Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Tillämpning av Långsiktigt odlade Interferon-γ Enzymkopplad immunospot analys för bedömning Effector och Memory T-cellssvar hos nötkreatur

doi: 10.3791/52833 Published: July 11, 2015

Summary

Långsiktig odlade interferon-γ enzymkopplad immunospot analys används som ett mått på central minnessvar och korrelerar med skyddande anti-mykobakteriella vaccinsvar. Med denna analys är perifera mononukleära blodceller stimulerades med mykobakteriella antigener och interleukin-2 i 14 dagar, vilket möjliggör differentiering och expansion av central minnes-T-celler.

Abstract

Effektorceller och minnes-T-celler genereras genom utvecklings programmering av naiva celler efter antigenigenkänning. Om infektionen kontrolleras upp till 95% av T-cellerna som genereras under expansionsfasen elimineras (dvs.., Kontraktion fas) och minnes-T-celler kvarstår, ibland för en livstid. Hos människor har två funktionellt distinkta undergrupper av minnes-T-celler har beskrivits baserat på uttrycket av lymfkörtelmålsökande receptorer. Central minnes T-celler uttrycker CC kemokinreceptor 7 och CD45RO och finns främst i T-cellområden av sekundära lymfoidorgan. Effector minnes T-celler uttrycker CD45RO saknar CCR7 och visa receptorer som är förknippade med lymfocytmålsökande till perifera eller inflammerade vävnader. Effektor-T-celler uttrycker inte heller CCR7 eller CD45RO men vid möte med antigen producerar effektorceller cytokiner, såsom interferon-γ. Interferon-γ frisättningsanalyser används för diagnos av bovint och humant tuberkulos ochupptäcka främst effektor och effektor minne T-cellsvar. Centrala minnes-T-cellsvar från CD4 + T-celler på vaccination, å andra sidan, kan användas för att förutsäga vaccineffektivitet, såsom demonstreras med simian immunbristvirus-infektion av icke-mänskliga primater, tuberkulos i möss, och malaria hos människor. Flera studier med möss och människor samt opublicerade data om boskap, har visat att interferon-γ ELISPOT-analyser mäter centrala minnes-T-cellsvar. Med denna analys, perifera mononukleära blodceller odlas i minskande koncentration av antigen för 10 till 14 dagar (långtidsodling), vilket gör att effektorceller svar på topp och avta; lätta centrala minnes-T-celler att differentiera och expandera inom kulturen.

Introduction

Effektor och minnes-T-celler genereras genom utvecklings programmering av naiva CD4 + -T-celler efter antigenigenkänning. Differentieringen av naiva CD4 + T-celler i cytokin producerande celler kräver patogen erkännande av medfödda immunceller, antigen presentation till T-celler, co-stimulering och transkriptions förändringar som resulterar i polariserat cytokinproduktion. Till exempel: antigenpresenterande celler producerar interleukin (IL) -12 som svar på intracellulära patogener, som tillsammans med antigenigenkänning, främjar differentiering av T-celler i T-hjälpar 1 (Th1) -celler 1,2 genom signalering genom signalomvandlare och aktivator av transkription 4 (STAT4) och T-box-uttrycks i T-celler (T-bet), vilket leder till cellaktivering, IL-2 produktion, klonal expansion och interferon (IFN) -γ produktion 3,4. Om infektionen är under kontroll, är upp till 95% av T-cellerna som genereras under expansionsfasen elimineras (dvs sammandragningfas) och minnes-T-celler kvar, ibland för en livstid 5. Sallusto et al., 6, avslöjade två funktionellt distinkta undergrupper av minnes-T-celler i människor baserat på uttrycket av lymfkörtelmålsökande receptorer. Centrala minnes-T-celler (TCM) uttrycker CC kemokinreceptor (CCR) -7 och CD45RO och finns främst i T-cellområden av sekundära lymfoidorgan. Tcm har begränsad effektorfunktion, en tröskel lågaktiva och bibehålla hög IL-2-produktion och fortplantningsförmågan. Effector minnes-T-celler (TEM) uttrycker CD45RO saknar CCR7 och visa receptorer för målsökande till perifera eller inflammerade vävnader. Effektorceller uttrycker inte antingen CCR7 eller CD45RO men snabbt producera effektor cytokiner, såsom IFN-γ, vid antigenigenkänning.

IFN-γ frisättningsanalyser (Igra) används för diagnos av bovin och human tuberkulos 7. Mycobacterium bovis är det huvudsakliga medlet av bovin tuberkulos (BTB) medan mänsklig caSES av tuberkulos orsakas huvudsakligen av Mycobacterium tuberculosis. Med dessa tester, helblod eller perifera blodmononukleära celler (PBMC) stimuleras med mykobakteriella antigener för 16 till 24 timmar och IFN-γ tillverkning i den överstående vätskan mäts genom ELISA eller genom detektion av celler som producerar IFN-γ användning ELISPOT-tekniker. Som ett resultat av den korta stimuleringsperioden (dvs.., 16 till 24 timmar) och snabb produktion cytokin, ex vivo-analyser detekterar primärt effektor och Tem responser. Detta har bekräftats genom flödescytometrisk analys av cellpopulationer i dessa kulturer 8-10.

Ex vivo IFN-γ svar rutinmässigt ingår i immunsvaret panelen utvärdering av vacciner tuberkulos, inklusive de som används för att utvärdera svaren från nötkreatur. Mest effektiva vacciner bovin tuberkulos framkallar specifika IFN-γ svar, men inte alla vacciner som inducerar IFN-γ svar är Skyddse. Även halterna av IFN-γ framkallad genom vaccination, mätt före infektion, inte nödvändigtvis korrelerar med skydd. Till exempel kan olika BCG-stammar har olika förmåga att framkalla ex vivo IFN-γ svar, trots liknande skyddsnivåer 11. Således, ex vivo Igras är värdefulla för diagnos tuberkulos och för att komma åt vaccin immunogenicitet; emellertid, är begränsad deras användning som prediktorer för vaccineffekt. Tcm svar på vaccination, å andra sidan, kan användas för att förutsäga vaccineffekt, vilket framgår med simian immunbristvirus (SIV) hos icke-mänskliga primater 12,13, tuberkulos hos möss 14 och malaria hos människor 15,16.

