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Immunology and Infection

मवेशी में effector और स्मृति टी सेल प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए लंबे समय तक सुसंस्कृत इंटरफेरॉन γ एंजाइम से जुड़ी Immunospot परख के आवेदन

doi: 10.3791/52833 Published: July 11, 2015

Summary

लंबे समय तक सुसंस्कृत इंटरफेरॉन γ एंजाइम से जुड़ी immunospot परख केंद्रीय स्मृति प्रतिक्रियाओं का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया और सुरक्षात्मक विरोधी माइकोबैक्टीरियल टीका प्रतिक्रियाओं के साथ संबद्ध किया गया है। इस परख के साथ, परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear माइकोबैक्टीरियल एंटीजन और इंटरल्यूकिन -2 14 दिनों के लिए, सक्रिय करने के भेदभाव और केंद्रीय स्मृति टी कोशिकाओं के विस्तार के साथ प्रेरित कर रहे हैं।

Abstract

Effector के और स्मृति टी कोशिकाओं प्रतिजन मान्यता निम्नलिखित भोले कोशिकाओं के विकास programing के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं। संक्रमण विस्तार के चरण के दौरान उत्पन्न टी कोशिकाओं का 95% तक नियंत्रित किया जाता है, तो समाप्त हो जाते हैं (यानी।, संकुचन चरण) और स्मृति टी कोशिकाओं कभी कभी एक जीवन भर के लिए बने हुए हैं। इंसानों में, स्मृति टी कोशिकाओं के दो कार्यात्मक विशिष्ट सबसेट लिम्फ नोड घर वापस आना रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति के आधार पर वर्णित किया गया है। केन्द्रीय स्मृति टी कोशिकाओं सीसी केमोकाइन रिसेप्टर 7 और CD45RO व्यक्त करते हैं और मुख्य रूप से माध्यमिक ल्य्म्फोइड अंगों के टी सेल के क्षेत्रों में स्थित हैं। Effector के स्मृति टी कोशिकाओं, CD45RO व्यक्त परिधीय या सूजन के ऊतकों को लिम्फोसाइट घर वापस आना के साथ जुड़े CCR7 और प्रदर्शन रिसेप्टर्स की कमी है। Effector टी कोशिकाओं CCR7 या CD45RO लेकिन इस तरह के इंटरफेरॉन γ के रूप में प्रतिजन का उत्पादन प्रेरक साइटोकिन्स, साथ मुठभेड़ पर या तो व्यक्त नहीं करते। इंटरफेरॉन γ रिलीज assays के गोजातीय और मानव तपेदिक के निदान के लिए उपयोग किया जाता है औरमुख्य रूप से प्रेरक और प्रेरक स्मृति टी सेल प्रतिक्रिया का पता लगाने। मानव में बंदर का इम्यूनो वायरस गैर मानव प्राइमेट के संक्रमण, टीबी चूहों में, और मलेरिया के साथ प्रदर्शन के रूप में टीकाकरण के लिए सीडी 4+ टी कोशिकाओं द्वारा केन्द्रीय स्मृति टी सेल प्रतिक्रिया, दूसरे हाथ पर, टीका प्रभावकारिता भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चूहों और इंसानों के साथ-साथ मवेशियों पर अप्रकाशित डेटा के साथ कई अध्ययनों, इंटरफेरॉन γ ELISPOT assays के केंद्रीय स्मृति टी सेल प्रतिक्रिया उपाय है कि प्रदर्शन किया है। इस परख के साथ, परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear, 10 से 14 दिनों (लंबी अवधि संस्कृति) के लिए प्रतिजन की एकाग्रता में कमी के प्रेरक प्रतिक्रियाओं चोटी और पतन के लिए अनुमति देने में संवर्धित कर रहे हैं; केंद्रीय स्मृति टी कोशिकाओं को सुविधाजनक बनाने के अंतर और संस्कृति के भीतर का विस्तार करने के लिए।

Introduction

Effector के और स्मृति टी कोशिकाओं प्रतिजन मान्यता के बाद भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं के विकास programing के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं। साइटोकाइन उत्पादक कोशिकाओं में भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं के भेदभाव सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं, प्रतिजन टी कोशिकाओं के लिए प्रस्तुति, सह उत्तेजना और ध्रुवीकृत साइटोकाइन उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन से रोगज़नक़ मान्यता की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए: प्रतिजन पेश कोशिकाओं को एक साथ प्रतिजन मान्यता के साथ, संकेत ट्रांसड्यूसर और के उत्प्रेरक के माध्यम से संकेत द्वारा टी सहायक में 1 (Th1) कोशिकाओं 1,2 टी कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ावा देता है, जो इंट्रासेल्युलर रोगजनकों, के जवाब में इंटरल्यूकिन (आईएल) -12 का उत्पादन प्रतिलेखन 4 (STAT4) और टी बॉक्स सेल सक्रियण, आईएल -2 उत्पादन, क्लोनल विस्तार और इंटरफेरॉन (IFN) -γ उत्पादन 3,4 करने के लिए अग्रणी, टी कोशिकाओं (टी शर्त) में व्यक्त की है। संक्रमण नियंत्रित किया जाता है, तो विस्तार के चरण के दौरान उत्पन्न टी कोशिकाओं की अप करने के लिए 95% (यानी, संकुचन समाप्त हो जाते हैंचरण) और स्मृति टी कोशिकाओं को एक जीवनकाल 5 के लिए कभी कभी, रहते हैं। Sallusto एट अल। 6, लिम्फ नोड घर वापस आना रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति के आधार पर मानव में स्मृति टी कोशिकाओं के दो कार्यात्मक विशिष्ट सबसेट का पता चला। केन्द्रीय स्मृति टी कोशिकाओं (टीसीएम) सीसी केमोकाइन रिसेप्टर (सीसीआर) -7 और CD45RO व्यक्त करते हैं और मुख्य रूप से माध्यमिक ल्य्म्फोइड अंगों के टी सेल के क्षेत्रों में स्थित हैं। टीसीएम प्रेरक समारोह, एक कम सक्रियण सीमा और उच्च आईएल -2 उत्पादन और proliferative क्षमता बनाए रखने के लिए सीमित है। Effector के स्मृति टी कोशिकाओं (मंदिर), CD45RO व्यक्त परिधीय या सूजन के ऊतकों को घर वापस आना लिए CCR7 और प्रदर्शन रिसेप्टर्स की कमी है। Effector कोशिकाओं CCR7 या CD45RO या तो व्यक्त लेकिन तुरंत प्रतिजन मान्यता पर, इस तरह के IFN-γ के रूप में प्रेरक साइटोकिन्स, उपज नहीं है।

