Chlorure ferrique induite souris thrombose type sur l'artère carotide et Mesentery navire

Summary

The FeCl₃ induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Abstract

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

Introduction

L'étude des mécanismes impliqués dans le développement de la thrombose et de l'évaluation de l'efficacité des médicaments anti-thrombotiques nécessite bien établi des modèles animaux expérimentaux. Modèles animales importantes ont été les premiers à être utilisés car ils fournissent de grands navires plus semblable à l'homme que les rongeurs ^1. Cependant, le coût élevé, les grandes installations nécessaires et la difficulté à les manipuler génétiquement sont des inconvénients majeurs à leur utilisation et de grands animaux sont maintenant limités à des études précliniques fin une fois les tests préliminaires sur des rongeurs ont donné des résultats concluants ^2. Avec une large disponibilité de souches transgéniques et knock-out et leur petite taille qui minimise la quantité de médicaments antithrombotiques requises pour les essais in vivo, les souris sont principalement utilisés pour la recherche sur la thrombose. Par conséquent, plusieurs modèles de troubles thrombotiques ont été développées chez des souris ^3.

Beaucoup de modèles de thrombose établies perturbent les intimune couche de la paroi du vaisseau, suivie par l'exposition de la matrice extracellulaire sous endotheliales à l'écoulement de sang induire la formation de caillots sanguins ^4. Le thrombus peut résulter de l'exposition du collagène qui déclenche l'activation des plaquettes et / ou de l'exposition du facteur tissulaire qui active la cascade de coagulation ^5. Plusieurs techniques sont ensuite utilisées pour atteindre la blessure de cuve initial. Pierangeli et al. A développé un modèle de rupture mécanique avec un outil de microchirurgie sur la veine fémorale ^6. Kikushi et al. Décrit un modèle qui consiste en l'administration d'un composé réactif de photo (rose Bengale) qui accumule dans la bicouche lipidique des cellules endothéliales, suivie par l'excitation déterminée de la paroi du vaisseau d'intérêt avec une lumière verte (540 nm) ^7. La blessure peut également être induite par un court-éclairage à haute intensité de laser d'impulsion ^8. Une autre technique d'abord mis en place sur l'artère carotide de ratsconsiste en l'application topique de chlorure ferrique (FeCl ₃₎ ^9. Dans ce cas, les résultats récipient de dénudation de radicaux libres générés par _FeCl3 qui provoque la peroxydation lipidique et la destruction des ¹⁰ cellules endotheliales. La blessure induit l'expression de plusieurs molécules d'adhésion de déclenchement adhérence et l'agrégation plaquettaire ainsi que le recrutement des leucocytes. Il a été démontré que les leucocytes, en particulier les neutrophiles jouent un rôle crucial dans l'activation de la cascade de coagulation du sang conduisant à la thrombose ^11. Cette méthode est bien adaptée à reproduire la cascade de coagulation; les enquêteurs doivent garder à l'esprit que, dans ce modèle de souris, la thrombose est généralement induite dans vaisseaux sains alors que la thrombose chez les humains se produit principalement en ex malade. vaisseaux athérosclérotiques.

Comme ce modèle est très simple à mettre en oeuvre et est également efficace chez les souris, il est maintenant le mode de thrombose principalement utilisél pour petit animal in vivo. En outre, cette technique offre la possibilité d'induire la formation de thrombus dans une variété de vaisseaux. vaisseaux cibles peuvent être des artères ou des veines de grand diamètre (carotide, fémorale, la veine cave) ou de petit diamètre (mésentère, cremaster) ^12-14. Plus récemment, il a également été utilisé sur l'artère cérébrale moyenne proximale de développer un modèle d'AVC ^15. La formation de thrombose peut être directement observé par microscopie intravitale après marquage fluorescent de plaquettes et de leucocytes ou surveillé en mesurant la diminution du flux sanguin avec une sonde de température ou un ^12,16,17 de la sonde Doppler. Plusieurs paramètres tels que le temps d'occlusion, temps de formation de thrombus ou de la taille d'un thrombus peuvent ensuite être étudiés. Les différences physiologiques entre les navires d'une enquête suite à des variations importantes dans le thrombus obtenu. Par conséquent, les chercheurs sélectionner habituellement le vaisseau cible en fonction des paramètres qui les intéressent la pour mesurerre et / ou le réglage ils veulent enquêter sur la maladie. Typiquement, le modèle sur l'artère carotide est plus pertinente pour la recherche sur l'athérothrombose liée à l'infarctus du myocarde ou accident vasculaire cérébral alors que les études sur la veine cave sont plus pertinentes pour la recherche sur la thrombose veineuse profonde. L'accessibilité des différents vaisseaux détermine également la méthode utilisée pour mesurer la croissance de thrombus. Par exemple, les vaisseaux mésentériques sont faciles d'accès qui rend ce modèle bien adapté pour l'observation microscopique intravitale et l'étude de la dynamique de la formation de thrombus. L'artère carotide est moins accessible mais plus grand débit permettant des mesures de sang et de fournir un excellent modèle pour étudier la thrombose occlusive.

