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Medicine

Ferric क्लोराइड प्रेरित कैरोटिड धमनी और अन्त्रपेशी पोत पर घनास्त्रता माउस मॉडल

doi: 10.3791/52838 Published: June 29, 2015

Introduction

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घनास्त्रता के विकास और विरोधी थ्रोम्बोटिक दवाओं के प्रभाव के मूल्यांकन में शामिल तंत्र के अध्ययन में अच्छी तरह से प्रयोगात्मक पशु मॉडल की स्थापना की आवश्यकता है। वे कृन्तकों 1 से मनुष्य के लिए बड़े जहाजों और अधिक समान उपलब्ध कराने के रूप में बड़े पशु मॉडल में इस्तेमाल किया जा करने के लिए पहले किए गए। बहरहाल, उच्च लागत, आवश्यक बड़ा सुविधाओं और उन्हें जोड़ तोड़ करने में कठिनाई आनुवंशिक रूप से उनके उपयोग के लिए प्रमुख कमियां हैं और कृन्तकों पर प्रारंभिक परीक्षणों निर्णायक परिणाम 2 दे दिया है एक बार बड़े जानवरों अब देर से पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन करने के लिए सीमित कर रहे हैं। इन विवो परीक्षण के लिए आवश्यक antithrombotic दवाओं की मात्रा को कम करता है कि ट्रांसजेनिक और पीटा उपभेदों और उनके छोटे आकार की व्यापक उपलब्धता के साथ, चूहे मुख्य रूप से घनास्त्रता अनुसंधान के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इसलिए, थ्रोम्बोटिक विकारों के कई मॉडल चूहों 3 में विकसित किया गया है।

कई स्थापित घनास्त्रता मॉडल intim बाधितरक्त के थक्के 4 के गठन के उत्प्रेरण रक्त के प्रवाह को उप एन्दोथेलिअल बाह्य मैट्रिक्स के लोगों तक पहुंचाने के द्वारा पीछा पोत दीवार की एक परत,। थ्रोम्बी / और जमावट झरना 5 को सक्रिय करता है जो ऊतक कारक के जोखिम से या प्लेटलेट्स सक्रियण चलाता है जो कोलाजेन के जोखिम से परिणाम हो सकता है। कई तकनीकों तो प्रारंभिक पोत चोट हासिल करने के लिए कार्यरत हैं। Pierangeli एट अल। ऊरु नस 6 पर एक microsurgery के उपकरण के साथ एक यांत्रिक व्यवधान मॉडल विकसित किया है। Kikushi एट अल। हरी बत्ती (540 एनएम) 7 के साथ ब्याज की पोत दीवार के विशिष्ट उत्तेजना के द्वारा पीछा endothelial कोशिकाओं के लिपिड bilayer में जम जाता है, जो एक तस्वीर प्रतिक्रियाशील यौगिक (गुलाब बंगाल) के प्रशासन में होते हैं, जो एक मॉडल का वर्णन किया। चोट भी एक छोटी उच्च तीव्रता नाड़ी लेजर रोशनी 8 द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। एक और तकनीक सबसे पहले चूहों के मन्या धमनी पर स्थापितफेरिक क्लोराइड की सामयिक आवेदन (FeCl 3) 9 में होते हैं। इस मामले में, FeCl 3 द्वारा उत्पन्न मुक्त कण से पोत अनाच्छादन परिणामों जो endothelial कोशिकाओं 10 में लिपिड peroxidation और विनाश का कारण बनता है। चोट ल्यूकोसाइट्स भर्ती के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्लेटलेट आसंजन और एकत्रीकरण को ट्रिगर कई आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है। यह ल्यूकोसाइट्स, विशेष रूप से न्यूट्रोफिल, थ्रोम्बोसिस 11 के लिए अग्रणी रक्त जमावट झरना की सक्रियता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि प्रदर्शन किया गया है। इस विधि को अच्छी तरह से जमावट झरना पुन: पेश करने के लिए अनुकूल है; जांचकर्ताओं मानव में थ्रोम्बोसिस मुख्य रूप से रोगग्रस्त जैसे में होने वाली है, जबकि इस माउस मॉडल में, थ्रोम्बोसिस आम तौर पर स्वस्थ वाहिकाओं में प्रेरित किया है कि, ध्यान में रखना चाहिए। अथेरोस्लेरोटिक वाहिकाओं।