IFN-γ रिलीज assays के (IGRA) गोजातीय और मानव तपेदिक 7 के निदान के लिए किया जाता है। माइकोबैक्टीरियम बोविस मानव सीए, जबकि गोजातीय क्षय रोग (बीटीबी) के प्रमुख एजेंट हैतपेदिक के सत्र माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग द्वारा मुख्य रूप से उत्पन्न होते हैं। इन परीक्षणों, पूरे रक्त या परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) के साथ एलिसा द्वारा या ELISPOT तकनीक का उपयोग कर IFN-γ उत्पादक कोशिकाओं का पता लगाने के माध्यम से मापा जाता है 16 घंटा और सतह पर तैरनेवाला भीतर IFN-γ उत्पादन से 24 के लिए माइकोबैक्टीरियल एंटीजन के साथ प्रेरित कर रहे हैं। संक्षिप्त उत्तेजना की अवधि का एक परिणाम के रूप में (यानी।, 16-24 ज) और तेजी से साइटोकाइन उत्पादन, पूर्व vivo assays के लिए मुख्य रूप से प्रेरक और मंदिर प्रतिक्रियाओं का पता लगाने। यह इन संस्कृतियों 8-10 में सेल आबादी के प्रवाह cytometric विश्लेषण के द्वारा पुष्टि की गई है।

पूर्व vivo IFN-γ प्रतिक्रियाओं नियमित तौर पर मवेशी द्वारा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया उन सहित तपेदिक टीके की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैनल मूल्यांकन में शामिल कर रहे हैं। सबसे प्रभावी गोजातीय टीबी के टीके विशिष्ट IFN-γ प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना है, लेकिन नहीं IFN-γ प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने वाले सभी टीके protectiv हैंई। इसके अलावा, संक्रमण से पहले के रूप में मापा, टीकाकरण द्वारा हासिल IFN-γ के स्तर को जरूरी सुरक्षा के साथ सहसंबंधी नहीं है। उदाहरण के लिए, अलग बीसीजी उपभेदों इसी तरह की सुरक्षा का स्तर 11 के बावजूद, पूर्व vivo IFN-γ प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए विभिन्न क्षमताओं हो सकता है। इस प्रकार, पूर्व vivo IGRAs तपेदिक के निदान के लिए और टीका प्रतिरक्षाजनकता तक पहुँचने के लिए मूल्यवान हैं; हालांकि, टीका प्रभावकारिता के predictors के रूप में उनके उपयोग सीमित है। मनुष्य 15,16 में चूहों 14 और मलेरिया में गैर मानव प्राइमेट 12,13, तपेदिक में बंदर का इम्यूनो वायरस (SIV) संक्रमण के साथ प्रदर्शन के रूप में टीकाकरण के लिए टीसीएम प्रतिक्रियाओं, दूसरे हाथ पर, टीका प्रभावकारिता भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

रोगज़नक़ निकासी में जिसके परिणामस्वरूप एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बाद, टीसीएम रखा जाता है और एक ही एजेंट द्वारा एक अंतिम दूसरा संक्रमण को सुरक्षा प्रदान करते हैं। इस परिदृश्य के लिए एक उल्लेखनीय अपवाद एम है तपेदिक infeइंसानों की ction है जिसमें उपचारात्मक विरोधी माइकोबैक्टीरियल चिकित्सा प्राप्त रोगियों को फिर से संक्रमण के लिए 17,18 अतिसंवेदनशील होते हैं। साथ ही, पुराने संक्रमण के दौरान प्रतिरक्षात्मक स्मृति गवर्निंग घटनाओं, प्रतिजनी उत्तेजना बनी रहती है, जिसमें अच्छी तरह से 19 से समझ नहीं रहे हैं। ऐसे मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) और तपेदिक के साथ के रूप में पुराने संक्रमण के दौरान, एक महत्वपूर्ण टीसीएम प्रतिक्रिया एक अनुकूल परिणाम 20,21 (एचआईवी के साथ तपेदिक और लक्षणहीन बीमारी के साथ जैसे, विलंबता) के साथ जुड़ा हुआ है। चूहों और इंसानों के साथ कई अध्ययनों से लंबी अवधि के सुसंस्कृत IFN-γ ELISPOT assays के टीसीएम प्रतिक्रियाओं 16,20-22 उपाय है कि प्रदर्शन किया है। इस परख के साथ, PBMCs, 10 से 14 दिनों के लिए प्रतिजन की एकाग्रता में कमी के प्रेरक प्रतिक्रियाओं चोटी और पतन के लिए अनुमति देने में संवर्धित कर रहे हैं; टीसीएम को सुविधाजनक बनाने के अंतर और संस्कृति के भीतर का विस्तार करने के लिए।

लंबे समय तक सुसंस्कृत IFN-γ ELISPOT assays के भी पशु चिकित्सा में इस्तेमाल किया गया हैअनुसंधान, अभी तक जवाब देने के कोशिकाओं के phenotype के कारण महत्वपूर्ण अभिकर्मकों की कमी, CCR7 करने के लिए विशेष रूप से एक एंटीबॉडी का आकलन करने के लिए मुश्किल हो गया है। प्रभावी गोजातीय टीबी के टीके [जैसे। एम की एक खुराक का उपयोग करते हुए बोविस Bacille Calmette Guerin (बीसीजी), बीसीजी बोविस ΔRD1] संरक्षण के सापेक्ष होती टीकाकरण निम्नलिखित लंबी अवधि के सुसंस्कृत IFN-γ ELISPOT प्रतिक्रियाओं (यानी, कम माइकोबैक्टीरियल बोझ को प्रकाश में लाना। वायरल-vectored एंटीजन 85A सबयूनिट टीका, या तनु एम द्वारा पीछा किया और कमी हुई टीबी से जुड़े पैथोलॉजी) विषमय एम के साथ बाद चुनौती के खिलाफ बोविस 23,24। इसके अलावा, लंबी अवधि के PBMC संस्कृतियों के भीतर विशिष्ट प्रतिजन IFN-γ-स्रावित कोशिकाओं की संख्या 12 महीनों में अधिक कर रहे हैं लेकिन सुरक्षा पहचाने पद एम की डिग्री के साथ correlating, नवजात बछड़ों की बीसीजी टीकाकरण के बाद 24 महीने में कमी बोविस चुनौती 25। इस परिदृश्य में, सुसंस्कृत IFN-γ ELISPOT एक हैवैक्सीन प्रभावकारिता की भविष्यवाणी उच्च लागत प्रभावकारिता परीक्षण के लिए वैक्सीन उम्मीदवारों को प्राथमिकता करने के लिए एक साधन उपलब्ध कराने के लिए एन महत्वपूर्ण उपकरण है। इसके अतिरिक्त, सुसंस्कृत ELISPOT तकनीक विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में विभिन्न प्रयोजनों के लिए एंटीजन या एंटीबॉडी बदलकर विभिन्न होस्ट करता है, रोगज़नक़ों और साइटोकिन्स के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Protocol