Efter ett effektivt immunsvar resulterar i patogen clearance är Tcm underhålls och ge skydd till en eventuell andra infektion av samma agent. Ett anmärkningsvärt undantag till detta scenario är M. infe tuberkulosInsatser av människor där patienter som fick kurativ antimykobakteriell terapi är mottagliga för återinfektion 17,18. Dessutom, händelser som reglerar immunologiskt minne under kroniska infektioner, där den antigenstimulering kvarstår, är inte väl förstådda 19. Under kroniska infektioner, såsom med humant immunbristvirus (hiv) och tuberkulos är en betydande Tcm svar i samband med ett positivt resultat (t.ex. latens med tuberkulos och subklinisk sjukdom med HIV) 20,21. Flera studier med möss och människor har visat att långtids odlade IFN-γ ELISPOT-analyser mäter Tcm svar 16,20-22. Med denna analys, PBMC odlas i minskande koncentration av antigen för 10 till 14 dagar, vilket effektorceller svar på topp och avta; lätta Tcm att differentiera och expandera inom kulturen.

Långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT-analyser har också använts inom veterinär-forskning, men fenotypen svarande celler har varit svårt att bedöma på grund av bristande kritiska reagenser, speciellt en antikropp mot CCR7. Effektiva vacciner bovin tuberkulos [t.ex.. med användning av en enda dos av M. bovis Bacille Calmette Guerin (BCG), BCG, följt av virusvektor antigen 85A subenhetsvaccin eller försvagade M. bovis ΔRD1] framkalla långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT svar efter vaccination som korrelerar med skydd (dvs lägre mykobakteriellt börda och minskade TB-associerad patologi) mot efterföljande utmaning med virulent M. bovis 23,24. Dessutom, antalet antigenspecifika IFN-γ-celler som utsöndrar inom långtids PBMC kulturer är högre vid 12 månader, men minska på 24 månader efter BCG-vaccination av nyfödda kalvar, korrelera med graden av skydd detekterbara inlägget M. bovis utmaning 25. I detta scenario är den odlade IFN-γ ELISPOT enn viktigt verktyg för att förutsäga vaccineffekt, vilket ger en möjlighet att prioritera vaccinkandidater för höga kostnader effektivitetsstudierna. Dessutom kan odlade ELISPOT tekniker anpassas för olika värdar, patogener och cytokiner genom att förändra antigener eller antikroppar för en mängd olika ändamål i olika forskningsområden.

Protocol

1. Förbered följande lösningar

  1. Förbered fullständigt RPMI (cRMPI) genom att tillsätta fetalt bovint serum (FBS) till en koncentration av 10% (volym / volym), glutamin (2 ^ M), natriumpyruvat (1 | iM), icke-essentiella aminosyror (0,1 ^ M), penicillin -streptomycin (100 enheter / ml penicillin och 0,1 mg / ml streptomycin) och 2-merkaptoetanol (50 mM) i RPMI 1640.
  2. Bered 2 X syracitrat dextros, genom blandning av natriumcitrat (77 | iM), citronsyra (38 | iM) och dextros (122 pM), i destillerat vatten.
  3. Förbered Ca2 + Mg2 + fri fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,2: NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM), Na 2 HPO 4 (dibasiskt, 10 mM), KH 2 PO 4 (monobasiskt, 2 mM) i destillerat vatten; justera pH till 7,2.
  4. Förbered PBS 1% (PBS 1% BSA) genom att tillsätta bovinserumalbumin i PBS (volym / vikt, 1 g / 100 ml PBS).
  5. Förbered PBS + 0,05% Tween 20(PBST) genom att tillsätta 0,05% Tween 20 i PBS (volym / volym, 500 | il Tween 20/1 L PBS).
  6. Bered 100 mM Tris-HCl pH 8,2 buffert genom att blanda Tris (100 mM), HCl (0,50 mM) i destillerat vatten.
  7. Bered 35% etanollösning genom utspädning etylalkohol (renhet ≥99.5%) i destillerat vatten (volym / volym, 35 ml etylalkohol / 100 ml destillerat vatten).
  8. Filter sterilisera cRPMI, 2 x syracitrat dextros, PBS, PBS 1% BSA med användning av 0,22 um filter.

2. Långsiktiga odlade celler (14 Day Protocol)

(Dag ett)