इस मॉडल को लागू करने के लिए बहुत आसान है और यह भी चूहों में प्रभावी है, यह अब ज्यादातर इस्तेमाल थ्रोम्बोसिस विधा हैvivo अध्ययन में छोटे पशु के लिए एल। इसके अलावा, इस तकनीक के जहाजों की एक किस्म में थ्रोम्बी के गठन को प्रेरित करने के लिए संभावना प्रदान करता है। लक्ष्य वाहिकाओं धमनियों या बड़े व्यास (मन्या, ऊरु, वेना कावा) या छोटे व्यास (अन्त्रपेशी, cremaster) 12-14 की नसों हो सकता है। हाल ही में, यह भी स्ट्रोक 15 का एक मॉडल विकसित करने के लिए समीपस्थ मध्य मस्तिष्क धमनी पर इस्तेमाल किया गया था। थ्रोम्बोसिस गठन सीधे प्लेटलेट और leukocytes के फ्लोरोसेंट लेबलिंग के बाद intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया या एक तापमान जांच या एक डॉपलर जांच 12,16,17 के साथ रक्त प्रवाह में कमी को मापने के द्वारा नजर रखी जा सकती है। ऐसे रोड़ा समय, thrombus गठन के समय या थक्का आकार के रूप में कई मापदंडों तो जांच की जा सकती है। जहाजों के बीच शारीरिक मतभेद प्राप्त थ्रोम्बी में महत्वपूर्ण बदलाव में परिणाम की जांच की। इसलिए, जांचकर्ताओं आमतौर पर वे measu करना चाहते मापदंडों के अनुसार लक्ष्य पोत का चयनफिर से और / या वे जांच करना चाहते हैं स्थापित करने की बीमारी। आमतौर पर, मन्या धमनी पर मॉडल वेना कावा पर अध्ययन गहरी शिरापरक घनास्त्रता पर अनुसंधान के लिए और अधिक प्रासंगिक हैं जबकि रोधगलन या स्ट्रोक से संबंधित atherothrombosis पर अनुसंधान के लिए और अधिक प्रासंगिक है। विभिन्न जहाजों की पहुंच भी थक्का विकास को मापने के लिए इस्तेमाल किया विधि निर्धारित करता है। उदाहरण के लिए, mesenteric जहाजों intravital सूक्ष्म अवलोकन और thrombus गठन की गतिशीलता के अध्ययन के लिए इस मॉडल को अच्छी तरह से अनुकूल बनाने का उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं। कैरोटिड धमनी कम सुलभ लेकिन सक्रिय करने के लिए रक्त के प्रवाह माप बड़ा है और पूर्णावरोधक थ्रोम्बोसिस अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करते हैं।