1. निम्न समाधानों को तैयार

  1. पूरा RPMI (cRMPI) एक 10% (मात्रा / मात्रा) की एकाग्रता, glutamine (2 माइक्रोन), सोडियम पाइरूवेट (1 माइक्रोन), गैर आवश्यक अमीनो एसिड (0.1 माइक्रोन), पेनिसिलिन भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) को जोड़कर तैयार करें -streptomycin (100 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन और 0.1 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) और 1640 RPMI में 2-mercaptoethanol (50 मिमी)।
  2. आसुत जल में सोडियम साइट्रेट (77 माइक्रोन), साइट्रिक एसिड (38 माइक्रोन), और डेक्सट्रोज (122 माइक्रोन), मिश्रण से, 2 एक्स एसिड साइट्रेट डेक्सट्रोज तैयार करें।
  3. तैयार करें सीए 2 + 2 मिलीग्राम + मुक्त फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 7.2 पीएच: सोडियम क्लोराइड (137 मिमी), KCl (2.7 मिमी), ना 2 HPO 4 (द्विक्षारकीय, 10 मिमी), के.एच. 2 पीओ 4 (अकेले आधार, 2 मिमी) आसुत जल में; 7.2 पीएच को समायोजित करें।
  4. पीबीएस (मात्रा / वजन, पीबीएस के 1G / 100 मिलीलीटर) में गोजातीय सीरम albumin जोड़कर पीबीएस 1% (पीबीएस 1% बीएसए) तैयार करें।
  5. पीबीएस + 0.05% के बीच 20 तैयार करेंपीबीएस (मात्रा / मात्रा के बीच के 500 μl पीबीएस के 20/1 एल) में 0.05% के बीच 20 जोड़कर (PBST)।
  6. आसुत जल में Tris (100 मिमी), एचसीएल (0.50 मिमी) के मिश्रण से 100 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.2 बफर तैयार करें।
  7. (35 एथिल शराब की मिलीग्राम / आसुत पानी की 100 मिलीलीटर, मात्रा / मात्रा) आसुत जल में एथिल अल्कोहल (पवित्रता ≥99.5%) गिराए द्वारा 35% इथेनॉल समाधान तैयार है।
  8. फ़िल्टर cRPMI, 2 एक्स एसिड साइट्रेट डेक्सट्रोज, पीबीएस, पीबीएस 0.22 फिल्टर का उपयोग कर 1% बीएसए बाँझ।

2. लंबे समय तक संवर्धित कोशिकाओं (14 दिन प्रोटोकॉल)

(पहला दिन)

  1. CRPMI में दो बार अंतिम एकाग्रता में प्रतिजन समाधान तैयार करें। एंटीजन विकल्प महत्वपूर्ण है और इस अध्ययन का उद्देश्य के अनुरूप होना चाहिए।
  2. पुनः संयोजक एम पतला (प्रत्येक प्रतिजन की; अंतिम एकाग्रता 1 माइक्रोग्राम / एमएल है) तपेदिक 2 माइक्रोग्राम / एमएल TB10.4 और प्रतिजन Ag85A प्रतिजन।
  3. पतला एम बोविस शुद्ध प्रोटीन व्युत्पन्न10 माइक्रोग्राम / एमएल (पीपीडी-बी, Prionics एजी) (अंतिम एकाग्रता 5 माइक्रोग्राम / एमएल) है।
  4. 2 माइक्रोग्राम / एमएल (1 माइक्रोग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता): पुनः संयोजक जल्दी स्रावी प्रतिजनी लक्ष्य 6 (ESAT-6) और संस्कृति छानना प्रोटीन 10 (सीएफपी-10) संलयन प्रोटीन (CFP10 rESAT -6) पतला।
    नोट: ये एंटीजन यक्ष्मा माइक्रोबैक्टीरिया की एंटीजन उत्प्रेरण immunodominant IFN-γ हैं और एम से PBMC को प्रोत्साहित करने के लिए शामिल किया जा सकता है बोविस पशुओं संक्रमित। बीसीजी या एम इन उपभेदों में नष्ट कर दिया जाता है (यानी, RD1) इन एंटीजन एन्कोडिंग क्षेत्र के रूप में, CFP10: बोविस ΔRD1 जानवरों rESAT -6 का जवाब नहीं है टीका लगाया। rESAT-6: ये अध्ययन में इस्तेमाल CFP10 डॉ सी मिनियन, आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी से एक तरह का उपहार था। TB10.4 और प्रतिजन Ag85A विषमय और टीका एम में मौजूद immunodominant एंटीजन होते हैं बोविस 37 उपभेदों। PPDB, एक शुद्ध प्रोटीन व्युत्पन्न के रूप में, गैर यक्ष्मा माइक्रोबैक्टीरिया के साथ साझा एंटीजन सहित कई एंटीजन की एक जटिल है। InfecCFP10 11: टीका जानवरों rESAT -6 का जवाब नहीं होना चाहिए, जबकि (CFP10 और PPDb: TB10.4, एजी 85A, rESAT-6 अर्थात्) टेड जानवरों संभवतः सभी एंटीजन का जवाब देंगे।
  5. प्लेट 500 μl / एक 24 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक जानवर के लिए quadruplicates में प्रतिजन समाधान की अच्छी तरह से। इस प्रोटोकॉल के लिए, एक पूल के रूप में एंटीजन का उपयोग करें; इस प्रकार सभी कुओं सभी एंटीजन और इस कदम (जैसे, अशक्त या माइटोजन के रूप में) कोई नियंत्रण शामिल का उपयोग करें। 39 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर थाली सेते हैं। मवेशियों के सामान्य तापमान 39 डिग्री सेल्सियस है; इस प्रकार, कुछ जांचकर्ताओं गोजातीय कोशिकाओं की संस्कृति के लिए 39 डिग्री सेल्सियस का उपयोग। इसके अलावा, मानव कोशिकाओं के साथ कुछ मामलों में, 39 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति लाभ 26,30 प्रदान करता है जोड़ा।
  6. 2 एक्स एसिड साइट्रेट-डेक्सट्रोज के 6 मिलीलीटर के साथ 16 या 18 जी चमड़े के नीचे सुई के साथ युग्मित पूर्व लोड सीरिंज; और कंठ venipuncture के द्वारा गोजातीय रक्त का 60 मिलीलीटर लीजिए।
  7. परिधीय रक्त buffy कोट भिन्न के मानक घनत्व ढाल centrifugation द्वारा PBMC पृथकMaue एट अल द्वारा वर्णित के रूप में 4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के लिए सेल एकाग्रता का समायोजन। 27
  8. प्रतिजन में कोशिकाओं (500 μl / अच्छी तरह से) जोड़ें प्रत्येक जानवर (2.5 कदम) के लिए चार प्रतियों में, 24 अच्छी तरह से थाली preloaded। 39 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर थाली सेते हैं।

(दिन तीन और सात)

  1. बाँझ तकनीक का प्रयोग, ध्यान सेल परत परेशान बिना प्रत्येक अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला के 500 μl को हटा दें।
  2. आईएल -2 युक्त 500 μl / जोड़कर अच्छी तरह से cRPMI द्वारा अच्छी तरह से मात्रा पुनर्भरण (अच्छी तरह से यानी 30 यू / μl, 15 यू /; पुनः संयोजक मानव आईएल -2 सिग्मा I7908)। 39 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर थाली सेते हैं।

(दिन 10 और 12)

  1. बाँझ तकनीक का उपयोग करना, प्रत्येक अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला के 750 μl को हटा दें। (आईएल -2) के बिना 750 μl / cRPMI के साथ अच्छी तरह से मात्रा की भरपाई होगी। 39 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर थाली सेते हैं।

(दिवस एक (लंबी अवधि संस्कृति प्रोटोकॉल के 12 वें दिन))