  1. Förbered antigen lösningar på två gånger den slutliga koncentrationen i cRPMI. Antigen valet är kritisk och bör anpassas till syftet med studien.
  2. Späd rekombinant M. tuberkulos-antigener TB10.4 och antigen Ag85A till 2 | ig / ml (av varje antigen, den slutliga koncentrationen är 1 | ig / ml).
  3. Utspädd M. bovis renat proteinderivat(PPD-B, Prionics Ag) till 10 | ig / ml (slutkoncentrationen är 5 pg / ml).
  4. Späd den rekombinanta tidiga sekretoriska antigent mål 6 (ESAT-6) och odlingsfiltratet protein 10 (CFP-10) fusionsprotein (Resat-6: CFP10) till 2 | j, g / ml (slutkoncentration av 1 | ig / ml).
    OBS! Dessa antigener är immunodominanta IFN-γ inducerande antigener av tuberkelmykobakterier och kan innefattas för att stimulera PBMC från M. bovis infekterade djur. BCG eller M. bovis ΔRD1 vaccinerade djur inte svarar på Resat-6: CFP10, som den region som kodar dessa antigener (dvs, RD1) skall utgå i dessa stammar. Resat-6: CFP10 används i dessa studier var en vänlig gåva från Dr. C. Minion, Iowa State University. TB10.4 och antigen Ag85A är immun antigener närvarande i virulent och vaccin M. bovis-stammar 37. PPDB, som en renad proteinderivat, är ett komplex av flera antigener inkluderande antigener som delas med icke-tuberkelmykobakterier. Infected djur kommer potentiellt svara på alla antigen (nämligen TB10.4, Ag 85A, Resat-6: CFP10 och PPDB), medan vaccinerade djur inte bör reagera på Resat-6: CFP10 11.
  5. Plattan 500 | il / brunn av antigenlösning i kvadruplikat för varje djur i en 24-brunnsplatta. För detta protokoll, använd antigen som en pool; alltså använda alla brunnar innehåller alla antigenerna och inga kontroller (såsom null eller mitogen) det här steget. Inkubera plattan vid 39 ° C / 5% CO2. Den normala temperatur nötkreatur är 39 ° C; alltså, vissa forskare använder 39 ° C för odling av nötkreatur celler. Även i vissa fall med mänskliga celler, ger cellodling vid 39 ° C fördel 26,30.
  6. Pre-last sprutor i kombination med 16 eller 18 G injektionsnålar med 6 ml av 2 X syra citrat-dextros; och samla 60 ml bovint blod genom jugular venpunktion.
  7. Isolera PBMC från standard densitetsgradientcentrifugering av perifert blod buffy coat fraktionerjustera cellkoncentrationen till 4 x 10 6 celler / ml såsom beskrivits av Maue et al. 27
  8. Lägg till celler (500 pl / brunn) till antigen förinstallerade 24 brunnar, i fyra exemplar för varje djur (steg 2,5). Inkubera plattan vid 39 ° C / 5% CO2.

(Dagar tre och sju)

  1. Med hjälp av steril teknik, försiktigt bort 500 pl av supernatanten från varje brunn utan att störa cellskiktet.
  2. Fyll väl volym genom tillsats av 500 | il / brunn av cRPMI innehållande IL-2 (30 U / ^ il, dvs 15 U / brunn; rekombinant humant IL-2 Sigma I7908). Inkubera plattan vid 39 ° C / 5% CO2.

(Dagar 10 och 12)

  1. Med hjälp av steril teknik, ta bort 750 pl supernatant från varje brunn. Fyll volymen med 750 ul / brunn av cRPMI (utan IL-2). Inkubera plattan vid 39 ° C / 5% CO2.

(Dag ett (12: e dagen i långtidsodling protokoll))

  1. Märk ELISPOT plattan ordentligt för varje uppsättning av prover, för att undvika misstag när plätering celler: långsiktiga celler plus antigenpresenterande celler (APC), långsiktiga celler utan APC och ex vivo / kortsiktiga celler (Figur 1). Replikerar för varje behandling (dvs antigen stimulering) bör göras minst två gånger.
  2. Bered infångningsantikropplösning genom att späda mus-anti-bovint IFN-γ-antikropp (MCA2112, klon CC330) i PBS (8 | ig / ml).
  3. Med hjälp av en flerkanalspipett förväg väta brunnarna i ELISPOT-plattan med 15 | j, l / brunn av 35% etanol under 1 minut. För att förhindra membranskada, inte röra vid botten av brunnarna med pipettspetsar vid något tillfälle under analysen.
  4. Tvätta plattan sex gånger med 300 | il / brunn PBS. Tvättvätska ska kasseras av platta inversion. Tvättar bör göras snabbt, inte låta plattbrunnarna torka.
  5. Pipettera 100 | il / brunn av infångnings anti-IFN-γ-antikropp (från steg 1 ovan). Inkubera vid 4 ° CO / N (hålla plattan i en dragkedja förvaringsväska).

(Dag två (13: e dagen av den långtidsodling protokoll))

  1. Förbered antigen lösningar på två gånger den slutliga koncentrationen. Behandlingar är: ingen stimulering (cRPMI), PPD-B (20 | j, g / ml, slutlig koncentration: 10 | ig / ml), protein cocktail av TB10.4 och Ag85A (2 ^ g / ml av varje protein, slutkoncentration: 1 pg / ml av varje protein) Resat-6: CFP10 (för M. bovis-infektion, 2 | ig / ml, slutkoncentration: 1 pg / ml), och en positiv kontroll, såsom pokeweed (20 | ig / ml, slutkoncentration: 10 | ig / ml). Andra mitogenet kan användas istället för PWM (t.ex. Concanavalin A).
    OBS: för detta steg antigener komponera fyra olika behandlingar och är not används som en pool (som i steg 2.5). De fyra behandlingar är: NS, PPDB, protein cocktail (TB10.4 och Ag85A utgör en behandling) och PWM.

4. Kortfristiga Cell Culture och vidhäftande cell (APC) Isolering

  1. Samla 60 ml blod från samma djur avblodas på dag 1 (under: långtidsodling, 14 dagars protokoll) och isolera PBMC som tidigare.
  2. Justera cellkoncentrationen till 2 x 10 6 celler / ml. Märkningsrören tydligt att förhindra snedfördelning vid utstrykning av celler. Dessa celler kommer att användas för APC isolering och även som korttids cellodling (steg 6,5). Etikett rör med både djurnummer och vilken typ av kultur (i det här fallet: ex vivo, kortsiktiga eller färska celler).
  3. Ta bort överflödigt infångningsantikropp från ELISPOT av plattan inversion. Tvätta plattorna sex gånger med 300 ul PBST.
  4. Ta bort så mycket PBST som möjligt. Pipett 50 ul av cellsuspensioner till brunnarna märkta som långsiktiga celler plus APC. Blockera andra wells med 200 ul / brunn av cRPMI. Inkubera 90 minuter vid eller 39 ° C. Pre-varm cRPMI eller 39 ° C (som behövs för efterföljande steg). Färska PBMC som inte används för vidhäftande cell (APC) isolering kommer att behövas i efterföljande steg och bör förvaras.