फेरिक क्लोराइड प्रेरित घनास्त्रता मॉडल इस विकृति की समझ में जबरदस्त प्रगति प्रदान की गई है। यह थ्रोम्बोसिस गठन 18,19 में वॉन Willebrand कारक की भूमिका पर ध्यान केंद्रित कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है। आनुवंशिक मोदी के साथ संयुक्तfication तकनीक, यह थ्रोम्बोटिक विकारों में शामिल कई विशिष्ट जीन की पहचान की अनुमति दी गई है। Lamrani एट अल। उदाहरण के लिए JAK2 V617F जीन की एक दस्तक में अस्थिर थक्का 20 की एक त्वरक गठन के साथ जुड़ा हुआ है कि पता चला है। झांग एट अल। P2Y12 प्लेटलेट रिसेप्टर के शारीरिक निहितार्थ जांच की और प्लेटलेट्स में विशेष रूप से इस रिसेप्टर overexpressing ट्रांसजेनिक चूहों केवल FeCl 3 21 से घायल mesenteric धमनी में एक और अधिक तेजी से और स्थिर thrombus गठन प्रदर्शित कि प्रदर्शन किया है। ऊतक प्रकार plasminogen उत्प्रेरक (टीपीए) और आतंच गिरावट प्रक्रिया में Urokinase प्रकार plasminogen उत्प्रेरक (संप्रग) की महत्वपूर्ण भूमिका को भी इस विधि से 22 में जांच की गई है। इसके अलावा यह मॉडल भी vivo में कई उपन्यास दवाओं के fibrinolytic क्षमता का परीक्षण करने का एक सरल और सटीक तरीका प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, वैंग एट अल। वीं के लिए इस मॉडल का इस्तेमाल किया हैसक्रिय प्लेटलेट्स 23 के खिलाफ लक्षित एक उपन्यास पुनः संयोजक plasminogen उत्प्रेरक का ई क्लिनिक पूर्व सत्यापन। इस विधि को भी लगे निशान, पिशाच चमगादड़, और mosquitos की लार से या लक्ष्य 24-27 की विशिष्ट पहचान के साथ सांप के जहर से अलग चिकित्सीय प्रोटीन का सत्यापन सक्षम होना चाहिए। ये उदाहरण फेरिक क्लोराइड मॉडल की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन। इस अनुच्छेद में, हम दो तरीकों पर ध्यान केंद्रित करने और दो अलग अलग पोत प्रकार पर फेरिक क्लोराइड प्रेरित थ्रोम्बोसिस अध्ययन; mesenteric पोत और मन्या धमनी।

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Protocol

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जानवरों को शामिल सभी प्रयोगों अल्फ्रेड मेडिकल रिसर्च एंड एजुकेशन एरिया पशु आचार समिति (ई / 1534/2015 / बी) द्वारा अनुमोदित किया गया। सभी शल्य जोड़तोड़ पूर्ण संज्ञाहरण के तहत किया गया और जानवरों के किसी भी चरण में दर्द का अनुभव नहीं था। वर्णित सभी प्रयोगों गैर वसूली कर रहे हैं।

1. तैयारी

  1. फिल्टर पेपर (1 मिमी x 2 मिमी) की पतली बैंड काटें।
  2. हाल में 4% की फेरिक क्लोराइड के 2 समाधान तैयार (डब्ल्यू / वी) और 6% (w / v) विआयनीकृत पानी में पतला। 0.22 के माध्यम से छाना, पीबीएस में rhodamine 6G समाधान 0.3% की तैयारी।
  3. सिरिंज आवरण का सफेद प्लास्टिक से एक छोटा सा टुकड़ा (5 मिमी x 1 सेमी) काटें।

Intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया 2. अन्त्रपेशी धमनिका thrombus गठन