  1. चढ़ाना कोशिकाओं जब गलतियों से बचने के लिए, नमूने के प्रत्येक सेट के लिए ठीक से ELISPOT थाली लेबल: लंबी अवधि की कोशिकाओं के साथ साथ APCs और पूर्व vivo / अल्पकालिक कोशिकाओं के बिना प्रतिजन पेश कोशिकाओं (APCs), लंबी अवधि कोशिकाओं (चित्रा 1)। दो प्रतियों में कम से कम किया जाना चाहिए प्रत्येक उपचार (यानी प्रतिजनी उत्तेजना) के लिए replicates।
  2. पीबीएस में माउस विरोधी गोजातीय IFN-γ एंटीबॉडी (MCA2112, क्लोन CC330) (8 माइक्रोग्राम / एमएल) गिराए द्वारा कब्जा एंटीबॉडी समाधान तैयार है।
  3. एक multichannel pipettor का उपयोग 1 मिनट के लिए / अच्छी तरह से 35% इथेनॉल के 15 μl के साथ ELISPOT थाली के कुओं पूर्व गीला। झिल्ली क्षति को रोकने के लिए, परख के दौरान किसी भी बिंदु पर पिपेट सुझावों के साथ कुओं के नीचे छू नहीं है।
  4. धो थाली पीबीएस के 300 μl / अच्छी तरह से छह गुना। धो तरल पदार्थ थाली उलटा द्वारा खारिज किया जाना चाहिए। Washes थाली कुओं शुष्क करने की अनुमति नहीं दे रहा है, तेजी से किया जाना चाहिए।
  5. (चरण 1 ऊपर से) पर कब्जा विरोधी IFN-γ एंटीबॉडी की पिपेट 100 μl / अच्छी तरह से। 4 डिग्री सीओ / एन (एक zippered भंडारण बैग के अंदर थाली रखने के लिए) पर सेते हैं।

(दो दिन (लंबी अवधि संस्कृति प्रोटोकॉल के 13 वें दिन))

  1. दो बार अंतिम एकाग्रता में प्रतिजन समाधान तैयार करें। उपचार कर रहे हैं: कोई उत्तेजना (cRPMI), पीपीडी-बी (20 माइक्रोग्राम / एमएल, अंतिम एकाग्रता: 10 माइक्रोग्राम / एमएल), TB10.4 के प्रोटीन कॉकटेल और Ag85A (प्रत्येक प्रोटीन के 2 माइक्रोग्राम / एमएल, अंतिम एकाग्रता: 1 माइक्रोग्राम / प्रत्येक प्रोटीन की मिलीलीटर), rESAT-6: CFP10 (एम बोविस संक्रमण, 2 माइक्रोग्राम / एमएल, अंतिम एकाग्रता के लिए: इस तरह के pokeweed (20 माइक्रोग्राम / एमएल, अंतिम एकाग्रता के रूप में 1 माइक्रोग्राम / एमएल), और एक सकारात्मक नियंत्रण,: 10 माइक्रोग्राम / एमएल)। अन्य माइटोजन बजाय (जैसे, Concanavalin ए) PWM के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    नोट: इस चरण के लिए एंटीजन चार अलग उपचार रचना और एन हैंओटी (2.5 कदम के रूप में) एक पूल के रूप में इस्तेमाल किया। चार उपचार कर रहे हैं: एन एस, PPDb, प्रोटीन कॉकटेल (TB10.4 और Ag85A एक उपचार का गठन) और PWM।

4. लघु अवधि के सेल संस्कृति और पक्षपाती सेल (APCs) अलगाव

  1. (के तहत: लंबी अवधि के संस्कृति, 14 दिन प्रोटोकॉल) दिन 1 पर लहूलुहान एक ही जानवरों से 60 मिलीलीटर रक्त एकत्र और पहले की तरह PBMCs अलग।
  2. 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें। चढ़ाना कोशिकाओं जब लेबल ट्यूब स्पष्ट रूप से misallocation रोकने के लिए। इन कोशिकाओं के रूप में अल्पकालिक सेल संस्कृति (6.5 कदम) भी APCs अलगाव के लिए इस्तेमाल किया है और किया जाएगा। पशु संख्या और (: पूर्व vivo, अल्पकालिक या ताजा कोशिकाओं को इस मामले में) संस्कृति के प्रकार दोनों के साथ लेबल ट्यूबों।
  3. थाली उलटा द्वारा ELISPOT से अतिरिक्त कब्जा एंटीबॉडी निकालें। प्लेटों 300 μl PBST के साथ 6 बार धोएं।
  4. जितना संभव हो उतना PBST निकालें। पिपेट लंबी अवधि की कोशिकाओं के साथ साथ APCs के रूप में चिह्नित वेल्स को सेल निलंबन के 50 μl। ब्लॉक अन्य wel केcRPMI के 200 μl / अच्छी तरह से साथ रास। 90 मिनट या 39 डिग्री सेल्सियस सेते पूर्व गर्म cRPMI करने के लिए या 39 डिग्री सेल्सियस (बाद के चरणों के लिए आवश्यक)। पक्षपाती सेल (APCs) अलगाव के लिए इस्तेमाल नहीं ताजा PBMCs बाद के चरणों में की जरूरत होगी और संग्रहित किया जाना चाहिए।

5. संवर्धित कोशिकाओं

  1. 90 मिनट ऊष्मायन (कदम 4.4, अल्पकालिक संस्कृति और पक्षपाती सेल अलगाव कदम), फसल लंबे समय तक संवर्धित कोशिकाओं के दौरान।
  2. ऊपर और नीचे कोशिकाओं के साथ 5 या 10 μl pipettes, पिपेट मीडिया का उपयोग करते हुए चार प्रतियों एक एकल 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक जानवर से प्रतिकृति गठबंधन, कोशिकाओं को अलग करने के लिए। 400 जी पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
  3. Centrifugation के बाद, ट्यूब उलटा द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें। सेल गोली बेदखल। यदि आवश्यक हो तो धीरे, गोली फिर से निलंबित, पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें। Centrifugation के दोहराएँ। दो बार धोने कदम दोहराएँ। 1ml cRPMI में कोशिकाओं से निलंबित फिर से धीरे ट्यूब उलटा द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें और। सेल एकाग्रता समायोजित2 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल।