5. Odlade celler

  1. Under 90 minuters inkubation (steg 4,4, kortsiktig odling och vidhäftande cellisoleringssteg), skörd långsiktiga odlade celler.
  2. Med användning av 5 eller 10 | il pipetter, pipettspetsar media med celler upp och ner för att lösgöra celler, kombinera fyra exemplar replikerar från varje djur till en enda 15 ml rör. Centrifugera rören under 5 min vid 400 g.
  3. Efter centrifugering, kasta supernatanten genom röret inversion. Rubba cellpelleten. Lägg 5 ml PBS, försiktigt återsuspendera pelleten, om så är nödvändigt. Upprepa centrifugeringen. Upprepa tvättsteget två gånger. Kasta supernatanten genom röret inversion och försiktigt återsuspendera celler i 1 ml cRPMI. Justera cellkoncentrationentill 2 X 10 5 celler / ml.

6. Plating Frisk och odlade PBMC

  1. Efter 90 minuter inkubation, skaka plattorna på plattskakare under 30 sekunder. Avlägsna icke-adherenta celler genom plattinversion. Tillsätt 150 ul / brunn av varm cRPMI (från steg 4, under: Kortfristiga celler och vidhäftande cell (APC) isoleringssteg).
  2. Skaka plattorna och kassera tvättvätska. Upprepa tvätta 3 gånger. Lägg 100 ul / brunn av varje antigen i lämpliga brunnar (för-märkt).
  3. Till tallrik celler, pipett 100 pl / brunn av långsiktigt odlade cellsuspension (2 x 10 5 celler / ml) i brunnarna märkta som långsiktiga celler plus APC: er. Se till att de långsiktiga celler läggs i detta steg är från samma djur som APC är redan i brunnen. Blanda inte APC: s och långsiktiga odlade celler från olika djur.
  4. Pipettera 100 | il / brunn av den långsiktigt odlade cellsuspensionen (2 x 10 5 celler / ml) i brunnar utan APCar för bedömning av APC-krav på att långtidsodlingssvar.
  5. Tillsätt 100 pl / brunn av kortsiktiga celler (nyligen isolerade och justerades till 2 x 10 6 celler / ml) för ex vivo bedömning svar. Inkubera plattorna O / N vid 39 ° C / 5% CO2 inkubator. Se till att plattorna ligger plant och inte stapla plattor.
    OBS: Om en analys av cellfenotyp önskas, flödescytometri kan utföras som en accessorisk analys. Celler stryks i 96 brunnars U bottenplattor (i stället för ELISPOT plattor) såsom beskrivits för ELISPOT-analys. Capture antikropps adsorption (steg 3,4-3,5) ska hoppas över. Cellerna inkuberas därefter O / N vid 39 ° C / 5% CO2 och en standardcell färgningsprotokollet utförs. Cellfärgreagenser är inkluderade i tabellen reagens.

Dag tre (14: e dagen av Långsiktig kultur protokollet)

  1. Späd detektionsantikropp (mus-anti-bovint IFN-γ, klon CC302) till 5 | ig / ml i PBS 1% BSA. Kasta vätskor från brunnarna och tvätta plattorna: sex gånger med PBST (300 ul / brunn), utsläppande på shaker varje gång i 10 sekunder före och i-mellan tvättar, en gång med dH 2 O (300 ul / brunn), ytterligare 6 gånger med PBST (300 | al / brunn) och två gånger med PBS (300 pl / brunn). Efter celler avlägsnas från plattorna, och om inga biosäkerhet oro gäller förfaranden kan utföras utanför Biologiska säkerhetsskåp.
  2. Släng tvättvätska. Ta bort så mycket tvättvätska som möjligt genom att trycka plattan på pappershanddukar. Lägg detektionsantikropp (100 | il / brunn).
  3. Inkubera plattorna under 120 minuter vid eller 39 ° C. Under denna inkubationssteg, förbereda alkaliskt fosfatas lösning enligt tillverkarens instruktioner. Trettio minuter före användning (dvs 90 minuter efter tillsats av detektionsantikropp till brunnar) späda ut reagens i PBST. Invertera röret försiktigt för att blanda reagensen och inkuberades vid RT.
  4. Efter 120 min inkubation, kasta överskott detektionsantikropp med platta inversion. Tvätta plattan 6 gånger med PBST (300 | al / brunn). Ta bort så mycket tvättvätska som möjligt genom att trycka plattan på pappershanddukar.
  5. Lägg 100 | il / brunn av alkaliskt fosfatas-lösning (från steg 3 ovan). Inkubera plattorna under 45 min vid RT. Kassera vätska och tvätta varje platta 6 gånger med PBST (300 | al / brunn).
  6. Bered substratlösningen följa tillverkarens instruktioner (Vector Blue AP substrat III): Späd reagens i 100 mM Tris HCL pH 8,2 buffert. Pipett 50 ul / brunn av substratlösningen.
  7. Inkubera vid RT tills blå färg börjar att utveckla (ca 30 min). Kasta vätskan och tvätta plattorna med kopiösa mängder av dH 2 O. Ta bort bottenplattan för att exponera membranet, tvätta baksidan av brunnar och låt plattan lufttorka.
  8. Avläs plattorna på immunospot bildanalysator eller ELISPOT läsare (tabell 1), eller manuellt, med hjälp av ett stereomikroskop. Alternativt, hålla plattori mörker vid RT tills behandlingen. På grund av den höga stabiliteten hos reaktionssubstrat, är kvalitet bevaras under flera år.
    OBS: Celler och antigenkoncentrationer har optimerats för att undvika brunnar med oräkneliga fläckar 23,24,27,37. Det är möjligt att oräkneliga fläckar bildning förekomma i olika inställningar eller på grund av biologisk variation. Om så är fallet, bör cellkoncentrationen optimeras så läsbar plats räknar respons erhålls.

7. Plattorna Läsa och dataanalys

  1. Utför analys enligt Cellular Technology Limited (CTL) ELISPOT plattläsare guide (tabell 1). Efter de fläckar räknas erhålls för var och en av brunnarna, beräkna genomsnittet mellan dubbletter. Den specifika immunsvar mot varje antigena stimulus beräknas genom att subtrahera det genomsnittliga antalet fläckar i icke-stimulerade brunnarna från den i antigenstimulerade brunnar.

