Introduction
O estudo dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento de trombose e a avaliação da eficácia de fármacos anti-trombóticos bem estabelecida requer modelos animais experimentais. Grandes modelos animais foram os primeiros a ser utilizado uma vez que proporcionam grandes vasos mais semelhantes aos seres humanos do que roedores 1. No entanto, de alto custo, as instalações maiores necessários e da dificuldade em manipulá-las geneticamente são os principais inconvenientes para a sua utilização e animais de grande porte são agora limitados a estudos pré-clínicos final uma vez ensaios preliminares em roedores têm dado resultados conclusivos 2. Com a disponibilidade de largura de estirpes transgénicas e knockout e seu pequeno tamanho que minimiza a quantidade de drogas antitrombóticas necessárias para os ensaios in vivo, os ratinhos são utilizados principalmente para a investigação trombose. Portanto, vários modelos de doenças trombóticas tem sido desenvolvido em murganhos 3.
Muitos modelos de trombose estabelecidos perturbar os intimuma camada da parede do vaso, seguido pela exposição da matriz extracelular sub-endotelial para o fluxo sanguíneo induzindo a formação de coágulos sanguíneos 4. Os trombos podem resultar da exposição de colagénio, que provoca activação de plaquetas e / ou a partir da exposição do factor tecidual que activa a cascata de coagulação 5. Várias técnicas são então utilizados para realizar a lesão inicial navio. Pierangeli et ai. Desenvolveram um modelo de ruptura mecânica com uma ferramenta de microcirurgia na veia femoral 6. Kikushi et ai. Descreveu um modelo que consiste na administração de um composto reactivo foto (Rosa de Bengala) que se acumula na bicamada lipídica de células endoteliais, seguido por excitação específica da parede do vaso de interesse com luz verde (540 nm) 7. A lesão, também pode ser induzida por uma alta intensidade de iluminação curto pulso de laser 8. Outra técnica, em primeiro lugar estabelecido na artéria carótida de ratosconsiste na aplicação tópica de cloreto férrico (FeCl3) 9. Neste caso, os resultados denudação vaso de radicais livres gerados por FeCl 3, que faz com que a peroxidação lipídica e destruição de células endoteliais 10. A lesão induz a expressão de várias moléculas de adesão que desencadeiam a adesão e agregação de plaquetas, bem como o recrutamento de leucócitos. Demonstrou-se que os leucócitos, principalmente os neutrófilos, desempenham um papel crucial na activação da cascata de coagulação do sangue levando a trombose 11. Este método está bem adaptado para reproduzir a cascata de coagulação; os investigadores devem ter em mente que, neste modelo de ratinho, a trombose é tipicamente induzido em vasos saudáveis enquanto a trombose em seres humanos está ocorrendo principalmente na ex doente. vasos ateroscleróticos.
Como este modelo é muito simples de implementar e é também eficaz em camundongos, é agora o modo de trombose usado na maior partel para pequenos animais em estudos in vivo. Além disso, esta técnica oferece a possibilidade de induzir a formação de trombos numa variedade de vasos. Navios-alvo pode ser artérias ou veias de grande diâmetro (carótida, femoral, veia cava) ou de pequeno diâmetro (mesentério, cremaster) 12-14. Mais recentemente, foi também utilizado na artéria cerebral média proximal para desenvolver um modelo de acidente vascular cerebral 15. A formação da trombose pode ser directamente observada por meio de microscopia intravital após marcação fluorescente de plaquetas e leucócitos ou monitorizada medindo a diminuição do fluxo sanguíneo com uma sonda de temperatura ou uma sonda Doppler 12,16,17. Vários parâmetros, tais como tempo de oclusão, o tempo de formação de trombos ou tamanho do trombo pode então ser investigados. As diferenças fisiológicas entre os vasos investigado resultado em variações significativas na trombos obtido. Portanto, os pesquisadores geralmente selecionar o vaso-alvo de acordo com os parâmetros que eles querem measure e / ou a configuração que deseja investigar a doença. Normalmente, o modelo na artéria carótida é mais relevante para a pesquisa sobre aterotrombose relacionada ao infarto do miocárdio ou acidente vascular cerebral enquanto que estudos sobre a veia cava são mais relevantes para a pesquisa sobre trombose venosa profunda. A acessibilidade dos diferentes vasos também determina o método utilizado para medir o crescimento do trombo. Por exemplo, os vasos mesentéricos são de fácil acesso tornando este modelo adequado para observação microscópica intravital e o estudo da dinâmica de formação de trombos. A artéria carótida é menos acessível, mas maior, permitindo medições de fluxo de sangue e fornecer um excelente modelo para estudar a trombose oclusiva.
