えた培地22,31の小分子を添加することによって熱ウイルス23の不活性化だけでなく、神経誘導と共にセンダイウイルスにより、すべての山中因子の過剰発現を適用します。
私たちの手で、プロトコルを効率的にテストされ、多くの線維芽細胞株と協力して、いますが、古いドナーからの線維芽細胞の直接変換はINPC世代の低効率の悪い増殖ポテンシャルの結果を示すことが明らかに傾向があります。私たちは、Oct4のだけ、その後の染色細胞の感染によって判断されるように90％以上のウイルス形質導入効率の後に最大0.2％の効率をコロニー形成を観察しました。この効率は、以前に公表23よりも約3倍高いです。
最適化されたウイルスのMOIの正確に調整アプリケーションは非常に重要です。センダイウイルス力価のバッチ変動へのバッチ考慮しなければなりません。ウイルスは通常、商業的に取得されているので、それぞれの情報は、メーカーのホームページに記載されています。我々は、分化転換実験のために3の比較的低いMOIを使用することをお勧めします。
NPCの31へのヒト多能性細胞の分化のために記載したように我々の手で人間のLIFの添加は、確立されたINPC線の自己再生のために重要です。 LIFを添加しない場合には、細胞は、非可逆的に撤退した後、早ければ2日を区別するために開始します。
感染後の細胞培養は、39℃で実施し、標準的な37℃の細胞培養条件を使用していません。この温度の上昇は感染の1日後に既に開始し、センダイウイルスの熱不活性化につながります。感染後14日目まで39℃で培養が神経上皮コロニーの発生に必須です。
実際のところ、時々INPCコロニーは、プロトコルのセクションで説明よりも後に出てきます。我々の経験では、限り、細胞は、増殖性のままとして、彼らはポリクローナル継代することができる、手動ピッキングにより単離しました。早期に生じるコロニーについて記載したように、これらのコロニーから確立された細胞株は、同様の特性を示します。
確立された細胞株の分裂の間、それは彼らが十分に増殖する細胞から細胞への連絡先やパラクリン信号を必要とする細胞の小さすぎる数をシードしないことが重要です。細胞が播種された場合には低すぎる濃度の増殖を停止します。この場合、細胞は増殖を再び開始するために小さな表面を有する細胞培養皿に再播種によって救出することができます。
iNPCsのグリア分化のためには、高濃度で細胞を播種するために、プレートを、ほぼコンフルエントのときにそれらを分割することは非常に重要です。細胞が早すぎる分割されている場合は、主に神経分化が観察されます。
コンテンツ ">この原稿に記載された方法は、半または完全に自動化された方法で適用される可能性、疾患のモデリング及び細胞置換療法を含む、所望の生物医学的可能性を達成するのに必要であろう保有する。自動化もコストを可能にします神経前駆細胞の生成を効率的にスケールアップし、並列化。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
私たちは、優れた技術サポートのために役立つ提案やマルティナゲプハルトならびに平家Arthenための幹細胞とヴュルツブルク大学の再生医療グループのすべてのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、ドイツ学術協会DFG（ED79 / 1-2）からの助成金、教育研究BMBF（01 GN 0813）のドイツ省、バイエルン研究ネットワーク人工多能性幹細胞」forIPS」と「財団シビルAssmusによってサポートされていました" 図1は、www.servier.com Servier社から入手可能医療技術を用いて製造しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte media | ScienCell | 1801 | |
| B27 | LifeTechnologies | 17504-044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Biopsy Punch | pfm medical | 48301 | |
| cAMP | Sigma | A6885 | |
| CHIR99021 | Axon medchem | 1386 | |
| Collagenase Type2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Dispase | PAN | P10-032100 | |
| DMEM | LifeTechnologies | 41966-029 | |
| DMEM F12 | LifeTechnologies | 11320-033 | |
| DMSO | Roth | 4720 | |
| DPBS | LifeTechnologies | 14190-094 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0313 | |
| FCS | Biochrom AG | 50115 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| GFAP-antibody | Dako | Z0334 | |
| GlutaMAX | LifeTechnologies | 35050-038 | |
| hLIF | Peprotech | 300-05 | |
| Insulin | Seralab | GEM-700-112-P | |
| Ki67-antibody | NeoMarkers | RM-9106-S | |
| L-Glutamine | LifeTechnologies | 25030-024 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| N2 | LifeTechnologies | 17502-048 | |
| Nestin-antibody | R&D Systems | MAB1259 | |
| Neurobasal | LifeTechnologies | 21103-049 | |
| Non-essential amino acids | LifeTechnologies | 11140-050 | |
| NSC freezing media | Sigma | C6295 | |
| Oct4-antibody | Santa Cruz | sc9081 | |
| Pax6-antibody | Covance | PRB-278P | |
| SB431542 | Invivogen | inh-sb43 | |
| Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit | LifeTechnologies | A1378001 | |
| Sodiumpyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| Sox1-antibody | R&D Systems | AF3369 | |
| Sox2-antibody | R&D Systems | MAB2018 | |
| T3 | Santa Cruz | sc-205725 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| TUJ1-antibody | Covance | MMS-435P-250 | |
| Vitamin C | Sigma | A4544 | |
| Y27632 | Calbiochem | CAS 146986-50-7 | |
| β-Mercaptoethanol | LifeTechnologies | 21985023 |
References
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