Introduction
L'étude des mécanismes impliqués dans le développement de la thrombose et de l'évaluation de l'efficacité des médicaments anti-thrombotiques nécessite bien établi des modèles animaux expérimentaux. Modèles animales importantes ont été les premiers à être utilisés car ils fournissent de grands navires plus semblable à l'homme que les rongeurs 1. Cependant, le coût élevé, les grandes installations nécessaires et la difficulté à les manipuler génétiquement sont des inconvénients majeurs à leur utilisation et de grands animaux sont maintenant limités à des études précliniques fin une fois les tests préliminaires sur des rongeurs ont donné des résultats concluants 2. Avec une large disponibilité de souches transgéniques et knock-out et leur petite taille qui minimise la quantité de médicaments antithrombotiques requises pour les essais in vivo, les souris sont principalement utilisés pour la recherche sur la thrombose. Par conséquent, plusieurs modèles de troubles thrombotiques ont été développées chez des souris 3.
Beaucoup de modèles de thrombose établies perturbent les intimune couche de la paroi du vaisseau, suivie par l'exposition de la matrice extracellulaire sous endotheliales à l'écoulement de sang induire la formation de caillots sanguins 4. Le thrombus peut résulter de l'exposition du collagène qui déclenche l'activation des plaquettes et / ou de l'exposition du facteur tissulaire qui active la cascade de coagulation 5. Plusieurs techniques sont ensuite utilisées pour atteindre la blessure de cuve initial. Pierangeli et al. A développé un modèle de rupture mécanique avec un outil de microchirurgie sur la veine fémorale 6. Kikushi et al. Décrit un modèle qui consiste en l'administration d'un composé réactif de photo (rose Bengale) qui accumule dans la bicouche lipidique des cellules endothéliales, suivie par l'excitation déterminée de la paroi du vaisseau d'intérêt avec une lumière verte (540 nm) 7. La blessure peut également être induite par un court-éclairage à haute intensité de laser d'impulsion 8. Une autre technique d'abord mis en place sur l'artère carotide de ratsconsiste en l'application topique de chlorure ferrique (FeCl 3) 9. Dans ce cas, les résultats récipient de dénudation de radicaux libres générés par FeCl3 qui provoque la peroxydation lipidique et la destruction des 10 cellules endotheliales. La blessure induit l'expression de plusieurs molécules d'adhésion de déclenchement adhérence et l'agrégation plaquettaire ainsi que le recrutement des leucocytes. Il a été démontré que les leucocytes, en particulier les neutrophiles jouent un rôle crucial dans l'activation de la cascade de coagulation du sang conduisant à la thrombose 11. Cette méthode est bien adaptée à reproduire la cascade de coagulation; les enquêteurs doivent garder à l'esprit que, dans ce modèle de souris, la thrombose est généralement induite dans vaisseaux sains alors que la thrombose chez les humains se produit principalement en ex malade. vaisseaux athérosclérotiques.
Comme ce modèle est très simple à mettre en oeuvre et est également efficace chez les souris, il est maintenant le mode de thrombose principalement utilisél pour petit animal in vivo. En outre, cette technique offre la possibilité d'induire la formation de thrombus dans une variété de vaisseaux. vaisseaux cibles peuvent être des artères ou des veines de grand diamètre (carotide, fémorale, la veine cave) ou de petit diamètre (mésentère, cremaster) 12-14. Plus récemment, il a également été utilisé sur l'artère cérébrale moyenne proximale de développer un modèle d'AVC 15. La formation de thrombose peut être directement observé par microscopie intravitale après marquage fluorescent de plaquettes et de leucocytes ou surveillé en mesurant la diminution du flux sanguin avec une sonde de température ou un 12,16,17 de la sonde Doppler. Plusieurs paramètres tels que le temps d'occlusion, temps de formation de thrombus ou de la taille d'un thrombus peuvent ensuite être étudiés. Les différences physiologiques entre les navires d'une enquête suite à des variations importantes dans le thrombus obtenu. Par conséquent, les chercheurs sélectionner habituellement le vaisseau cible en fonction des paramètres qui les intéressent la pour mesurerre et / ou le réglage ils veulent enquêter sur la maladie. Typiquement, le modèle sur l'artère carotide est plus pertinente pour la recherche sur l'athérothrombose liée à l'infarctus du myocarde ou accident vasculaire cérébral alors que les études sur la veine cave sont plus pertinentes pour la recherche sur la thrombose veineuse profonde. L'accessibilité des différents vaisseaux détermine également la méthode utilisée pour mesurer la croissance de thrombus. Par exemple, les vaisseaux mésentériques sont faciles d'accès qui rend ce modèle bien adapté pour l'observation microscopique intravitale et l'étude de la dynamique de la formation de thrombus. L'artère carotide est moins accessible mais plus grand débit permettant des mesures de sang et de fournir un excellent modèle pour étudier la thrombose occlusive.