O modelo de trombose induzida cloreto férrico tem prestado um enorme progresso na compreensão desta patologia. Ele tem sido usado em muitos estudos que incidem sobre o papel do factor de von Willebrand na formação da trombose 18,19. Combinado com modi genéticatécnicas ficação, permitiu a identificação de muitos genes específicos envolvidos em doenças trombóticas. Lamrani et ai. por exemplo, demonstraram que um knock-in do gene JAK2 V617F está associada com uma formação acelerada de coágulo instável 20. Zhang et ai. Investigaram a implicação fisiológica do receptor P2Y12 de plaquetas e demonstraram que os ratinhos transgénicos que sobre-expressam este receptor especificamente em plaquetas somente, apresentou uma formação de trombo mais rápida e estável na artéria mesentérica feridos com FeCl 3 21. O papel crucial de activador do plasminogénio tipo tecido (tPA) e uroquinase-tipo do activador de plasminogénio (uPA) no processo de degradação de fibrina, também tem sido investigada neste método 22. Além disso, este modelo também fornece um modo simples e preciso de testar as capacidades fibrinolíticas de muitas drogas novas in vivo. Por exemplo, Wang et al. Usaram este modelo de the validação pré-clínica de um romance ativador do plasminogênio recombinante dirigido contra plaquetas ativadas 23. Este método também permitiu a validação de proteínas terapêuticas isoladas a partir da saliva de morcegos vampiros, carrapatos e mosquitos, ou a partir do veneno de serpentes de identificação específico do alvo 24-27. Estes exemplos demonstram a versatilidade do modelo de cloreto férrico. Neste artigo, vamos nos concentrar em dois métodos e estudar cloreto férrico trombose induzida em dois tipo de navio diferente; vaso mesentérico e artéria carótida.
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Protocol
Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Alfred Pesquisa Médica e da Educação Comissão de Ética Animal Precinct (E / 1534/2015 / B). Todas as manipulações cirúrgicas foram realizadas sob anestesia geral e os animais não apresentaram dor em qualquer fase. Todas as experiências descritas são não-recuperação.
1. Preparação
- Cortar bandas finas de papel de filtro (1 mm x 2 mm).
- Recentemente preparar duas soluções de cloreto férrico, de 4% (w / v) e 6% (w / v) diluída em água desionizada. Preparar a solução de rodamina 6G 0,3% em PBS, filtrou-se através de 0,22 um.
- Corte um pequeno pedaço (5 mm x 1 cm) a partir da seringa de plástico branco de embalagem.
2. Mesentery arteríola formação de trombos Observado por Microscopia intravital
- Pesar de 10-12 semanas de idade C57BL / 6 de tipo selvagem do rato e anestesiar em conformidade com uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg), embora a injecção intraperitoneal. Monitore a profundidade da anestesia com a resposta aos pés, cauda e / ou pitada pele, reatividade de pitada córnea e da pálpebra, e ausência de movimento bigodes. Se necessário, injectar uma segunda dose de cetamina (50 mg / kg) para manter a anestesia do animal. Aplicar pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia. Colocar o rato numa pequena placa de petri colocado sobre uma almofada de aquecimento ajustada a 37 ° C.
Nota: Embora a injecção IP pode resultar em dor para os animais, a duração deste desconforto será mínimo (menos de 3 segundos). Dor e desconforto associado com injecções irá ser minimizado através da utilização de pessoal experiente e competentes e tamanho da agulha adequada (25 L). Após todos os procedimentos, todos os animais a eutanásia, usando uma overdose de cetamina e xilazina, seguido por deslocação cervical. - Executar uma incisão na linha média abdominal de cerca de 3 cm na pele e corte cuidadosamente o peritônio.