6. चढ़ाना ताजा और सुसंस्कृत PBMCs

  1. 90 मिनट ऊष्मायन के बाद, 30 सेकंड के लिए थाली प्रकार के बरतन पर प्लेटें हिला। थाली उलटा द्वारा गैर पक्षपाती कोशिकाओं को निकाल दें। पिपेट 150 μl / गर्म cRPMI की अच्छी तरह से (के तहत चरण 4 से: लघु अवधि कोशिकाओं और पक्षपाती सेल (APCs) अलगाव कदम)।
  2. प्लेटों हिला और धोने के तरल पदार्थ त्यागें। दोहराएँ धोने 3 बार। 100 μl / अच्छी तरह से उचित कुओं में प्रत्येक प्रतिजन जोड़ें (पूर्व लेबल)।
  3. कोशिकाओं की थाली के लिए, लंबी अवधि की कोशिकाओं के साथ साथ APCs के रूप में चिह्नित कुओं में पिपेट 100 μl / अच्छी तरह से लंबी अवधि के सुसंस्कृत सेल निलंबन (2 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल)। एपीसी कुएं में पहले से ही है के रूप में इस चरण में जोड़ा लंबे समय तक कोशिकाओं को एक ही जानवर से कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें। विभिन्न जानवरों से एपीसी है और लंबे समय तक संवर्धित कोशिकाओं मिश्रण नहीं है।
  4. एपीसी बिना कुओं में लंबी अवधि के सुसंस्कृत सेल निलंबन के पिपेट 100 μl / अच्छी तरह से (2 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल)लंबी अवधि के संस्कृति जवाबी कार्रवाई के लिए एपीसी आवश्यकता के आकलन के लिए है।
  5. 100 μl / अच्छी तरह से अल्पकालिक कोशिकाओं (हौसले से अलग और 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल) समायोजित पूर्व vivo प्रतिक्रिया मूल्यांकन के लिए जोड़ें। 39 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्लेटें हे / एन सेते हैं। प्लेटों फ्लैट झूठ बोल रहे हैं कि यह सुनिश्चित करें और प्लेट ढेर नहीं है।
    नोट: सेल phenotype के विश्लेषण वांछित है, प्रवाह cytometry एक सहायक परख के रूप में किया जा सकता है। प्रकोष्ठों ELISPOT परख के लिए वर्णित के रूप में 96 अच्छी तरह से यू नीचे प्लेटों (बजाय ELISPOT की प्लेट) में चढ़ाया जाता है। कब्जा एंटीबॉडी सोखना (3.4-3.5 कदम) को छोड़ दिया जाना चाहिए। कोशिकाओं तो 39 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 और प्रदर्शन किया एक मानक सेल धुंधला प्रोटोकॉल पर हे / एन incubated हैं। सेल धुंधला अभिकर्मकों अभिकर्मकों तालिका में शामिल किए गए हैं।

तीन दिन (लंबी अवधि संस्कृति प्रोटोकॉल के 14 वें दिन)

  1. पता लगाने के एंटीबॉडी (माउस विरोधी गोजातीय IFN-γ, क्लोन CC3 पतला02) पीबीएस 1% BSA में 5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर। कुओं से तरल पदार्थ त्यागें और प्लेटें धोने: एक अतिरिक्त 6 बार पहले और बीच में washes, एक बार DH 2 ओ (300 μl / अच्छी तरह से) के साथ 10 सेकंड के लिए एक प्रकार के बरतन पर हर बार रखकर PBST के साथ छह बार (300 μl / अच्छी तरह से), पीबीएस के साथ PBST के साथ (300 μl / अच्छी तरह से) और दो बार (300 μl / अच्छी तरह से)। कोशिकाओं प्लेटों से हटा रहे हैं के बाद कोई जैव सुरक्षा चिंताओं को लागू होते हैं, और, प्रक्रियाओं जैविक सुरक्षा अलमारियाँ बाहर प्रदर्शन किया जा सकता है।
  2. त्यागें धोने तरल पदार्थ। कागज तौलिए पर थाली दोहन से जितना संभव हो उतना धोने तरल पदार्थ निकालें। पता लगाने के एंटीबॉडी जोड़ें (100 μl / अच्छी तरह से)।
  3. पर 120 मिनट या 39 डिग्री सेल्सियस के लिए प्लेटें सेते इस ऊष्मायन चरण के दौरान, निर्माता के निर्देशों का पालन alkaline फॉस्फेट समाधान तैयार है। उपयोग करने से पहले तीस मिनट (यानी, वेल्स को पता लगाने के एंटीबॉडी के अलावा के बाद 90 मिनट) PBST में अभिकर्मक पतला। अभिकर्मकों मिश्रण और आरटी पर incubated धीरे ट्यूब पलटना।
  4. 12 के बाद0 मिनट ऊष्मायन, थाली उलटा द्वारा अतिरिक्त पता लगाने के एंटीबॉडी त्यागें। धो थाली PBST के साथ 6 बार (300 μl / अच्छी तरह से)। कागज तौलिए पर थाली दोहन से जितना संभव हो उतना धोने तरल पदार्थ निकालें।
  5. 100 μl / अच्छी तरह से (चरण 3 ऊपर से) alkaline फॉस्फेट समाधान जोड़ें। आरटी पर 45 मिनट के लिए प्लेटें सेते हैं। तरल पदार्थ त्यागें और PBST के साथ प्रत्येक थाली में 6 बार धोने (300 μl / अच्छी तरह से)।
  6. 'निर्माताओं के निर्देश (वेक्टर ब्लू एपी सब्सट्रेट तृतीय) निम्नलिखित सब्सट्रेट समाधान तैयार: 100 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.2 बफर में अभिकर्मकों पतला। पिपेट 50 μl / सब्सट्रेट समाधान की अच्छी तरह से।
  7. नीले रंग (लगभग 30 मिनट) विकसित करने के लिए शुरू होता है जब तक आरटी पर सेते हैं। तरल पदार्थ त्यागें और DH 2 ओ की प्रचुर मात्रा के साथ प्लेटें धोने झिल्ली को बेनकाब वापस कुओं की धोने और शुष्क हवा की थाली अनुमति देने के लिए नीचे की थाली निकालें।
  8. एक stereomicroscope का उपयोग, मैन्युअल immunospot छवि विश्लेषक या ELISPOT पाठक (तालिका 1), या पर प्लेटें पढ़ें। वैकल्पिक रूप से, प्लेटें रखनापढ़ने जब तक आरटी पर अंधेरे में। क्योंकि प्रतिक्रिया सब्सट्रेट के उच्च स्थिरता की, गुणवत्ता कई वर्षों के लिए संरक्षित है।
    नोट: सेल और प्रतिजन सांद्रता बेशुमार स्पॉट 23,24,27,37 के साथ कुओं से बचने के लिए अनुकूलित किया गया। यह बेशुमार स्पॉट गठन के विभिन्न सेटिंग्स में या कारण जैविक विभिन्नता के लिए होते हैं कि संभव है। यदि यह मामला है एक पठनीय मौके गिनती प्रतिक्रिया प्राप्त किया जाता है तो, सेल एकाग्रता अनुकूलित किया जाना चाहिए।

7. प्लेट्स पढ़ना और डेटा विश्लेषण

  1. सेलुलर प्रौद्योगिकी लिमिटेड (सीटीएल) ELISPOT प्लेट रीडर गाइड (तालिका 1) के अनुसार विश्लेषण करते हैं। स्पॉट मायने रखता है कुओं में से प्रत्येक के लिए प्राप्त कर रहे हैं के बाद, डुप्लिकेट के बीच औसत की गणना। प्रत्येक प्रतिजनी प्रोत्साहन के लिए विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रतिजन उत्तेजित कुओं की है कि गैर उत्तेजित कुओं में स्पॉट की औसत संख्या घटाकर की जाती है।