Le modèle de thrombose induite de chlorure ferrique a fourni d'énormes progrès dans la compréhension de cette pathologie. Il a été utilisé dans de nombreuses études portant sur le rôle du facteur de von Willebrand à la formation de thrombose 18,19. Combiné avec les adaptations génétiquestechniques de fication, il a permis l'identification de plusieurs gènes spécifiques impliqués dans les troubles thrombotiques. Lamrani et al. par exemple ont montré qu'un knock-in du gène JAK2 V617F est associée à une formation accélérée de caillot instable 20. Zhang et al. Ont étudié l'implication physiologique du récepteur P2Y12 plaquettaire et démontré que des souris transgéniques surexprimant spécifiquement ce récepteur dans les plaquettes seulement, ont montré une formation de thrombus plus rapide et plus stable dans l'artère mésentérique blessé avec FeCl 3 21. Le rôle crucial de l'activateur de type tissulaire du plasminogène (tPA) et l'activateur du plasminogène de type urokinase (uPA) dans le processus de dégradation de la fibrine a également été étudié dans ce procédé 22. En outre, ce modèle fournit également un moyen simple et précis de tester les capacités fibrinolytiques de nombreux nouveaux médicaments in vivo. Par exemple, Wang et al. Ont utilisé ce modèle pour ee validation préclinique d'un nouvel activateur du plasminogène recombinant dirigé contre les plaquettes activées 23. Cette méthode a également permis la validation de protéines thérapeutiques isolés de la salive des tiques, chauves-souris vampires, et les moustiques ou à partir du venin des serpents avec identification spécifique de la cible 24-27. Ces exemples montrent la souplesse du modèle de chlorure ferrique. Dans cet article, nous nous concentrons sur deux méthodes et étudions chlorure ferrique thrombose induite sur deux différents type de navire; vaisseau mésentérique et l'artère carotide.
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Protocol
Toutes les expériences impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité de l'éducation Cité animale éthique (E / 1534/2015 / B) de la recherche médicale et Alfred. Toutes les manipulations chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie générale et les animaux ne ressentent de la douleur à tout moment. Toutes les expériences décrites sont non-recouvrement.
1. Préparation
- Couper des bandes minces de papier filtre (1 mm x 2 mm).
- Fraîchement préparer deux solutions de chlorure ferrique de 4% (p / v) et 6% (p / v) dilué dans de l'eau désionisée. Préparer la solution de rhodamine 6G 0,3% en PBS, filtré à travers de 0,22 um.
- Coupez un petit morceau (5 mm x 1 cm) à partir du plastique blanc de la seringue wrapper.
2. Formation Mesentery Artériole thrombus Observé par Microscopie intravitale
- Peser un 10-12 semaines C57BL / 6 souris de type sauvage et anesthésier en conséquence avec un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) si une injection intrapéritonéale. Surveiller la profondeur de l'anesthésie par la réponse aux pieds, la queue et / ou pincement de la peau, la réactivité de pincement de la cornée et palpébrale, et l'absence de mouvement des moustaches. Si nécessaire, injecter une seconde dose de kétamine (50 mg / kg) pour maintenir l'anesthésie de l'animal. Appliquer vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. Placez la souris dans une petite boîte de Pétri placée sur un coussin chauffant réglé à 37 ° C.
NOTE: Bien que l'injection IP peut entraîner des douleurs pour les animaux, la durée de ce malaise sera minime (moins de 3 secondes). La douleur et l'inconfort associés aux injections seront minimisés grâce à l'utilisation de personnel expérimenté et compétent et la taille de l'aiguille appropriée (25 G). Après toutes les procédures, tous les euthanasier les animaux en utilisant une surdose de kétamine et de xylazine suivie par dislocation cervicale. - Effectuer une incision médiane abdominale d'environ 3 cm dans la peau et découpez soigneusement le péritoine.