  1. एक 10-12 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL / 6 जंगली प्रकार माउस वजन और intraperitoneal इंजेक्शन हालांकि एक ketamine का मिश्रण (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ तदनुसार anesthetize। पैर की अंगुली, पूंछ और / या त्वचा चुटकी, कार्निया और नेत्रच्छद चुटकी से जेट, और मूंछ आंदोलन के अभाव के जवाब से संज्ञाहरण की गहराई मॉनिटर। यदि आवश्यक हो, पशु की संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए ketamine की दूसरी खुराक (50 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्षन। संज्ञाहरण के तहत, जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करें। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए समायोजित एक हीटिंग पैड पर रखा एक छोटा सा पेट्री डिश में माउस रखें।
    नोट: आईपी इंजेक्शन पशुओं के लिए दर्द में परिणाम हो सकता है, इस परेशानी की अवधि कम से कम (कम से कम 3 सेकंड) हो जाएगा। इंजेक्शन के साथ जुड़े दर्द और बेचैनी अनुभवी और सक्षम कर्मियों और उपयुक्त सुई आकार (25 जी) के उपयोग के माध्यम से कम से कम हो जाएगा। सभी प्रक्रियाओं के बाद, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद ketamine और xylazine की अधिक मात्रा का उपयोग करते हुए सभी जानवरों euthanize।
  2. त्वचा में लगभग 3 सेमी की एक उदर midline चीरा प्रदर्शन और ध्यान से पेरिटोनियम काटा।
  3. पालतू जानवरों की तरफ माउस की स्थितिआरआई पकवान, धीरे से अपनी आंतों अमल और ध्यान से पेट्री डिश की सतह के लिए एक उपयुक्त पोत लाने के लिए 2 कपास की कलियों के साथ अन्त्रपेशी फैल गया। एक नाजुक वाइपर के साथ ठीक से सूखी।
    नोट: mesenteric जहाजों की आवाजाही को सीमित करने के लिए, Papaverine पेट peristalsis को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. वाहिकाओं को फैलाने और leukocytes और प्लेटलेट्स लेबल करने के लिए एक 29 जी सिरिंज के साथ माउस की पूंछ नस में Rhodamine 6G (0.3%) के 30 μl इंजेक्षन करने के लिए गर्म पानी में माउस की पूंछ लेना।
  5. एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत पेट्री डिश प्लेस और उज्ज्वल क्षेत्र चैनल का उपयोग चुना धमनिका पर ध्यान केंद्रित।
  6. 6% (डब्ल्यू / वी) लोहा (तृतीय) क्लोराइड के साथ फिल्टर पेपर के एक बैंड लेना और दो संदंश के साथ धमनिका पर फिल्टर पेपर लागू होते हैं; पहले एक फिल्टर पेपर, धीरे हित के क्षेत्र पर प्रेस करने के लिए एक दूसरे के धारण करने के लिए। फिल्टर पेपर के बयान के बाद पहले 10 सेकंड में thrombus गठन का निरीक्षण करें।
    नोट: यह काफी कॉम हैघिरा microvasculature और फिल्टर पेपर के बयान और धीरे दबाव की शुद्धता को घायल करने पर इस समस्या को सीमित करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है।
  7. फिल्टर पेपर के माध्यम से,: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा thrombus गठन (पीक उत्तेजना 557 एनएम, शिखर उत्सर्जन 576 एनएम TRITC चैनल) को ध्यान से देखें। थक्का में Rhodamine 6G और उनके एकत्रीकरण ले लिया है कि परिसंचारी leukocytes और प्लेटलेट्स का निरीक्षण इसलिए की पहचान करने के लिए आसान है।
  8. लोहा (तृतीय) क्लोराइड के लिए जोखिम के 1 मिनट के बाद फिल्टर पेपर से दूर रखना और थक्का के गठन पर नजर रखने के लिए जारी है। पीबीएस के साथ पोत धो लें।
  9. ध्यान से देखें और rhodamine 6G साथ प्लेटलेट्स और ल्यूकोसाइट्स की लेबलिंग के साथ प्रकाश डाला थक्का के गतिशील गठन रिकॉर्ड है। छवियों को पकड़ने और थक्का के आकार को मापने। इस के साथ साथ प्रस्तुत छवियों TRITC प्रतिदीप्ति चैनल में एक उद्देश्य 4X हालांकि, एक औंधा intravital खुर्दबीन के साथ प्राप्त किया गया।
  10. एफसभी प्रक्रियाओं ollowing, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद ketamine और xylazine की अधिक मात्रा का उपयोग कर पशु euthanize।