- Colocar o rato no lado do animal de estimaçãori prato, exteriorizar suavemente seus intestinos e espalhar cuidadosamente o mesentério com 2 cotonetes para trazer um recipiente adequado para a superfície da placa de Petri. Secar bem com um limpador delicado.
NOTA: Para limitar o movimento dos vasos mesentéricos, a papaverina pode ser utilizado para inibir o peristaltismo intestinal. - Embeber a cauda do rato em água morna para dilatar os vasos e injectar 30 jil de Rodamina 6G (0,3%) na veia da cauda do rato com uma seringa 29 G para marcar leucócitos e plaquetas.
- Coloque a placa de Petri sob um microscópio invertido e foco no arteriole escolhido utilizando o canal de campo claro.
- Embebe-se um papel de filtro de banda com 6% (w / v) de ferro (III) e cloreto de aplicar o papel de filtro sobre a arteríola com duas pinças; a primeira a realizar o papel de filtro, o segundo ao pressioná-lo suavemente sobre a área de interesse. Observar a formação de trombos nos primeiros 10 segundos após a deposição do papel de filtro.
NOTA: É muito commpara ferir a microvasculatura rodeado e a precisão da deposição do papel de filtro e a pressão é, por conseguinte, importante suavemente para limitar este problema. - Observe a formação de trombos por microscopia de fluorescência (TRITC canal: excitação de pico 557 nm, 576 nm pico de emissão), por meio do papel de filtro. Observe os leucócitos circulantes e plaquetas, que têm tido até o Rodamina 6G ea sua agregação para o trombo é, portanto, fácil de identificar.
- Aqui o papel de filtração após 1 min de exposição a ferro (III) e cloreto de continuar a monitorizar a formação do trombo. Lavar o recipiente com PBS.
- Observar e registar a formação dinâmica do trombo em destaque com a rotulagem de plaquetas e leucócitos com a Rodamina 6G. Capturar as imagens e medir o tamanho do trombo. As imagens aqui apresentados foram obtidos com um microscópio intravital invertido, embora uma objectiva de 4X, no canal de fluorescência TRITC.
- Fepois todos os procedimentos, a eutanásia dos animais usando uma overdose de cetamina e xilazina, seguido por deslocação cervical.
3. Formação Carótida Artéria Thrombus avaliada pela medição do fluxo de sangue Velocity
- Pesar de 10-12 semanas de idade C57BL / 6 mouse e anestesiar em conformidade com uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg), embora a injecção intraperitoneal. Aplicar pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia.
- Corrigir o mouse sob um microscópio cirúrgico usando fita adesiva nas pernas, em uma almofada de aquecimento ajustado para 37 ° C.
- Faça um pequeno travesseiro para fora de um limpador e gravá-lo sob a cabeça do rato para elevar a cabeça ligeiramente. Use um loop fio com pinças para puxar o focinho para baixo (use dentes superiores). Isto irá expor a região da artéria carótida para fácil acesso.
- Realize uma pequena 5 mm de profundidade da incisão da pele logo abaixo da mandíbula, até o esterno.
- Dissecar a fascia e isolar um fragmento de qualquer artéria carótida comum esquerda ou para a direita acima da bifurcação.
- Introduzir cuidadosamente pinças em-entre a artéria eo nervo para separá-los. Não perturbe o nervo que perto da artéria e evitar tocar muito da artéria carótida, uma vez que pode causar danos ao navio. Isolar uma secção de pelo menos 5 mm da artéria.
- Seca-se a área da artéria adequadamente com escovas para evitar que qualquer líquido que interfere com o FeCl 3.
- Coloque o pequeno pedaço de plástico branco sob a parte isolada da carótida comum, de modo a FeCl3 não mergulhe nos tecidos circundantes. Para esta finalidade, utilizar um segundo uma pinça para trazer a peça para o primeiro, em seguida, lentamente deslizar o papel plástico sob a artéria.
- Embebe-se um pedaço de papel de filtro com 4% (w / v) ou 6% (w / v) de cloreto férrico e colocá-lo em redor da artéria.
- Após 3 min de exposição, retirar o papel de filtro, lavar com PBS e secar a área wlimpadores de pára-om.