- Placez la souris sur le côté de l'animalplat ri, extérioriser doucement ses intestins et écartez avec précaution le mésentère avec 2 bourgeons de coton pour apporter un récipient approprié à la surface de la boîte de Pétri. Séchez correctement avec un essuie-glace délicate.
Remarque: Afin de limiter le mouvement des vaisseaux mésentériques, la papaverine peut être utilisé pour inhiber le péristaltisme intestinal. - Faire tremper la queue de la souris dans l'eau chaude pour dilater les vaisseaux et injecter 30 pi de la rhodamine 6G (0,3%) dans la veine de la queue de la souris avec une seringue de 29 G pour marquer les leucocytes et les plaquettes.
- Placez la boîte de Pétri sous un microscope inversé et se concentrer sur l'artériole choisie en utilisant le canal de champ lumineux.
- Faire tremper une bande de papier filtre avec 6% (p / v) de fer (III) de chlorure et d'appliquer le papier filtre sur l'artériole avec deux pinces; le premier à tenir le papier filtre, le second d'appuyer doucement sur la zone d'intérêt. Observer la formation de thrombus dans la 10 première secondes après le dépôt du papier filtre.
NOTE: Il est tout à fait commà blesser la microvascularisation entourée et la précision de la déposition du papier filtre et la pression en douceur est donc important de limiter ce problème. - Observer la formation de thrombus par microscopie à fluorescence (canal TRITC: excitation pic 557 nm, le pic d'émission 576 nm), à travers le papier filtre. Respecter les leucocytes et les plaquettes circulantes qui ont pris la rhodamine 6G et leur agrégation dans le thrombus est donc facile à identifier.
- Prenez le papier filtre au bout de 1 min d'exposition au fer (III) et le chlorure de continuer à suivre la formation du thrombus. Lavez le récipient avec du PBS.
- Observer et enregistrer la formation dynamique du thrombus mis en évidence avec l'étiquetage des plaquettes et leucocytes avec la rhodamine 6G. Capturer les images et mesurer la taille du thrombus. Les images présentées ici ont été obtenues avec un microscope intravitale inversé, si un objectif 4X, dans le canal de fluorescence TRITC.
- FA près toutes les procédures, l'euthanasie de l'animal en utilisant une surdose de kétamine et de xylazine, suivie par dislocation cervicale.
3. l'artère carotide formation de thrombus évaluée par Circulation sanguine Mesure de vitesse
- Peser un homme âgé de 10 à 12 semaines C57BL / 6 et souris anesthésier en conséquence avec un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg), même si l'injection intrapéritonéale. Appliquer vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie.
- Fixer la souris sous un microscope opératoire en utilisant du ruban adhésif sur les jambes, sur un coussin chauffant réglé à 37 ° C.
- Faire un petit oreiller sur un essuie-glace et du ruban adhésif sous la tête de la souris pour élever la tête légèrement. Utilisez une boucle de fil avec des pinces pour tirer le museau (utilisez dents supérieures). Cela permettra d'exposer la région de l'artère carotide pour un accès facile.
- Effectuer un petit 5 mm incision profonde de la peau directement en dessous de la mâchoire, jusqu'au sternum.
- Disséquer la fascia et isoler un fragment soit de l'artère carotide commune gauche ou à droite au dessus de la bifurcation.
- Introduire délicatement pincettes en-entre l'artère et le nerf de les séparer. Ne pas déranger le nerf courir près de l'artère et éviter de toucher trop de l'artère carotide en soit cause des dommages au navire. Isoler une section d'un moins 5 mm de l'artère.
- Sécher la zone de l'artère correctement avec essuie-glaces afin d'éviter que tout liquide interfère avec le FeCl 3.
- Mettez le petit morceau de plastique blanc dans la partie isolée de la carotide commune de sorte que le FeCl3 ne pas tremper dans les tissus environnants. A cet effet, utiliser une deuxième pince pour amener la pièce à la première puis, lentement, faites glisser le papier plastique sous l'artère.
- Faire tremper une feuille de papier-filtre avec 4% (p / v) ou 6% (p / v) de chlorure ferrique et le placer autour de l'artère.
- Après 3 min d'exposition, enlever le papier filtre, rincer avec du PBS et sécher la zone wessuie vec.