Representative Results

एम के साथ लगभग एक महीने के बाद एयरोसोल संक्रमण बोविस (10 4 कॉलोनी के गठन इकाइयों), PBMCs संक्रमित से (एन = 8) और नियंत्रण जानवर (एन = 8) एंटीजन और 13 दिनों के लिए आईएल -2 की उपस्थिति में सुसंस्कृत थे। टीसीएम प्रतिक्रियाओं के विकास के संक्रमण के बाद IFN-γ ELISPOT परख का उपयोग निर्धारित किया गया था। (APCs की उपस्थिति या अनुपस्थिति में) प्रतिनिधि टीसीएम और पूर्व vivo IFN-γ चित्र 1 में दिखाया जाता है संक्रमित पशुओं (तीन जानवरों) और एक गैर-संक्रमित जानवर (एक जानवर) से ELISPOT के हिमायती हैं। एक लंबी अवधि के सफल IFN-γ IFN-γ उत्पादक कोशिकाओं में ELISPOT परख परिणाम प्रेरित शर्तों के तहत और गैर संक्रमित जानवरों में से एक प्रतिक्रिया के अभाव के पास और गैर प्रेरित शर्तों के तहत (स्पॉट-बनाने कोशिकाओं, एसएफसी)। इसके अलावा, एक मजबूत टी सेल प्रतिक्रिया PWM के जवाब में हो जाना चाहिए। एम के लिए विशिष्ट प्रतिक्रियाओं CFP10 प्रतिजनी उत्तेजना: बोविस पीपीडी-बी या rESAT -6 द्वारा मूल्यांकन किया गया। जैसा कि आकृति में दिखाया गया है1, मजबूत टीसीएम और पूर्व पीपीडी-बी और rESAT-6 के लिए विवो प्रतिक्रियाएं: CFP10 सभी तीन एम से पता चला रहे थे बोविस पशुओं -infected। कोई टीसीएम और पूर्व vivo प्रतिक्रियाओं के लिए न्यूनतम नियंत्रण जानवर से पता चला रहे थे। ऑटोलॉगस APCs के अभाव में सुसंस्कृत लंबी अवधि कोशिकाओं द्वारा बहुत कम प्रतिक्रियाओं के द्वारा प्रदर्शन के रूप में भी, APCs की उपस्थिति, संक्रमित पशुओं द्वारा इष्टतम टीसीएम प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक था। एम से PBMCs द्वारा IFN-γ प्रतिक्रिया बोविस संक्रमित और गैर संक्रमित जानवरों चित्रा 2 में प्रस्तुत कर रहे हैं। प्रत्येक जानवर से राज्य वित्त निगम की संख्या पीपीडी-बी ऋण अकेले मीडिया के लिए संबंधित प्रतिक्रिया के जवाब में नकली नमूने में राज्य वित्त निगम की औसत संख्या के रूप में गणना की गई। प्रतिक्रियाएँ 10 6 कोशिकाओं के लिए अनुमान लगाया गया था। मतभेद प्रतिक्रियाएँ (पी <0.05) संक्रमण की स्थिति, उपस्थिति या APCs और संस्कृति अवधि (अर्थात।, लंबी अवधि के संस्कृति बनाम पूर्व vivo संस्कृति) की अनुपस्थिति पर आधारित है।

प्लेटों की छवि हासिल करना
1। मशीन को चालू करें
2। ओपन "इम्यूनो कब्जा" संस्करण 6.3 सॉफ्टवेयर।
3। चरण 1: का चयन थाली प्रकार।
4। चरण 2: लोड थाली।
5। चरण 3: स्कैनिंग विकल्पों का चयन करें।
6। चरण 4: स्कैनिंग शुरू करते हैं।
7। थाली का अवलोकन छवि प्राप्त करते हैं।
8। थाली निकालें।
9। "इम्यूनो कब्जा" सॉफ्टवेयर से बाहर निकलें।
स्थान बनाने इकाइयों की गिनती
1। "इम्यूनो स्पॉट कब्जा" संस्करण 5.0 सॉफ्टवेयर खोलें।
2। चयन करें ओर्ब टी प्रकार: सामान्य।
3। चयन करें गिनती मॉड्यूल: स्मार्ट गिनती।
4। चरण 1: लोड थाली।
5। चरण 2: गिनती मानकों को परिभाषित: स्पॉट मान्यता की कसौटी पर सटीकता के विभिन्न स्थानों के साथ कुओं पर।
6। ऑटो गिनती शुरू करो।
गुणवत्ता नियंत्रण
1। ओपन "Immunospot कब्जा" संस्करण 5.0 सॉफ्टवेयर।
2। चयन करें गिनती मॉड्यूल: गुणवत्ता नियंत्रण।
3। चरण 1: लोड थाली।
4। चरण 2: व्यक्तिगत रूप से प्रकाश डाला कुओं का विश्लेषण करें।
5। गुणवत्ता नियंत्रण खत्म करो।

तालिका 1 - AutoImmun Diagnostika ELISPOT पाठक छवि अधिग्रहण और सेल प्रक्रिया गिनती।

ove_content "के लिए: रख-together.within-पेज =" हमेशा "> चित्र 1
ELISPOT परख γ एक लंबी अवधि के सुसंस्कृत IFN- से कुओं की चित्रा 1. छवि। संवर्धित IFN-γ ELISPOT परख विषमय एम के साथ चुनौती के बाद approximatelyone माह प्रदर्शन किया गया था बोविस (तीन जानवरों)। गैर संक्रमित जानवरों नियंत्रण (एक जानवर) के रूप में शामिल किया गया है लंबे समय तक सेल लाइनों पुनः संयोजक Ag85A (1 माइक्रोग्राम / एमएल), TB10.4 (1 माइक्रोग्राम / एमएल) की एक कॉकटेल के साथ PBMC प्रेरक द्वारा उत्पन्न थे, rESAT-6। CFP10 (1 माइक्रोग्राम / एमएल) और पीपीडी-बी ऑटोलॉगस एपीसी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में ELISPOT प्लेटों के स्थानांतरण के द्वारा पीछा किया 13 दिनों के लिए (5 माइक्रोग्राम / एमएल)। PBMC दिन 13 पर पृथक और ELISPOT प्लेटों में सीधे चढ़ाया के लघु अवधि कोशिकाओं शामिल थे। लंबे समय तक और अल्पकालिक कोशिकाओं पीपीडी-बी (10 माइक्रोग्राम / एमएल), rESAT-6 के साथ प्रेरित गया: 5 (CFP10 (1 माइक्रोग्राम / एमएल), मध्यम अकेले या pokeweed माइटोजन &# 956; जी / एमएल) के 24 घंटे के लिए।