- Coloque a sonda de fluxo Doppler em torno do navio no local da lesão e começar a gravar as mudanças no fluxo. Na carótida comum saudável de ratos adultos, o fluxo é normalmente cerca de 1 mL / min. Cuidado! contacto da sonda com cloreto férrico vai danificar a sonda de modo que qualquer contacto deve ser evitado. Os dados aqui apresentados foram obtidos com um medidor de fluxo Transonic System Inc., perivascular TS420 módulo equipado com uma sonda de fluxo Doppler Nano 0,5 PBS.
NOTA: A concentração de cloreto férrico pode modificar as cinéticas de formação de trombo, resultando em diferentes tempos de oclusão. Assim, uma exposição a 6% (w / v) de cloreto férrico dá uma oclusão mais rápido do que a exposição a 4% (w / v) de cloreto férrico. - Seguindo todos os procedimentos, eutanásia todos os animais usando uma overdose de cetamina e xilazina seguido por deslocamento cervical e limpar cuidadosamente a sonda Doppler.
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Representative Results
A observação de microscopia intravital fluorescente do mesentério irá revelar a acumulação de Rodamina 6G marcado plaquetas e leucócitos ao longo da parede do vaso lesionado por FeCl 3. A formação progressiva de um trombo é monitorizado parcial num recipiente de 200 um mesentério (Figura 1). Um trombo aparece lentamente e é claramente identificável após o primeiro minuto de exposição à FeCl 3 (Figura 1, t = 60 segundos). 40 segundos após a remoção do papel de filtro embebido com FeCl 3, a trombose progride rapidamente e é finalmente presente na parede da secção de todo navio observado (Figura 1, t = 100 seg).
Figura 1:. Crescimento de trombos Observado por Fluorescent Intravital Microscopia em um navio Mesentery As imagens foram tiradas em 15 segundos, 60seg e 100 segundos após a deposição do papel de filtro embebido com 6% (w / v) de solução de FeCl3. O papel de filtro foi removido após 60 s de exposição. Os leucócitos e plaquetas foram marcadas através de pré-injecção de Rodamina 6G (0,5% w / v). As setas vermelhas indicam plaquetas / leucócitos agregados. Barra de escala de 200 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Um trombo intra- carótida é induzida pela aplicação de um papel de filtro embebido em solução de FeCl3 em torno de uma artéria carótida isolado e as alterações no fluxo sanguíneo a jusante da lesão é gravado com uma sonda de fluxo Doppler (Figura 2). Um fluxo constante de sangue global de cerca de 1,1 mL / min é medida na artéria carótida não lesado. Após uma exposição de 3 minutos da embarcação com um papel de filtro embebido em 4% (w / v) de solução de FeCl3, um trombo oclusivo é obtained com um tempo de oclusão de 13 minutos e 30 segundos após o início da exposição. Após uma exposição de 3 minutos com um papel de filtro embebido em 6% (w / v) de FeCl3, um trombo oclusivo é obtido com um tempo de oclusão de 9 min e 30 seg depois do início da exposição.
Figura 2. representativas Gravações de fluxo sanguíneo através da artéria carótida após lesão FeCl3 fluxo de sangue. Foi medida com uma sonda de fluxo Doppler colocado na artéria imediatamente a jusante do papel de filtro embebido com 4% (w / v) ou 6% (carótida w / v) de FeCl3. O papel de filtro foi removido após 3 min de exposição. Como um controlo do fluxo de sangue foi obtida medindo-se a artéria carótida saudável.
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Discussion
O modelo de trombose cloreto férrico induzida é uma excelente ferramenta de pesquisa. Como se mostra neste estudo, é extremamente fácil de implementar e, quando utilizado em combinação com a microscopia intravital ou medidor de fluxo de Doppler, que fornece uma boa monitorização em tempo real de formação de trombos. Ajustando o tempo de exposição e a concentração do FeCl 3, como também oferece a possibilidade de produzir ou trombos oclusivos ou não-oclusivos.