Le modèle de thrombose induite de chlorure ferrique a fourni d'énormes progrès dans la compréhension de cette pathologie. Il a été utilisé dans de nombreuses études portant sur ​​le rôle du facteur de von Willebrand à la formation de thrombose ^18,19. Combiné avec les adaptations génétiquestechniques de fication, il a permis l'identification de plusieurs gènes spécifiques impliqués dans les troubles thrombotiques. Lamrani et al. par exemple ont montré qu'un knock-in du gène JAK2 ^V617F est associée à une formation accélérée de caillot instable ^20. Zhang et al. Ont étudié l'implication physiologique du récepteur P2Y12 plaquettaire et démontré que des souris transgéniques surexprimant spécifiquement ce récepteur dans les plaquettes seulement, ont montré une formation de thrombus plus rapide et plus stable dans l'artère mésentérique blessé avec FeCl ₃ ^21. Le rôle crucial de l'activateur de type tissulaire du plasminogène (tPA) et l'activateur du plasminogène de type urokinase (uPA) dans le processus de dégradation de la fibrine a également été étudié dans ce procédé ^22. En outre, ce modèle fournit également un moyen simple et précis de tester les capacités fibrinolytiques de nombreux nouveaux médicaments in vivo. Par exemple, Wang et al. Ont utilisé ce modèle pour ee validation préclinique d'un nouvel activateur du plasminogène recombinant dirigé contre les plaquettes activées ^23. Cette méthode a également permis la validation de protéines thérapeutiques isolés de la salive des tiques, chauves-souris vampires, et les moustiques ou à partir du venin des serpents avec identification spécifique de la cible ^24-27. Ces exemples montrent la souplesse du modèle de chlorure ferrique. Dans cet article, nous nous concentrons sur deux méthodes et étudions chlorure ferrique thrombose induite sur deux différents type de navire; vaisseau mésentérique et l'artère carotide.

Protocol

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité de l'éducation Cité animale éthique (E / 1534/2015 / B) de la recherche médicale et Alfred. Toutes les manipulations chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie générale et les animaux ne ressentent de la douleur à tout moment. Toutes les expériences décrites sont non-recouvrement. 1. Préparation Couper des bandes minces de papier filtre (1 mm x 2 mm). Fraîchement p…

Representative Results

La fluorescence intravitale observation au microscope du mésentère révélera l'accumulation de Rhodamine 6G plaquettes et les leucocytes marqués le long de la paroi du vaisseau lésé par FeCl 3. La formation progressive d'un thrombus partielle est surveillée dans un récipient de mésentère 200 um (figure 1). Un thrombus apparaît lentement et clairement identifiée après la première minute d'exposition à FeCl 3 (figure 1, t = 60 s). 40 second…

Discussion

Le chlorure induite modèle de thrombose ferrique est un excellent outil de recherche. Comme le montre cette étude, il est extrêmement facile à mettre en œuvre et lorsqu'il est utilisé en combinaison avec la microscopie intravitale ou Doppler débitmètre, il fournit une bonne surveillance en temps réel de la formation de thrombus. Réglage de la durée d'exposition et la concentration de FeCl _3, il offre également la possibilité de produire soit thrombus occlusif ou non occlusif.

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Materials

Whatman chromatography paper	GE Healthcare	3030917
Iron (III) chloride 40 % (w/v)	VWR	24212.298
Rhodamine 6G	Sigma	R4127
Inverted microscope	Olympus	IX81
Digital black-and-white camera	Olympus	XM10
Doppler flowmeter	Transonic	TS420
Nano-doppler flow probe	Transonic	0.5 PBS
Ketamine	Hospira	0409-2051-05
Xylazine (Rampun)	Bayer	75313
Petri dish	Sarstedt	82.1472
Insulin syringe (29 G)	BD Ultra-Fine	326103
Cotton tipped applicators	BSN medical	211827A
Dynek dysilk sutures	Dynek Pty Ltd	CS30100
Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS)	Gibco life technologies	21600-069
Heating pad	Kirchner	T60