चित्र 2
एम के लिए ELISPOT प्रतिक्रिया γ एक लंबी अवधि के सुसंस्कृत IFN- से चित्रा 2. प्रतिनिधि परिणाम बोविस शुद्ध प्रोटीन व्युत्पन्न (पीपीडी-बी)। संवर्धित IFN-γELISPOT परख विषमय एम के साथ चुनौती के बाद approximatelyone माह प्रदर्शन किया गया था बोविस (आठ जानवरों)। गैर संक्रमित जानवरों आठ जानवरों लंबे समय तक कोशिकाओं को पुनः संयोजक Ag85A के एक कॉकटेल (1 माइक्रोग्राम / एमएल), TB10.4 (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ PBMC प्रेरक द्वारा उत्पन्न किया गया (नियंत्रण के रूप में शामिल किए गए rESAT-6: CFP10 (1 माइक्रोग्राम / एमएल) और पीपीडी-बी ऑटोलॉगस APCs की उपस्थिति या अनुपस्थिति में ELISPOT प्लेटों के स्थानांतरण के द्वारा पीछा किया 13 दिनों के लिए (5 माइक्रोग्राम / एमएल)। अल्पकालिक कोशिकाओं PBMC के शामिल 13 दिन पर अलग-थलग और ELISPOT थाली में सीधे चढ़ाया । लंबे समय तक और थानेदारRT अवधि कोशिकाओं अकेले 24 घंटे के लिए पीपीडी-बी (10 माइक्रोग्राम / एमएल) या मध्यम साथ प्रेरित किया गया। प्रत्येक जानवर (एसएफसी / 10 6 कोशिकाओं) से विशिष्ट प्रतिक्रियाओं पीपीडी-बी (नकली नमूने का औसत) शून्य से अकेले मीडिया की प्रतिक्रिया के जवाब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं।

Discussion

लंबी अवधि के सुसंस्कृत ELISPOT assays में IFN-γ उत्पादन मनुष्यों में टीसीएम करने के लिए आम तौर पर की वजह से है, लेकिन यह प्रतिक्रिया संस्कृति में विकसित कैसे खराब समझा जाता है। चाहे टीसीएम संचलन में मौजूद हैं और इन विट्रो में विस्तार, या टीसीएम प्रतिक्रियाओं संस्कृति के दौरान टीसीएम में प्रेरक और मंदिर कोशिकाओं के भेदभाव से परिणाम अगर ज्ञात नहीं है। हालांकि, मनुष्यों से नमूनों के साथ पढ़ाई पूर्व vivo और लंबी अवधि के सुसंस्कृत IFN-γ ELISPOT assays से सीडी 4+ टी कोशिकाओं टीसीएम प्रतिक्रियाओं प्रेरक कोशिकाओं 28 से विकसित नहीं है जिसका अर्थ है कि असंबंधित मिलान में specificities है कि मिल गया है। जाहिर है, प्रतिक्रिया की अवधि अलग-अलग हो सकता है, लेकिन रोगज़नक़ निकासी हासिल की है, तो अंत में दोनों पूर्व vivo और टीसीएम प्रतिक्रियाओं गिरावट। इसके अलावा, लंबी अवधि संस्कृतियों की प्रतिक्रियाएं जल्दी और लंबे समय प्रतिजनी भड़काना के बाद मापा (प्रेरक प्रतिक्रिया कम है), यह दर्शाता है सहसंबंधी दिखाया गया है कि विरोधी के बाद जल्दी और लंबे समय टीसीएम आबादी परिसंचारीGenic भड़काना विवो में संबंधित बनी हुई है। दूसरी ओर, पूर्व vivo प्रतिक्रिया की भयावहता स्मृति प्रतिक्रिया 29 की भयावहता से संबंधित होना प्रकट नहीं होता है। इन परिणामों के लंबी अवधि के सुसंस्कृत IFN-γ ELISPOT प्रतिक्रियाओं टीसीएम की इन विट्रो में विस्तार और नमूने में प्रेरक प्रतिक्रियाओं का एक संबद्ध गिरावट आई है, बजाय टीसीएम फेनोटाइप में प्रेरक कोशिकाओं के भेदभाव से होने वाली सुझाव देते हैं।

मवेशियों के साथ लंबी अवधि के IFN-γ ELISPOT assays के द्वारा पता लगाया जवाब करने के लिए प्रेरक और स्मृति कैंपेन्स के रिश्तेदार योगदान ज्ञात नहीं है। हाल के अध्ययनों से वैक्सीन के बीच एक संबंध एम के साथ बाद में प्रयोगात्मक संक्रमण के खिलाफ लंबे समय तक सुसंस्कृत IFN-γ ELISPOT प्रतिक्रियाएं और संरक्षण हासिल संकेत मिलता है बोविस 23-24। यह टीकाकरण के लिए कमजोर लंबी अवधि के IFN-γ ELISPOT प्रतिक्रियाओं का संरक्षण 30 के अभाव के साथ जुड़े रहे हैं कि सूचना दी गई है। दोनों रहते हैं और मारएड टीके इसी तरह पूर्व vivo IFN-γ ELISPOT प्रतिक्रियाओं को प्रेरित है, लेकिन लाइव बीसीजी टीकाकरण के साथ मारे गए वैक्सीन की तैयारी कर की तुलना में मजबूत लंबी अवधि के सुसंस्कृत IFN-γ ELISPOT प्रतिक्रियाएं प्राप्त की जाती है। मारे गए योगों विषमय यक्ष्मा माइक्रोबैक्टीरिया 31-32, 33 के साथ चुनौती के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करने में विफल है, जबकि दिलचस्प है, लाइव टीके सुरक्षा कर रहे हैं।

टीसीएम प्रतिक्रियाओं का आकलन भी PBMC से इन कोशिकाओं छँटाई द्वारा संभव है। PBMC से टीसीएम का प्रत्यक्ष संवर्धन, हालांकि, बेहद निजी प्रशिक्षित महंगे उपकरणों की आवश्यकता है, और इन कोशिकाओं को रक्त प्रवाह में कई नहीं कर रहे हैं के रूप में मुश्किल है। PBMC के लंबे समय तक संस्कृति मंदिर और महंगे उपकरणों के बिना प्रेरक कोशिकाओं पर टीसीएम के संवर्धन प्रदान करता है; इन टी सेल आबादी इन विट्रो में विस्तार कर रहे हैं क्योंकि हालांकि, वे इन विवो स्मृति प्रतिक्रियाओं की कम प्रतिनिधि हो सकता है। यह लंबी अवधि के संस्कृति या टीसीएम प्रकार का उपयोग कर (IFN-γ स्मृति प्रतिक्रियाओं का उपयोग करने के लिए संभव हैसाइटोकाइन ELISAs 34, साइटोकाइन मनका सरणियों (CBA), इंट्रासेल्युलर धुंधला (आईसीएस), या साइटोकाइन प्रोटीन (सीपीए): जैसे ELISPOT के अलावा अन्य assays के द्वारा रणनीतियों) आईएनजी। इन विधियों; हालांकि, आम तौर पर ELISPOT 35 assays की तुलना में कम संवेदनशील होते हैं।

ELISPOT का एक लाभ यह शीघ्र ही अपनी रिहाई के अन्य कोशिकाओं द्वारा एंजाइमी दरार या साइटोकाइन तेज से सतह पर तैरनेवाला और गिरावट में कमजोर पड़ने को रोकने के बाद साइटोकाइन के तत्काल कब्जा पता लगाने के लिए की क्षमता है। ELISPOT assays के भी शोर परिदृश्यों (यानी, कम विशिष्ट प्रतिक्रियाएं) से 35 कम संकेत में सटीक परिणाम प्रदान करने साइटोकिन्स उत्पादन एकल कक्षों का पता लगाने। इसके अलावा, आईसीएस के साथ, जारी करने से पहले साइटोकिन्स का पता लगाने के साइटोकिन्स उत्पादक कोशिकाओं की झूठी पहचान में हो सकता है (उदाहरण के लिए।, की वजह से स्रावी प्रक्रिया से पहले या दौरान बाद translational मॉडुलन के लिए) 34। साइटोकाइन स्राव को कम से कम करने के लिए आईसीएस assays के साथ कार्यरत परिवहन अवरोधकों(गॉल्जी रोक प्रोटीन के रूप में जाना जाता है) प्रतिजन उत्तेजना के दौरान होने के कारण अंततः साइटोकाइन उत्पादन 35 को प्रभावित इन प्रोटीनों की सेल विषाक्तता के लिए सेल उत्तेजना की अवधि सीमा।