Representative Results

Ungefär en månad efter aerosol infektion med M. bovis (10 4 kolonibildande enheter), PBMC från infekterade (n = 8) och kontrolldjur (n = 8) odlades i närvaro av antigen och IL-2 under 13 dagar. Utveckling av Tcm responser efter infektion bestämdes med användning av IFN-γ ELISPOT-analys. Representant Tcm (i närvaro eller frånvaro av APC) och ex vivo IFN-γ ELISPOT svar från infekterade djur (tre djur) och en icke-infekterade djur (ett djur) visas i figur 1. En framgångsrik långsiktig IFN-γ ELISPOT analysresultat i celler som producerar IFN-γ (Spot bildande celler, SFC) under stimulerade betingelser och i närheten av uteblivet svar från icke-infekterade djur och under icke-stimulerade förhållanden. Dessutom bör en stark T-cellrespons uppträda som svar på PWM. Särskilda svar på M. bovis bedömdes av PPD-B eller Resat-6: CFP10 antigenstimulering. Såsom visas i fig1, robust Tcm och ex vivo svar på PPD-B och Resat-6: CFP10 detekterades från alla tre M. bovis-infekterade djur. Minimal eller ingen Tcm och ex vivo responser detekterades från kontrolldjuret. Dessutom var närvaron av APC som krävs för optimala Tcm svar från smittade djur, vilket framgår av kraftigt reducerade svar av långsiktiga celler odlade i frånvaro av autologa APC. IFN-γ svar av PBMC från M. bovis-infekterade och ej infekterade djur presenteras i fig 2. Antalet SFCs från varje djur beräknades som det genomsnittliga antalet SFCs i dubbelprov som svar på PPD-B minus respektive svar på enbart media. Svaren uppskattades 10 6 celler. Svaren skilde sig (P <0,05) baserat på infektionsstatus, närvaro eller frånvaro av APC och kultur varaktighet (dvs. Långsiktig kultur kontra ex vivo kultur).

Förvärva bild av plattor
1. Slå på maskinen
2. Öppna "Immuno Capture" Version 6.3 programvara.
3. Steg 1: Välj skiva.
4. Steg 2: lastskylten.
5. Steg 3: välj skanningsalternativ.
6. Steg 4: starta skanningen.
7. Skaffa översiktsbilden av plåt.
8. Mata ut platta.
9. Avsluta program "Immuno Capture".
Räkna fläckbildande enheter
1. Öppna "Immuno Spot Capture" Version 5.0 programvara.
2. Välj objektivt T-typ: normal.
3. Välj räknar modul: Smart räkna.
4. Steg 1: lastskylten.
5. Steg 2: definiera räkna parametrar: test noggrannhet plats erkännande brunnar med olika platser.
6. Starta automatisk räkna.
Kvalitetskontroll
1. Öppna "immunospot Capture" Version 5.0 programvara.
2. Välj räknar modul: kvalitetskontroll.
3. Steg 1: lastskylten.
4. Steg 2: Analysera markerade brunnarna individuellt.
5. Avsluta kvalitetskontroll.

Tabell 1 - autoimmun Diagnostika ELISPOT läsare bildtagning och cellräkning förfarande.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 1
Figur 1. Bild av brunnar från ett långsiktigt odlade IFN γ ELISPOT analys. Odlade IFN-γ ELISPOT-analysen utfördes approximatelyone månad efter utmaning med virulent M. bovis (tre djur). Icke-infekterade djur inkluderades som kontroller (ett djur) Långsiktiga cellinjer alstrades genom att stimulera PBMC med en cocktail av rekombinant Ag85A (1 | ig / ml), TB10.4 (1 | ig / ml), Resat-6.: CFP10 (1 | j, g / ml) och PPD-B (5 | ig / ml) under 13 dagar följt av överföring till ELISPOT-plattor i närvaro eller frånvaro av autologa APC. Kortfristiga celler bestod av PBMC isolerade på dag 13 och ströks direkt i ELISPOT-plattor. Långsiktiga och kortfristiga celler stimulerades med PPD-B (10 | ig / ml), Resat-6: CFP10 (1 | ig / ml), ensamt medium eller mitogen från Phytolacca (5 &# 956; g / ml) under 24 timmar.

Figur 2
Figur 2. Representativa resultat från ett långsiktigt odlade IFN γ ELISPOT svar på M. bovis renat proteinderivat (PPD-B). Odlade IFN-γELISPOT analys utfördes approximatelyone månad efter utmaning med virulent M. bovis (åtta djur). Icke-infekterade djur inkluderades som kontroller (åtta djur Långsiktiga celler genererades genom att stimulera PBMC med en cocktail av rekombinant Ag85A (1 | ig / ml), TB10.4 (1 | ig / ml), Resat-6: CFP10 (1 ^ g / ml) och PPD-B (5 | ig / ml) under 13 dagar följt av överföring till ELISPOT-plattor i närvaro eller frånvaro av autologa APC. Kortfristiga celler bestod av PBMC isolerade på dag 13 och ströks direkt i ELISPOT-plattan . Långvarig och short sikt celler stimulerades med PPD-B (10 | j, g / ml) eller enbart medium under 24 timmar. Specifika svar från varje djur (SFC / 10 6 celler) presenteras som svar på PPD-B (medelvärde av dubbelprover) minus svaret på enbart media.

Discussion

IFN-γ produktion i långsiktiga odlade ELISPOT-analyser är i allmänhet på Tcm hos människa, men hur detta svar utvecklas i kultur är dåligt förstådd. Huruvida Tcm är närvarande i cirkulationen och expandera in vitro, eller om Tcm responser resulterar från differentiering av effektor och Tem celler till Tcm under odling är inte känd. Samtidigt har studier med prover från människa funnit att CD4 + T-celler från ex vivo och långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT-analyser har orelaterade epitopspecificiteter, vilket innebär att Tcm responser inte utvecklas från effektorceller 28. Uppenbarligen kan varaktigheten av svaret varierar, men om patogen clearance uppnås, så småningom både ex vivo och Tcm responser minska. Även svaren från långsiktiga kulturer mätt tidigt och långt efter antigen priming (när effektor svar är lägre) har visat sig korrelera, vilket tyder på att cirkulerande Tcm populationer tidigt och långt efter antiframkallande priming är kopplat in vivo. Å andra sidan, inte storleken på ex vivo svar inte verkar vara relaterade till storleken på minnessvar 29. Dessa resultat tyder på att långtids odlade IFN-γ ELISPOT responser resulterar från in vitro-expansion av TCM och en tillhörande avtagande av effektorceller responser i provet, i stället för differentieringen av effektorceller i Tcm fenotyp.