3. मन्या धमनी thrombus गठन रक्त प्रवाह वेग मापन द्वारा मूल्यांकन

  1. एक 10-12 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL / 6 माउस वजन और intraperitoneal इंजेक्शन हालांकि ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) के एक मिश्रण के साथ तदनुसार anesthetize। संज्ञाहरण के तहत, जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए समायोजित एक हीटिंग पैड पर, पैरों पर चिपचिपा टेप का उपयोग करने के लिए एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के नीचे माउस को ठीक करें।
  3. एक वाइपर के बाहर एक छोटा सा तकिया बनाओ और थोड़ा सिर तरक्की के लिए माउस के सिर के तहत यह टेप। (ऊपरी दांत का उपयोग करें) थूथन नीचे खींचने के लिए चिमटे से एक धागा लूप का प्रयोग करें। यह आसान पहुंच के लिए कैरोटिड धमनी के क्षेत्र का खुलासा होगा।
  4. नीचे उरोस्थि के लिए, सीधे जबड़े के नीचे त्वचा के एक छोटे से 5 मिमी गहरी चीरा प्रदर्शन करते हैं।
  5. एफए काटनाSCIA और विभाजन ऊपर छोड़ दिया है या सही आम मन्या धमनी या तो का एक टुकड़ा अलग।
  6. ध्यान में बीच धमनी और उन्हें अलग करने के लिए तंत्रिका चिमटी का परिचय। करीब धमनी के लिए चल रहे तंत्रिका परेशान है और यह कर सकते हैं पोत के लिए नुकसान का कारण बनता है के रूप में मन्या धमनी की बहुत अधिक छूने से बचने मत करो। धमनी के कम से कम 5 मिमी के एक वर्ग पृथक।
  7. कोई भी तरल FeCl 3 के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए ठीक से wipers के साथ धमनी के क्षेत्र सूखी।
  8. आसपास के ऊतकों में लेना नहीं करता FeCl 3 ताकि आम मन्या के अलग हिस्से के तहत छोटे सफेद प्लास्टिक टुकड़ा डाल दिया। इस प्रयोजन के लिए धमनी के तहत प्लास्टिक कागज धीरे धीरे तो पहले एक टुकड़ा लाने के लिए स्लाइड करने के लिए एक दूसरे संदंश का उपयोग करें।
  9. 4% (डब्ल्यू / वी) या 6% (डब्ल्यू / वी) फेरिक क्लोराइड के साथ फिल्टर कागज का एक टुकड़ा लेना और धमनी के आसपास यह सब जगह है।
  10. 3 मिनट के प्रदर्शन के बाद, फिल्टर पेपर से दूर ले पीबीएस के साथ कुल्ला और w क्षेत्र सूखेith वाइपर।
  11. घायल क्षेत्र में पोत के आसपास डॉपलर प्रवाह जांच प्लेस और प्रवाह में परिवर्तन की रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं। वयस्क चूहों के स्वस्थ आम मन्या में, प्रवाह आमतौर पर लगभग 1 मिलीग्राम / मिनट है। सावधानी! किसी भी संपर्क से परहेज किया जाना चाहिए ताकि फेरिक क्लोराइड के साथ जांच के संपर्क जांच नुकसान होगा। इस के साथ साथ प्रस्तुत आंकड़ों एक नैनो डॉपलर प्रवाह जांच 0.5 पीबीएस के साथ सुसज्जित एक Transonic सिस्टम इंक फ्लो मीटर, TS420 परिवाहकीय मॉड्यूल के साथ प्राप्त किया गया।
    नोट: फेरिक क्लोराइड की एकाग्रता अलग रोड़ा समय में जिसके परिणामस्वरूप thrombus गठन के कैनेटीक्स संशोधित कर सकते हैं। इस प्रकार, 6% करने के लिए एक जोखिम (w / v) फेरिक क्लोराइड फेरिक क्लोराइड (w / v) 4% करने के लिए जोखिम की तुलना में तेजी रोड़ा देता है।
  12. सभी प्रक्रियाओं के बाद, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद ketamine और xylazine की अधिक मात्रा का उपयोग करते हुए सभी जानवरों euthanize और ध्यान से डॉपलर जांच साफ।