- Placer la sonde de débit Doppler autour de la cuve à la zone blessée et commencer à enregistrer les changements dans le flux. Dans la carotide commune de souris adultes en bonne santé, l'écoulement est généralement autour de 1 ml / min. Attention! le contact de la sonde avec du chlorure ferrique endommager la sonde de façon tout contact doit être évitée. Les données présentées ici ont été obtenues avec un appareil de mesure de débit Transonic System Inc., TS420 Module périvasculaire équipé d'une sonde de débit Doppler Nano 0,5 PBS.
REMARQUE: La concentration du chlorure ferrique peut modifier la cinétique de formation d'un thrombus résultant en différents temps d'occlusion. Ainsi, une exposition à 6% (p / v) de chlorure ferrique donne une occlusion rapide que l'exposition à 4% (p / v) de chlorure ferrique. - Après toutes les procédures, euthanasier tous les animaux en utilisant une surdose de kétamine et de xylazine suivie par dislocation cervicale et nettoyez soigneusement la sonde Doppler.
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Representative Results
La fluorescence intravitale observation au microscope du mésentère révélera l'accumulation de Rhodamine 6G plaquettes et les leucocytes marqués le long de la paroi du vaisseau lésé par FeCl 3. La formation progressive d'un thrombus partielle est surveillée dans un récipient de mésentère 200 um (figure 1). Un thrombus apparaît lentement et clairement identifiée après la première minute d'exposition à FeCl 3 (figure 1, t = 60 s). 40 secondes après le retrait du papier filtre imbibé de FeCl3, la thrombose progresse rapidement et est finalement présent sur la paroi de la section de récipient entier observé (figure 1, t = 100 secondes).
Figure 1:. Thrombus croissance observée par Fluorescent Microscopie intravitale sur un navire de Mesentery images ont été prises à 15 sec, 60s et 100 s après le dépôt du papier filtre imbibé de 6% (p / v) de solution de FeCl 3. Le papier filtre a été retiré après 60 secondes d'exposition. Les leucocytes et les plaquettes ont été marquées par pré-injection de Rhodamine 6G (0,5% p / v). Les flèches rouges indiquent plaquettes / leucocytes agrégats. Barre d'échelle de 200 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Un thrombus intra-carotidienne est induite par l'application d'un papier filtre imbibé de FeCl3 solution autour d'une artère carotide isolé et les changements dans le flux sanguin en aval de la lésion est enregistrée avec une sonde de débit Doppler (figure 2). Un flux sanguin global constant autour de 1,1 ml / min est mesurée dans l'artère carotide non lésés. Après une exposition de 3 min de la cuve avec un papier filtre imbibé de 4% (p / v) de solution de FeCl 3, un thrombus occlusif est obtained avec un temps d'occlusion de 13 min et 30 s après le début de l'exposition. Après une exposition de 3 min avec un papier filtre imbibé de 6% (p / v) de FeCl 3, un thrombus occlusif est obtenue avec un temps d'occlusion de 9 minutes et 30 secondes après le début de l'exposition.
Figure 2. représentatif enregistrements de flux sanguin dans l'artère carotide après FeCl 3 blessures écoulement de sang. On a mesuré avec une sonde de débit Doppler placé sur l'artère carotide juste en aval du papier filtre imbibé de 4% (p / v) ou 6% ( p / v) de FeCl 3. Le papier filtre a été retiré après 3 min d'exposition. En tant que flux sanguin témoin a été obtenu en mesurant l'artère carotide sain.
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Discussion
Le chlorure induite modèle de thrombose ferrique est un excellent outil de recherche. Comme le montre cette étude, il est extrêmement facile à mettre en œuvre et lorsqu'il est utilisé en combinaison avec la microscopie intravitale ou Doppler débitmètre, il fournit une bonne surveillance en temps réel de la formation de thrombus. Réglage de la durée d'exposition et la concentration de FeCl 3, il offre également la possibilité de produire soit thrombus occlusif ou non occlusif.