No entanto, este método também tem algumas limitações. Na artéria carótida, o principal inconveniente é que, embora o tempo de oclusão pode ser modificado de forma eficaz, a reprodutibilidade do modelo permanece muito fraco para controlar com precisão o tamanho do trombo e a taxa de crescimento 10. Vários grupos têm trabalhado em uma padronização do modelo de 28,29. Owens et ai. sugeriu que o tempo de oclusão fiável e reprodutível pode ser obtido com a prática e, reduzindo a todos os factores tais como a variação de idadeos ratos, o fundo genético do ratinho, a anestesia utilizada, a técnica para a exposição de cloreto férrico e a concentração da solução de cloreto férrico 28. A sonda Doppler si também tem algumas limitações com um certo grau de sinal de fundo presente, que pode afectar a determinação da oclusão. O fluxo de sangue pode também ser alterada pela formação de trombos instável.
No vaso mesentérico, a reprodutibilidade pode ser afectada pelo tamanho do vaso, que varia mais do que as artérias carótidas e a presença de gordura, que pode diminuir a extensão da lesão. Tem sido relatado que os trombos obtido diferem de acordo com o tamanho da lesão do vaso de parede que pode conter ao endotélio derramamento ou também afecta as células do músculo liso da camada média 30. O modelo de irradiação do laser constitui uma boa alternativa do modelo de cloreto férrico que proporciona uma melhor reprodutibilidade 8. No entanto, ela é limitada a pequenos vasos que são suficientemente transparente para permitir a penetração do laser. Deve ser também notado que, neste modelo, as células endoteliais são destruídos após a aplicação de cloreto férrico, pelo que não é adequado para estudos sobre o papel das células endoteliais. No entanto, é possível substituir o cloreto férrico pelo ionóforo de cálcio para se obter uma lesão fraca, restrito à activação do endotélio 31.
Uma outra limitação deste modelo é que ele não é adequado para estudar a evolução a longo prazo da doença. Para cumprir este requisito, Boulaftali et al. Desenvolveram câmaras de dobras cutâneas dorsal que permitem o acompanhamento da mesma trombo ao longo de várias semanas 32. Esta técnica é especialmente bem adequado para examinar os efeitos de medicamentos trombolíticos de acordo com a maturidade do trombo. Neste estudo, o envelhecimento do coágulo foi encontrado para prejudicar a acção lítica de uma forma recombinante de tissue ativador do plasminogênio, que é atualmente o padrão ouro de trombolíticos para uso humano.
Apesar de algumas desvantagens que devem ser tomadas em consideração, o modelo de FeCl3 é relevante para o estudo de trombose humana. A composição do trombo obtido foi analisado na secção histológica e a presença de fibrina, plaquetas e glóbulos vermelhos do sangue têm sido identificados na trombos intra- carótida 33. Além disso, uma vez que desordem aterotrombose é assumido para ser iniciado pela oxidação de lipoproteínas, induzindo a lesão do vaso, embora uma reacção de redução-oxido o modelo de FeCl3 é mais provável para imitar a patofisiologia da doença humana do que um, foto-química mecânica ou laser induzida lesão 34.
O trombo formado embora cloreto férrico também foi descrito para ser sensível a ambas as drogas anticoagulantes e anti-agregantes plaquetários. Heparina e Clopidogrel por exemplo ter sido representanteorted para estender o tempo de oclusão de trombos formados na artéria carótida 29. A administração de uma forma recombinante de hirudina prolongou significativamente o tempo de formação do trombo na microvasculatura mesentério 17. Portanto, o modelo de cloreto férrico oferece excelentes perspectivas de trombose e é uma ferramenta altamente relevante para a validação pré-clínica de novos trombolíticos, anticoagulantes e antiagregantes plaquetários.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o apoio técnico da Alegria Yao e Dr. Karen Alt, bem como o financiamento do NHMRC e NHF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman chromatography paper | GE Healthcare | 3030917 | |
| Iron (III) chloride 40% (w/v) | VWR | 24212.298 | |
| Rhodamine 6G | Sigma | R4127 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| Digital black-and-white camera | Olympus | XM10 | |
| Doppler flowmeter | Transonic | TS420 | |
| Nano-doppler flow probe | Transonic | 0.5 PBS | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine (Rampun) | Bayer | 75313 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472 | |
| Insulin syringe (29 G) | BD Ultra-Fine | 326103 | |
| Cotton tipped applicators | BSN medical | 211827A | |
| Dynek dysilk sutures | Dynek Pty Ltd | CS30100 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS) | Gibco life technologies | 21600-069 | |
| Heating pad | Kirchner | T60 |
References
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