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Representative Results

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Rhodamine 6G का संचय खोलेगा अन्त्रपेशी के फ्लोरोसेंट intravital माइक्रोस्कोपी अवलोकन FeCl 3 से घायल पोत दीवार के साथ प्लेटलेट्स और ल्यूकोसाइट्स लेबल। एक आंशिक थक्का के प्रगतिशील गठन एक 200 माइक्रोन अन्त्रपेशी पोत (चित्रा 1) में नजर रखी है। एक thrombus धीरे-धीरे प्रकट होता है और स्पष्ट रूप से FeCl 3 के लिए जोखिम के पहले मिनट के बाद से पहचाने जाने योग्य है (चित्रा 1, टी 60 sec =)। 40 सेकंड FeCl 3 से लथपथ फिल्टर पेपर के हटाने के बाद, थ्रोम्बोसिस तेजी से प्रगति की है और अंत में मनाया पूरे पोत खंड की दीवार पर मौजूद है (चित्रा 1, टी 100 sec =)।

चित्र 1
चित्रा 1:। Thrombus ग्रोथ एक अन्त्रपेशी पोत पर फ्लोरोसेंट intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया छवियाँ, 60 से 15 सेकंड में ले जाया गयासेकंड और FeCl 3 समाधान (V / डब्ल्यू) 6% से लथपथ फिल्टर पेपर के बयान के बाद 100 सेकंड। फिल्टर पेपर जोखिम के 60 सेकंड के बाद हटा दिया गया था। Leukocytes और प्लेटलेट्स Rhodamine 6G के पूर्व इंजेक्शन के माध्यम से चिह्नित किया गया (w / 0.5% V)। लाल तीर प्लेटलेट्स / ल्यूकोसाइट्स समुच्चय संकेत मिलता है। स्केल बार 200 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इंट्रा-मन्या थक्का एक अलग कैरोटिड धमनी के आसपास FeCl 3 समाधान में भिगो एक फिल्टर पेपर के आवेदन और एक डॉपलर प्रवाह जांच (चित्रा 2) के साथ दर्ज की गई है चोट के बहाव के रक्त प्रवाह में परिवर्तन से प्रेरित है। 1.1 मिलीलीटर के आसपास एक समग्र लगातार रक्त प्रवाह / मिनट गैर घायल मन्या धमनी में मापा जाता है। FeCl 3 समाधान (w / v) 4% में भिगो एक फिल्टर पेपर के साथ पोत के एक 3 मिनट के प्रदर्शन के बाद, एक पूर्णावरोधक थक्का ओ है13 मिनट और जोखिम की शुरुआत के बाद 30 सेकंड का एक रोड़ा समय के साथ btained। 6% में भिगो एक फिल्टर पेपर के साथ एक 3 मिनट के प्रदर्शन के बाद (w / v) FeCl 3, एक पूर्णावरोधक थक्का 9 मिनट और जोखिम की शुरुआत के बाद 30 सेकंड का एक रोड़ा समय के साथ प्राप्त की है।

चित्र 2
चित्रा 2. FeCl 3 चोट। रक्त प्रवाह के बाद मन्या धमनी के माध्यम से रक्त के प्रवाह के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग 4% (डब्ल्यू / वी) या 6% (से लथपथ फिल्टर पेपर के बस नीचे की ओर मन्या धमनी पर रखा एक डॉपलर प्रवाह जांच के साथ मापा गया था W / वी) FeCl 3। फिल्टर पेपर जोखिम के 3 मिनट के बाद हटा दिया गया था। एक नियंत्रण रक्त के प्रवाह को स्वस्थ मन्या धमनी को मापने के द्वारा प्राप्त किया गया था के रूप में।