Cependant, ce procédé présente également des limites. Dans l'artère carotide, l'inconvénient majeur est que même si le temps d'occlusion peut être modifiée de manière efficace, la reproductibilité du modèle reste trop faible pour contrôler précisément la taille des thrombus et le taux 10 de croissance. Plusieurs groupes ont travaillé sur une normalisation du modèle 28,29. Owens et al. a suggéré que le temps d'occlusion fiable et reproductible peut être obtenue avec la pratique et par la réduction de tous les facteurs de variation tels que l'âge deles souris, l'arrière-plan génétique de la souris, l'anesthésie utilisée, la technique de chlorure ferrique exposition et la concentration de la solution de chlorure ferrique 28. La sonde Doppler elle-même a également certaines limites avec un certain degré de bruit de fond présent qui peut affecter la détermination de l'occlusion. Le débit sanguin peut également être modifié par la formation de thrombus instable.
Sur le navire mésentérique, la reproductibilité peut être affectée par la taille de la cuve qui varie plus que les artères carotides et de la présence de matières grasses qui peuvent diminuer l'étendue de la blessure. Il a été rapporté que le thrombus obtenue diffère en fonction de la taille de la lésion paroi récipient qui peut contenir à l'endothélium ou l'excrétion également affecter les cellules du muscle lisse de la couche de support 30. Le modèle d'irradiation par laser constitue une bonne alternative du modèle de chlorure ferrique qui fournit une meilleure reproductibilité 8. Toutefois, il est limité à de petits vaisseaux qui sont suffisamment transparent pour permettre la pénétration du laser. Il convient également de remarquer que dans ce modèle, les cellules endothéliales sont détruites après l'application de chlorure ferrique et il ne convient donc pas pour les études sur le rôle des cellules endothéliales. Cependant, il est possible de remplacer le chlorure ferrique par ionophore de calcium pour obtenir une blessure plus faible, limité à l'activation de l'endothélium 31.
Une autre limitation de ce modèle est qu'il ne convient pas pour étudier l'évolution à long terme de la maladie. Pour satisfaire à cette exigence, Boulaftali et al. Ont développé chambres dorsale des plis cutanés qui permettent le suivi de la même thrombus sur plusieurs semaines 32. Cette technique est particulièrement bien adaptée à examiner les effets de médicaments thrombolytiques fonction de la maturité de thrombus. Dans cette étude, le vieillissement caillot a été trouvé à porter atteinte à l'action lytique d'une forme recombinante de tissue activateur du plasminogène, qui est actuellement la norme de médicaments thrombolytiques à usage humain de l'or.
Malgré quelques inconvénients qui doivent être pris en considération, le modèle FeCl 3 est pertinent pour l'étude de la thrombose humaine. La composition du thrombus obtenu a été analysé sur coupe histologique et la présence de fibrine et de plaquettes, les globules rouges ont été identifiés dans le thrombus intra-carotidienne 33. En outre, étant donné que le trouble athérothrombotique est supposé être initiée par l'oxydation des lipoprotéines, l'induction de la lésion du vaisseau si une réaction d'oxydo-réduction du modèle FeCl 3 est plus susceptible d'imiter la physiopathologie de la maladie humaine de laser a, photo-chimique ou mécanique 34 lésion induite.
Le thrombus formé que le chlorure ferrique a également été décrite pour être sensible à la fois des médicaments anticoagulants et antiplaquettaires. Héparine et le clopidogrel, par exemple, ont été repsignalés auparavant de prolonger le temps d'occlusion de thrombus formé dans l'artère carotide 29. L'administration d'une forme recombinante de Hirudin a significativement prolongé la durée de la formation de thrombus sur la microvascularisation de mésentère 17. Par conséquent, le modèle de chlorure ferrique fournit un excellent aperçu de la thrombose et est un outil très utile pour la validation préclinique de nouveaux thrombolytique, un anticoagulant et anti-plaquettes.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le soutien technique de Joy Yao et le Dr Karen Alt, ainsi que le financement du NHMRC et NHF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman chromatography paper | GE Healthcare | 3030917 | |
| Iron (III) chloride 40% (w/v) | VWR | 24212.298 | |
| Rhodamine 6G | Sigma | R4127 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| Digital black-and-white camera | Olympus | XM10 | |
| Doppler flowmeter | Transonic | TS420 | |
| Nano-doppler flow probe | Transonic | 0.5 PBS | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine (Rampun) | Bayer | 75313 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472 | |
| Insulin syringe (29 G) | BD Ultra-Fine | 326103 | |
| Cotton tipped applicators | BSN medical | 211827A | |
| Dynek dysilk sutures | Dynek Pty Ltd | CS30100 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS) | Gibco life technologies | 21600-069 | |
| Heating pad | Kirchner | T60 |
References
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