Med nötkreatur, är den relativa betydelsen av effektorceller och minnesgrupper till svar detekteras av de långsiktiga IFN-γ ELISPOT-analyser inte känd. Nyligen genomförda studier tyder på ett samband mellan vaccin framkallade långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT svar och skydd mot efterföljande experimentell infektion med M. bovis 23-24. Det har rapporterats att svaga långsiktiga IFN-γ ELISPOT svaret på vaccination är associerade med avsaknaden av skydd 30. Både levande och dödaed vacciner inducerar liknande ex vivo IFN-γ ELISPOT svar, men vaccination med levande BCG framkallar starkare långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT svar än gör dödade vaccinpreparat. Intressant, levande vacciner är skydds medan dödade formuleringar inte att ge skydd mot utmaning med virulent tuberkelmykobakterier 31-32, 33.

Bedömning av Tcm svar är också möjligt genom att sortera dessa celler från PBMC. Direkt anrikning av Tcm från PBMC, kräver emellertid dyra anordningar, välutbildade personlig och är svår eftersom dessa celler inte är talrika i blodomloppet. Långsiktig kultur av PBMC ger anrikning av Tcm över Tem och effektorceller utan dyra enheter; men eftersom dessa T-cellspopulationer expanderas in vitro de kan vara mindre representativ för in vivo svar minnes. Det är möjligt att få tillgång till IFN-γ minnessvar (med hjälp av långtidsodling eller Tcm sorteraing strategier) från andra källor än ELISPOT-analyser såsom: cytokin ELISA 34, cytokin pärla arrayer (CBA), intracellulär färgning (ICS), eller cytokin proteinchip (CPA). Dessa metoder; dock, är i allmänhet mindre känsliga än ELISPOT-analyser 35.

En fördel med ELISPOT är dess förmåga att detektera omedelbar infångning av cytokinet kort efter dess frigöring förhindra utspädning i supernatanten och nedbrytning genom enzymatisk klyvning eller cytokin upptagning av andra celler. ELISPOT-analyser detekterar enstaka celler som producerar cytokiner som ger exakta resultat även i svagt signal till brus scenarier (dvs låga specifika svar) 35. Också med ICS, kan detektion av cytokiner kända att frisätta resultera i falsk identifiering av celler som producerar cytokiner (t ex., På grund av posttranslationell module före eller under den sekretoriska processen) 34. Inhibitorema transport anställda med ICS analyser för att minimera cytokinutsöndringunder antigenstimulering (sk Golgi stopp proteiner) begränsa giltighetstiden för cellstimulering på grund av celltoxicitet av dessa proteiner i slutändan påverkar cytokinproduktion 35.

Med detta sagt - CBA, CPA och ICS är användbara tekniker för att mäta flera cytokiner samtidigt och / eller för att bestämma cellytmarkör uttryck (dvs med ICS.). Därför kan dessa metoder användas i kombination med IFN-γ ELISPOT-analys 36. Medan tidigare bovint TB-vaccin effektstudier mätt Tcm svar via ELISPOT analys kommer att upptäcka Tcm svar av andra tekniker sannolikt ge jämförbara resultat. Viktigt är ELISPOT-assay billigare och enklare att utföra än CBA, CPA och ICS analystekniker 34. Manuell räkning av SFC är ett alternativ till automatisk räkning, och ELISPOT-plattor kan lagras vid rumstemperatur under lång tidsperiod med minimal kvalitetsförlust, före eller efter punkt counting 37.

Den långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT svar har tillämpats för att bedöma minnes svar av människor, och boskap vid utvärdering tuberkulosvaccin svar 14-16,31-32,33. Tcm svar antas också spela viktiga roller i värd svar på flera andra smittämnen av nötkreatur, såsom:. Mycoplasma mycoides underart mycoides 42, Anaplasma marginale 38 och bovint respiratoriskt syncytialvirus 39. Potentiellt kan det långsiktiga ELISPOT-analys anpassas för andra djurarter, cytokiner och infektioner. Dessa bredare program kommer att vara särskilt användbart för veterinärmedicinska immunologiska tillämpningar på grund av nuvarande begränsade tillgången av specifika reagens.