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Discussion

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फेरिक क्लोराइड प्रेरित घनास्त्रता मॉडल एक उत्कृष्ट अनुसंधान उपकरण है। इस अध्ययन में दिखाया गया है, इसे लागू करने के लिए बेहद आसान है और intravital माइक्रोस्कोपी या डॉपलर प्रवाहमापी के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया, यह thrombus गठन का एक अच्छा वास्तविक समय की निगरानी प्रदान करता है। समय जोखिम और FeCl 3 की एकाग्रता का समायोजन, यह भी गैर-पूर्णावरोधक या पूर्णावरोधक या तो थ्रोम्बी का उत्पादन करने की संभावना प्रदान करता है।

हालांकि, इस विधि को भी कुछ सीमाएं हैं। कैरोटिड धमनी में, बड़ी खामी रोड़ा समय प्रभावी रूप से संशोधित किया जा सकता है, हालांकि मॉडल के reproducibility ठीक थक्का आकार और विकास दर 10 को नियंत्रित करने के लिए भी कमजोर बनी हुई है। कई समूहों मॉडल 28,29 के मानकीकरण पर काम किया है। ओवेन्स एट अल। कि विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रोड़ा समय अभ्यास के साथ है और इस तरह की उम्र के रूप में सभी भिन्नता कारकों को कम करने से प्राप्त किया जा सकता का सुझाव दियाचूहों, चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि का उपयोग किया संज्ञाहरण, फेरिक क्लोराइड प्रदर्शनी के लिए तकनीक और फेरिक क्लोराइड समाधान 28 की एकाग्रता। डॉपलर जांच खुद भी रोड़ा के निर्धारण को प्रभावित कर सकते हैं, जो पृष्ठभूमि संकेत वर्तमान की एक निश्चित डिग्री के साथ कुछ सीमाएँ हैं। रक्त के प्रवाह को भी अस्थिर थ्रोम्बी के गठन के द्वारा बदला जा सकता है।

Mesenteric पोत पर, reproducibility के अधिक मन्या धमनियों और चोट की हद तक कम हो जाती है हो सकता है कि वसा की मौजूदगी की तुलना में भिन्न होता है कि जहाज के आकार से प्रभावित किया जा सकता है। इसे प्राप्त थ्रोम्बी मीडिया परत 30 की चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं बहा अन्तःचूचुक या भी प्रभावित करने के लिए नियंत्रित कर सकते हैं जो पोत दीवार घाव के आकार के हिसाब से अलग बताया गया है कि। लेजर विकिरण मॉडल एक बेहतर reproducibility प्रदान करता है जो फेरिक क्लोराइड मॉडल के लिए एक अच्छा विकल्प का गठन 8। हालांकि, यह लेजर के प्रवेश को सक्षम करने के लिए पर्याप्त पारदर्शी हैं कि छोटे जहाजों के लिए सीमित है। यह भी इस मॉडल में, endothelial कोशिकाओं फेरिक क्लोराइड आवेदन के बाद नष्ट कर रहे हैं और यह इसलिए endothelial कोशिकाओं की भूमिका पर अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है कि गौर किया जाना चाहिए। हालांकि, यह अन्तःचूचुक 31 की सक्रियता के लिए प्रतिबंधित कर एक कमजोर चोट, प्राप्त करने के लिए कैल्शियम ionophore द्वारा फेरिक क्लोराइड को बदलने के लिए संभव है।

इस मॉडल की एक और सीमा यह रोग की लंबी अवधि के विकास का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं है। इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए, Boulaftali एट अल। कई सप्ताह 32 से अधिक एक ही थक्का की निगरानी जो सक्षम पृष्ठीय skinfold कक्षों विकसित किया है। इस तकनीक को विशेष रूप से अच्छी तरह से थक्का परिपक्वता के अनुसार thrombolytic दवाओं के प्रभाव की जांच के लिए अनुकूल है। इस अध्ययन में, थक्का उम्र बढ़ने Tissu के संयोजक फार्म की अपघट्य कार्रवाई ख़राब नहीं मिलावर्तमान में मानव उपयोग के लिए thrombolytic दवाओं के सोने के मानक है जो ई plasminogen उत्प्रेरक,।