साथ ही कहा - (। यानी, आईसीएस) के साथ CBA, सीपीए और आईसीएस और / या कोशिका की सतह मार्कर अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए एक साथ कई साइटोकिन्स को मापने के लिए उपयोगी तकनीकों हैं। इसलिए, इन तरीकों IFN-γ ELISPOT परख 36 के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है। पिछले गोजातीय टीबी वैक्सीन प्रभावकारिता पढ़ाई ELISPOT परख के माध्यम से टीसीएम प्रतिक्रियाओं मापा जाता है, जबकि अन्य तकनीकों के द्वारा टीसीएम प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के तुलनीय परिणाम की संभावना निकलेगा। महत्वपूर्ण बात है, ELISPOT परख कम खर्चीला है और CBA, सीपीए और आईसीएस विश्लेषण तकनीक 34 से अधिक प्रदर्शन करने के लिए सरल है। एसएफसी के मैनुअल गिनती स्वचालित गिनती के लिए एक विकल्प है, और ELISPOT प्लेटों से पहले या स्थान ग के बाद, कम से कम गुणवत्ता नुकसान के साथ समय की लंबी अवधि के लिए आरटी पर संग्रहित किया जा सकता है37 ounting।

लंबी अवधि के सुसंस्कृत IFN-γ ELISPOT प्रतिक्रिया तपेदिक वैक्सीन प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करते समय स्मृति मानव द्वारा प्रतिक्रियाओं, और पशु का आकलन करने के लिए लागू किया गया है 14-16,31-32,33। । टीसीएम प्रतिक्रियाएं भी इस तरह के रूप में मवेशियों के कई अन्य संक्रामक एजेंटों, के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं ग्रहण कर रहे हैं: माइकोप्लाज्मा mycoides subsp mycoides 42, Anaplasma 38 और गोजातीय श्वसन syncytial वायरस 39 marginale। संभावित, लंबी अवधि के ELISPOT परख अन्य जानवरों की प्रजातियों, साइटोकिन्स और संक्रमण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। ये व्यापक आवेदन के कारण विशिष्ट अभिकर्मकों के मौजूदा सीमित उपलब्धता के लिए पशु चिकित्सा इम्यूनोलॉजी अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो जाएगा।

टीसीएम प्रतिक्रियाओं कई संक्रमणों के खिलाफ संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन मैसाचुसेट्स (रोग परिणाम भविष्यवाणी या टीका प्रभावकारिता के लिए) संक्रमण / टीकाकरण के बाद जल्दी उन्हें मापनेY बोझिल हो। पूर्व vivo और कम प्रतिजनी उत्तेजना की शर्तों के तहत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विश्लेषण से अधिक बार विशेष रूप से प्रतिरक्षात्मक स्मृति गठन की शुरुआत के दौरान, की वजह से स्मृति और प्रेरक प्रतिक्रियाओं के ओवरलैप करने के लिए, प्रेरक प्रतिक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करेंगे। प्रतिजन लोड नित्य है, जिसमें पुराने रोगों के संदर्भ में, पूर्व vivo प्रतिक्रियाओं प्रेरक सेल प्रतिक्रिया या स्मृति और प्रेरक सेल प्रतिक्रिया का एक संयोजन का आकलन करेंगे। लंबी अवधि के सुसंस्कृत IFN-γ ELISPOT परख, संभावना टीसीएम प्रतिक्रियाओं के बजाय प्रेरक टी सेल या संयुक्त सीडी 4+ टी सेल प्रतिक्रिया की माप के लिए सक्षम बनाता है, यहाँ का वर्णन किया। सारांश में, लंबी अवधि के सुसंस्कृत IFN-γ ELISPOT परख टी सेल स्मृति प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदान करता है और संक्रमण एजेंटों की एक किस्म के लिए कई प्रजातियों की स्मृति प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39।

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

3625-32000-104 और कृषि और खाद्य अनुसंधान पहल प्रतिस्पर्धी अनुदान नहीं: रिसर्च यूएसडीए, एआरएस क्रिस द्वारा समर्थित किया गया। खाद्य एवं कृषि के यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट से 2011-67015-30736। हम जेसिका पोलक, एम्मा Frimml-मॉर्गन, शैली ज़िम्मरमैन, क्रिस्टिन बास, ब्रूस PESCH, मौली Stafne, एलन जेन्सेन, और ट्रेसी पोर्टर उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए और साथ ही रेबेका मैडिसन, डौग एविंग, केटी Pille, जे स्टीफन, डेविड Lubbers धन्यवाद पशुओं के उत्कृष्ट देखभाल और हैंडलिंग के लिए रॉबिन Zeisness, और डेविड Panthen।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium citrate (dihydrate) Various
Citric acid (monohydrate) Various
Dextrose Various
ELISPOT PVDF plate Various
Vectastain ABC – AP KIT Standard Vector Laboratories AK-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit Vector Laboratories SK-5300
Ag85A Lionex LRP-0004.3 23, 24, 25, 37
TB 10.4 Lionex LRP-0061.6 23, 24, 25, 37
PPDb Prionics AG 7600055
rESAT-6:CFP10 Kind gift Dr. Minion, Iastate 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 Serotec MCA1783B 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 Serotec MCA2112 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 Serotec MCA1653GA
Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A Serotec MCA2434GA
Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 Abcam ab95665
Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 Serotec MCA1783PE
Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 Invitrogen A-21130
Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 SouthernBiotechnology 1080-193
Goat anti-rat IgG-APC Invitrogen A10540
BD Cytofix/Cytoperm™ BD Biosciences 554714
BrefeldinA Sigma-Aldrich B7651
Pokeweed Mitogen Sigma-Aldrich L8777
Recombinat human Interleukin 2 Sigma-Aldrich I7908

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References

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मवेशी में effector और स्मृति टी सेल प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए लंबे समय तक सुसंस्कृत इंटरफेरॉन γ एंजाइम से जुड़ी Immunospot परख के आवेदन
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Maggioli, M. F., Palmer, M. V., Vordermeier, H. M., Whelan, A. O., Fosse, J. M., Nonnecke, B. J., Waters, W. R. Application of Long-term cultured Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle. J. Vis. Exp. (101), e52833, doi:10.3791/52833 (2015).More

Maggioli, M. F., Palmer, M. V., Vordermeier, H. M., Whelan, A. O., Fosse, J. M., Nonnecke, B. J., Waters, W. R. Application of Long-term cultured Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle. J. Vis. Exp. (101), e52833, doi:10.3791/52833 (2015).

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