Tcm svar är avgörande för att skydda mot flera infektioner, men att mäta dem tidigt efter infektion / immunisering (för sjukdom resultatet förutsägelse eller vaccineffekt) may vara besvärligt. Analys av immunsvaret enligt ex vivo och korta antigenstimulering förhållandena kommer oftare representerar effektor svar, på grund av överlappningen av minnes- och effektor svar, särskilt under inledningen av immunologiskt minne bildning. I samband med kroniska sjukdomar i vilka antigenbelastningen är kontinuerlig, kommer ex vivo responser bedöma effektor-cellsvar eller en kombination av minnes- och effektor-cellsvar. Det långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT-analys, som beskrivs här, sannolikt möjliggör mätningen av Tcm svar snarare än effektor T-cell eller kombinerade cellsvar CD4 + T. Sammanfattningsvis tillhandahåller den långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT-analys en värdefull metod för att uppskatta T-cellminnessvar och har använts framgångsrikt för att utvärdera minnes svar hos flera arter till en mängd olika infektioner medel 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Forskningen stöddes av USDA, ARS Cris: 3625-32000-104 och jordbruks- och livsmedels Research Initiative Konkurrenskraftiga Grant nr. 2011-67015-30736 från USDA National Institute of Food and Agriculture. Vi tackar Jessica Pollock, Emma Frimml-Morgan, Shelly Zimmerman, Kristin Bass, Bruce Pesch, Molly Stafne, Allen Jensen, och Tracy Porter för deras utmärkta tekniskt bistånd samt Rebecca Madison, Doug Ewing, Katie Pille, Jay Steffen, David Lubbers Robin Zeisness, och David Panthen för utmärkt vård och hantering av djur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium citrate (dihydrate) Various
Citric acid (monohydrate) Various
Dextrose Various
ELISPOT PVDF plate Various
Vectastain ABC – AP KIT Standard Vector Laboratories AK-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit Vector Laboratories SK-5300
Ag85A Lionex LRP-0004.3 23, 24, 25, 37
TB 10.4 Lionex LRP-0061.6 23, 24, 25, 37
PPDb Prionics AG 7600055
rESAT-6:CFP10 Kind gift Dr. Minion, Iastate 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 Serotec MCA1783B 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 Serotec MCA2112 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 Serotec MCA1653GA
Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A Serotec MCA2434GA
Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 Abcam ab95665
Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 Serotec MCA1783PE
Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 Invitrogen A-21130
Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 SouthernBiotechnology 1080-193
Goat anti-rat IgG-APC Invitrogen A10540
BD Cytofix/Cytoperm™ BD Biosciences 554714
BrefeldinA Sigma-Aldrich B7651
Pokeweed Mitogen Sigma-Aldrich L8777
Recombinat human Interleukin 2 Sigma-Aldrich I7908