विचार में लिया जाना चाहिए कि कुछ कमियों के बावजूद, FeCl 3 आदर्श मानव घनास्त्रता के अध्ययन के लिए प्रासंगिक है। प्राप्त थ्रोम्बी की रचना ऊतकीय अनुभाग और इंट्रा-मन्या थ्रोम्बी 33 में पहचान की गई है प्लेटलेट्स, आतंच और लाल रक्त कोशिकाओं की उपस्थिति पर विश्लेषण किया गया है। इसके अलावा, atherothrombotic विकार FeCl 3 मॉडल एक यांत्रिक, फोटो, रासायनिक या लेजर से मानव रोग के pathophysiology की नकल करने की संभावना अधिक होती है एक oxido में कमी प्रतिक्रिया हालांकि पोत चोट उत्प्रेरण, लिपो प्रोटीन की oxydation द्वारा शुरू किया जा करने के लिए माना जाता है के बाद से चोट के 34 प्रेरित किया।

फेरिक क्लोराइड भी थक्का-रोधी और विरोधी प्लेटलेट दवाओं दोनों के प्रति संवेदनशील होना वर्णित किया गया है, हालांकि थक्का का गठन। उदाहरण के लिए हेपरिन और क्लोपिडोग्रेल प्रतिनिधि किया गया हैकैरोटिड धमनी 29 में गठन थ्रोम्बी का रोड़ा समय का विस्तार करने के लिए orted। Hirudin के संयोजक फॉर्म के प्रशासन में काफी अन्त्रपेशी microvasculature 17 पर thrombus गठन के समय लंबे समय तक किया गया है। इसलिए, फेरिक क्लोराइड मॉडल घनास्त्रता में उत्कृष्ट अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और नए thrombolytic, थक्का-रोधी और विरोधी प्लेटलेट दवाओं के पूर्व नैदानिक ​​सत्यापन के लिए एक अत्यधिक प्रासंगिक उपकरण है।

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Acknowledgments

लेखकों NHMRC और NHF से तकनीकी जोय याओ और डॉ करेन ऑल्ट से समर्थन, साथ ही धन स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Whatman chromatography paper GE Healthcare 3030917
Iron (III) chloride 40% (w/v) VWR 24212.298
Rhodamine 6G Sigma R4127
Inverted microscope  Olympus IX81
Digital black-and-white camera  Olympus XM10
Doppler flowmeter Transonic TS420
Nano-doppler flow probe Transonic 0.5 PBS
Ketamine Hospira  0409-2051-05
Xylazine (Rampun) Bayer 75313 
Petri dish Sarstedt 82.1472
Insulin syringe (29 G) BD Ultra-Fine 326103
Cotton tipped applicators BSN medical 211827A
Dynek dysilk sutures Dynek Pty Ltd CS30100
Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS) Gibco life technologies 21600-069
Heating pad Kirchner T60

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leadley, R. J., Chi, L., Rebello, S. S., Gagnon, A. Contribution of in vivo models of thrombosis to the discovery and development of novel antithrombotic agents. J Pharmacol Toxicol Methods. 43, (2), 101-116 (2000).
  2. Johnson, G. J., Griggs, T. R., Badimon, L. The utility of animal models in the preclinical study of interventions to prevent human coronary artery restenosis: analysis and recommendations. On behalf of the Subcommittee on Animal, Cellular and Molecular Models of Thrombosis and Haemostasis of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost. 81, (5), 835-843 (1999).
  3. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, (3), 486-494 (2004).
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Ferric क्लोराइड प्रेरित कैरोटिड धमनी और अन्त्रपेशी पोत पर घनास्त्रता माउस मॉडल
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Bonnard, T., Hagemeyer, C. E. Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel. J. Vis. Exp. (100), e52838, doi:10.3791/52838 (2015).More

Bonnard, T., Hagemeyer, C. E. Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel. J. Vis. Exp. (100), e52838, doi:10.3791/52838 (2015).

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