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szabo, S. J., Kim, S. T., Costa, G. L., Zhang, X., Fathman, C. G., et al. Novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100, (6), 655-669 (2000).
  2. Mullen, A. C., High, F. A., Hutchins, A. S., Lee, H. W., Villarino, A. V., et al. Role of T-bet in commitment of Th1 cells before IL-12-dependent selection. Science Signaling. 292, (5523), 1907 (2001).
  3. Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. Journal of immunology. 136, (7), 2348-2357 (1986).
  4. Lighvani, A. A., Frucht, D. M., Jankovic, D., Yamane, H., Aliberti, J., et al. T-bet is rapidly induced by interferon-gamma in lymphoid and myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (26), 15137-15142 (2001).
  5. Masopust, D., Picker, L. J. Hidden memories: frontline memory T cells and early pathogen interception. Journal of immunology. 188, (12), 5811-5817 (2012).
  6. Sallusto, F., Lenig, D., Förster, R., Lipp, M., Lanzavecchia, A. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions. Nature. 401, (6754), 708-712 (1999).
  7. Waters, W. R., Palmer, M. V., Thacker, T. C., Davis, W. C., Sreevatsan, S., et al. Tuberculosis immunity: Opportunities from studies with Cattle. Clinical and Developmental Immunology. 2011, (1), 1-11 (2011).
  8. Whelan, A. O., Villarreal-Ramos, B., Vordermeier, H. M., Hogarth, P. J. Development of an antibody to bovine IL-2 reveals multifunctional CD4 T(EM) cells in cattle naturally infected with bovine tuberculosis. PLoS ONE. 6, (12), e29194 (2011).
  9. Streitz, M., Tesfa, L., Yildirim, V., Yahyazadeh, A., Ulrichs, T., et al. Loss of receptor on tuberculin-reactive T-cells marks active pulmonary tuberculosis. PLoS ONE. 2, (8), e735 (2007).
  10. Soares, A. P., Scriba, T. J., Joseph, S., Harbacheuski, R., Murray, R. A., et al. Bacillus Calmette-Guérin vaccination of human newborns induces T cells with complex cytokine and phenotypic profiles. Journal of immunology. 180, 3569-3577 (2008).
  11. Waters, W. R., Palmer, M. V., Buddle, B. M., Vordermeier, H. M. Bovine tuberculosis vaccine research: historical perspectives and recent advances. Vaccine. 30, (16), 2611-2622 (2012).
  12. Letvin, N. L., Mascola, J. R., Sun, Y., Gorgone, D. A., Buzby, A. P., et al. Preserved CD4+ central memory T cells and survival in vaccinated SIV-challenged monkeys. Science. 312, (5779), 1530-1533 (2006).
  13. Mattapallil, J. J., Douek, D. C., Buckler-White, A., Montefiori, D., Letvin, N. L., et al. Vaccination preserves CD4 memory T cells during acute simian immunodeficiency virus challenge. The Journal of experimental medicine. 203, (6), 1533-1541 (2006).
  14. Lindenstrom, T., Knudsen, N. P. H., Agger, E. M., Andersen, P. Control of Chronic Mycobacterium tuberculosis .infection by CD4 KLRG1- IL-2-secreting central memory cells. The Journal of Immunology. 190, (12), 6311-6319 (2013).
  15. Todryk, S. M., Bejon, P., Mwangi, T., Plebanski, M., Urban, B., et al. Correlation of memory T cell responses against TRAP with protection from clinical malaria, and CD4 CD25 high T cells with susceptibility in Kenyans. PLoS ONE. 3, (4), e2027 (2008).
  16. Webster, D. P., Dunachie, S., Vuola, J. M., Berthoud, T., Keating, S., et al. Enhanced T cell-mediated protection against malaria in human challenges by using the recombinant poxviruses FP9 and modified vaccinia virus Ankara. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, (13), 4836-4841 (2005).
  17. Rie, A., Warren, R., Richardson, M., Victor, T. C., Gie, R. P., et al. Exogenous reinfection as a cause of recurrent tuberculosis after curative treatment. New England Journal of Medicine. 341, (16), 1174-1179 (1999).
  18. Caminero, J. A., Pena, M. J., Campos-Herrero, M. I., Rodríguez, J. C., Afonso, O., et al. Exogenous reinfection with tuberculosis on a European Island with a moderate incidence of disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, (3), 717-720 (2001).
  19. Sallusto, F., Lanzavecchia, A., Araki, K., Ahmed, R. From vaccines to memory and back. Immunity. 33, (4), 451-463 (2010).
  20. Millington, K. A., Gooding, S., Hinks, T. S. C., Reynolds, D. J. M., Lalvani, A. Mycobacterium tuberculosis.-specific cellular immune profiles suggest bacillary persistence decades after spontaneous cure in untreated tuberculosis. The Journal of infectious diseases. 202, (11), 1685-1689 (2010).
  21. Su, L. F., Kidd, B. A., Han, A., Kotzin, J. J., Davis, M. M. Virus-specific CD4(+) memory-phenotype T cells are abundant in unexposed adults. Immunity. 38, (2), 373-383 (2013).
  22. Goletti, D., Butera, O., Bizzoni, F., Casetti, R., Girardi, E., Poccia, F. Region of difference 1 antigen-specific CD4+ memory T cells correlate with a favorable outcome of tuberculosis. The Journal of infectious diseases. 194, (7), 984-992 (2006).
  23. Waters, W. R., et al. Efficacy and immunogenicity of Mycobacterium bovis. DeltaRD1 against aerosol M. bovis. infection in neonatal calves. Vaccine. 27, (8), 1201-1209 (2009).
  24. Hope, J. C., et al. Identification of surrogates and correlates of protection in protective immunity against Mycobacterium bovis. infection induced in neonatal calves by vaccination with M. bovis. BCG Pasteur and M. bovis. BCG Danish. Clinical and Vaccine Immunology. 18, (3), 373-379 (2011).
  25. Thom, M. L., et al. Duration of immunity against Mycobacterium bovis. following neonatal vaccination with bacillus Calmette-Guérin Danish: significant protection against infection at 12, but not 24, months. Clinical and Vaccine Immunology. 19, (8), 1254-1260 (2012).
  26. Aabye, M. G., Ravn, P., Johansen, I. S., Eugen-Olsen, J., Ruhwald, M. Incubation of whole blood at 39°C augments gamma interferon (IFN-γ)-induced protein 10 and IFN-γ responses to Mycobacterium tuberculosis .antigens. Clinical and vaccine immunology : CVI. 18, (7), 1150-1156 (2011).
  27. Maue, A. C., Waters, W. R., Davis, W. C., Palmer, M. V., Minion, F. C., Estes, D. M. Analysis of immune responses directed toward a recombinant early secretory antigenic target six-kilodalton protein-culture filtrate protein 10 fusion protein in Mycobacterium bovis.-infected cattle. Infection and Immunity. 73, (10), 6659-6667 (2005).
  28. Godkin, A. J., Thomas, H. C., Openshaw, P. J. Evolution of epitope-specific memory CD4(+) T cells after clearance of hepatitis C virus. Journal of immunology. 169, (4), 2210-2214 (2002).
  29. Todryk, S. M., et al. The relationship between human effector and memory T cells measured by ex vivo and cultured ELISPOT following recent and distal priming. Immunology. 128, (1), 83-91 (2009).
  30. Vordermeier, H. M., et al. Viral booster vaccines improve Mycobacterium bovis. BCG-induced protection against bovine tuberculosis. Infection and Immunity. 77, (8), 3364-3373 (2009).
  31. Orme, I. M. Induction of nonspecific acquired resistance and delayed-type hypersensitivity, but not specific acquired resistance in mice inoculated with killed mycobacterial vaccines. Infect. Immun. 56, (12), 3310-3312 (1988).
  32. Griffin, J. F., Mackintosh, C. G., Slobbe, L., Thomson, A. J., Buchan, G. S. Vaccine protocols to optimise the protective efficacy of BCG. Tubercle and lung disease : the official journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease. 79, (3), 135-143 (1999).
  33. Buddle, B. M., et al. Protection of cattle from bovine tuberculosis by vaccination with BCG by the respiratory or subcutaneous route, but not by vaccination with killed Mycobacterium vaccae. Research in veterinary science. 59, (1), 10-16 (1995).
  34. Lehmann, P. V., Zhang, W. Unique strengths of ELISPOT for T cell diagnostics. Methods in Molecular Biology. 792, (Chapter 1), 3-23 (2011).
  35. Tincati, C., Iii, A. J. C., Snyder-Cappione, J. E. Distinguishing latent from active Mycobacterium tuberculosis. infection using Elispot assays: looking beyond interferon-gamma). Cells. 1, (2), 99-99 (2012).
  36. Lash, G. E., Pinto, L. A. Multiplex cytokine analysis technologies. Expert review of vaccines. 9, (10), 1231-1237 (2010).
  37. Vordermeier, M., Whelan, A. O. ELISPOT assays to enumerate bovine IFN-γ-secreting cells for the development of novel vaccines against bovine tuberculosis. Methods in molecular biology. 792, 219-227 (2012).
  38. Han, S., Norimine, J., Palmer, G. H., Mwangi, W., Lahmers, K. K., Brown, W. C. Rapid deletion of antigen-specific CD4+ T cells following infection represents a strategy of immune evasion and persistence for Anaplasma marginale. Journal of immunology. 181, (11), 7759a-7769a (2008).
  39. Helden, M. J. G., et al. Pre-existing virus-specific CD8(+) T-cells provide protection against pneumovirus-induced disease in mice. Vaccine. 30, (45), 6382-6388 (2012).
Tillämpning av Långsiktigt odlade Interferon-γ Enzymkopplad immunospot analys för bedömning Effector och Memory T-cellssvar hos nötkreatur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maggioli, M. F., Palmer, M. V., Vordermeier, H. M., Whelan, A. O., Fosse, J. M., Nonnecke, B. J., Waters, W. R. Application of Long-term cultured Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle. J. Vis. Exp. (101), e52833, doi:10.3791/52833 (2015).More

Maggioli, M. F., Palmer, M. V., Vordermeier, H. M., Whelan, A. O., Fosse, J. M., Nonnecke, B. J., Waters, W. R. Application of Long-term cultured Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle. J. Vis. Exp. (101), e52833, doi:10.3791/52833 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter