Summary
في حين تحليل عالية الدقة ذوبان يوفر القدرة على التمييز بين الأشكال النووية المنفردة في عدد السكان غير متجانسة، ويمكن أليل متحولة التضخيم التحيز زيادة قدرتها على اكتشاف الأليلات الحالية بنسب منخفضة نسبيا ضمن العينة. يصف هذا البروتوكول التحسينات التي من شأنها تحسين حساسية التحليل ذوبان عالية الدقة.
Abstract
على الرغم من عقود من الجهود المبذولة للقضاء، لا يزال الملاريا العبء العالمي. وقد رافق الاهتمام المتجدد الأخيرة في القضاء الإقليمي والعالمي من خلال القضاء على زيادة المعلومات الجينومية عن المتصورة أنواع الطفيليات المسؤولة عن الملاريا، بما في ذلك خصائص السكان الجغرافي وكذلك الاختلافات المرتبطة مع انخفاض الحساسية للأدوية المضادة للملاريا.
واحدة الاختلاف الجيني المشترك، تعدد الأشكال وحيدة النوكليوتيدات (النيوكلوتايد)، ويقدم أهدافا جذابة للطفيلي التنميط الجيني. هذه العلامات هي مفيدة ليس فقط لتتبع علامات مقاومة الأدوية ولكن أيضا لتتبع السكان الطفيل باستخدام علامات لا تخضع المخدرات أو الضغوط الانتقائية الأخرى.
أساليب التنميط الجيني SNP توفر القدرة على تتبع مقاومة المخدرات وكذلك بصمات الطفيليات الفردية لمراقبة السكان، ولا سيما في استجابة لجهود مكافحة الملاريا في المناطق تقترب eliminatحالة أيون.
في حين تم التعرف على تعدد الأشكال بالمعلومات التي الملحد على التكنولوجيات التنميط الجيني محددة، وارتفاع القرار ذوبان (HRM) التحليل دراسات ميدانية لمناسبة خاصة. بالمقارنة مع الطرق قياسية استنادا فلوري مسبار التي تتطلب تعدد الأشكال الفردية في تحقيق واحد وصفت وتقديم حساسية 10٪ في أحسن الأحوال للكشف عن تعدد الأشكال في عينات التي تحتوي على جينات متعددة (polygenomic)، إدارة الموارد البشرية يوفر حساسية 2-5٪. تعديلات على إدارة الموارد البشرية، مثل تحقيقات منعت وتركيزات التمهيدي غير المتماثلة وكذلك تعظيم الاستفادة من درجات الحرارة التضخيم الصلب للانحياز نحو PCR التضخيم من أليل طفيفة، مما يزيد من حساسية HRM. في حين أن تحسين حساسية يعتمد على فحص معين، قمنا بزيادة الحساسيات الكشف إلى أقل من 1٪ من أليل طفيفة.
في مناطق الاقتراب القضاء على الملاريا، كشف المبكر عن مقاومة الأدوية المستوردة الناشئة أو أمر أساسي للعلاقات العامةاستجابة ompt. وبالمثل، فإن القدرة على الكشف عن العدوى polygenomic وتفرق أنواع الطفيليات المستوردة من الخزانات المحلية خفي يمكن أن تبلغ برامج المكافحة.
تصف هذه المخطوطة تعديلات على التكنولوجيا انصهار عالية الدقة التي زيادة حساسيتها لتحديد العدوى polygenomic في عينات من المرضى.
Introduction
على الرغم من تجدد الاهتمام في مجال مكافحة الملاريا والقضاء، لا تزال الملاريا تشكل عبئا في جميع أنحاء العالم، مع ما يقرب من نصف سكان العالم عرضة لخطر العدوى وأكثر من 550،000 حالة وفاة سنويا، وبخاصة الأطفال في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى 1.
وقد تم دعم هذه البرامج مكافحة واستئصال جديدة من النهضة الجينومية، مع أعداد كبيرة من طفيليات الملاريا التسلسل وتحليلها لالطفرات المرتبطة انخفاض حساسية العقاقير، وزيادة الفوعة، والخصائص السكانية 2،3. الأشكال واحدة النوكليوتيدات (النيوكلوتايد) هي من بين المتغيرات الجينية التي تم تحديدها الأكثر شيوعا 4-7.
المحمولة أساليب التنميط الجيني SNP تقدم في الموقع ومراقبة السكان في الوقت الحقيقي وتتبع 8. بالإضافة إلى بصمات الطفيليات الفردية، يتم استخدام "الباركود الجزيئي" أيضا للكشف عن التحولات الزمنية الهائلة في تواتر الصبغياتوكذلك التباين الفعلي حجم السكان وتعقيد إصابة 9.
في حين أن هذا مجموعة من المفيد تعدد الأشكال وتتكيف بسهولة مع العديد من المنصات التنميط الجيني، وارتفاع القرار الذوبان (HRM) التحليل بشكل خاص مناسبة تماما للدراسات، حيث التشغيل والكشف عن الطفرات الجديدة بتكاليف منخفضة الحساسة وبسيطة مقارنة التسلسل وميدانية أخرى تستند إلى النهج جذابة في البيئات الفقيرة في الموارد.
HRM يبدأ سلسلة من ردود الفعل البلمرة القياسي (PCR) الذي يشتمل على صبغة الفلورسنت. بعد ذوبان PCR تحليل يحدد درجة حرارة الذروة amplicon ذوبان. فرق SNP واحد في amplicon قصيرة يمكن أن يؤدي إلى درجة حرارة كبيرة ذروة الذوبان (TM) الخلافات.
العديد من التحسينات على هذه الطريقة توفر أفضل قرار التنميط الجيني للتمييز تعدد الأشكال بما في ذلك الطبقة الرابعة (AT) تعدد الأشكال، وكشف أليل متحولة طفيفة في عينات مع الأليلات متعددة الحالية (polygالتهابات enomic). أولا، المقايسات تتضمن تحقيقات قصيرة طيرانها فوق المنطقة SNP بالإضافة إلى الأمام والاشعال التي تكون موجودة بتركيزات مختلفة عكس. لا تتضخم هذه التحقيقات منعت خلال PCR، ولكن ربط حبلا المنتجة زيادة نظرا لتركيزات التمهيدي غير المتماثلة التي تزيد من إنتاج المنتج التحقيق قالب. هذه amplicons المزدوج تقطعت بهم السبل منفصلة تتكون من التحقيق متجهة إلى القالب حبلا الزائدة هي ~ 20-30 سنة مضت. على طول انخفضت بشكل ملحوظ مقارنة مع amplicon كامل (80-150 بي بي) تؤدي إلى اختلافات تيم أكبر من ذلك بكثير المرتبطة قاعدة واحدة أو متعددة التحقيق قالب عدم التطابق 10.
ثانيا، أليل متحولة التضخيم التحيز (مآب) يخفض درجة الحرارة الصلب رد فعل للانحياز رد الفعل تجاه أليل متحولة الحاضرة في نسب منخفضة في التهابات polygenomic. يتم تعيين درجة الحرارة الصلب بين TMS من مطابقة تماما (النوع البري) ومتطابقة (متحولة) التحقيقالصورة. عند هذه الدرجة، الربط من النوع البري أليل غير مستقرة بما فيه الكفاية ما يعوق هذا التضخيم مقارنة بما يعادل عدم تطابق لها، وبالتالي يتحامل التضخيم نحو أليل متحولة عندما كلاهما موجود في عينة واحدة (10).
مع هذه التحسينات HRM، وهذه التكنولوجيا قد سمح تتبع أصول وهوية الطفيليات المرتبطة بالعدوى الوباء في أمريكا الجنوبية 11 و الكشف عن الطفرات الجديدة، والتمايز من تعدد الأشكال متعددة تقع مباشرة بجوار بعضها البعض في تسلسل، والطفرات الموجودة في أقل من 1 ٪ من الأليلات في عينات polygenomic 10.
زيادة حساسية أهمية خاصة في مناطق الاقتراب الوضع قبل القضاء وأولئك المعرضين للخطر للمقاومة المخدرات الناشئة. القدرة بسرعة وسهولة لتحديد الطفيليات وتعدد الأشكال المستوردة المرتبطة انخفاض حساسية في الموقع بإعلام جهود المراقبة والتحكم عن البرامجفعالية التنفيذ، ويحدد النقاط الساخنة لزيادة جهود القضاء على الملاريا والقضاء عليها. يصف هذا البروتوكول الطرق لحجب مسبار يعمل بنظام ومآب لزيادة حساسية HRM التنميط الجيني.
Protocol
ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول كميات وتركيزات لمدة 96 جيدا لوحة، وشرائط 8-أنبوب، والنظم القائمة على الشعرية (10 ميكرولتر حجم رد الفعل)؛ ومع ذلك، HRM يمكن أيضا أن يؤديها في النظم القائمة على 384 لوحة جيدا مع حجم رد الفعل 5 ميكرولتر عن طريق التوسع كافة وحدات التخزين في المقابل. مجموعة من الكشف عن معظم الأنظمة هو 10 خريج إلى 10 نانوغرام DNA القالب.
1. إعداد قوالب
- الحصول على عينات المتصورة المنجلية مباشرة من الدم تم الحصول عليها من المرضى المشاركين في الدراسات الميدانية وموقع تخزينها والدم كله، وخلايا الدم الحمراء مكعبات، أو على ورق الترشيح.
ملاحظة: قد يكون أيضا عينات لتنمو في المختبر تتكيف مع الثقافة؛ ويمكن طلب بعض سلالات مختبر القياسية للتحليل من مركز الموارد للبحث والمراجع الكاشف الملاريا (MR4، يمكن استخدام عينات مباشرة من خلايا الدم الحمراء مكعبات أو الثقافة أو المستخرجة من دم كاملة، وخلايا الدم الحمراء، أو ورق الترشيح. - الحمض النووي المستخرج منورق الترشيح أو سلالات تتكيف مع الثقافة
ملاحظة: إدارة الموارد البشرية حساسة للتركيز الملح. الخلافات تركيز بسبب أساليب استخراج متغير يمكن أن تؤثر بشكل كبير ذوبان درجات الحرارة. في حين مخازن النهائية المحددة ليست عاملا مهما للنجاح، واستخدام معيار مشترك شطف أو إعادة تعليق العازلة (أي الماء، 1X تي ['منخفضة تي "أو" DNA تعليق العازلة ": 10 ملي تريس، الكلور، 0.10 ملي EDTA] أو 1X TE [10 ملي تريس، الكلور، 1 ملم EDTA]) لجميع العينات لتجنب الشاذة أو غير متسقة منحنيات الذوبان.- إعداد التخفيفات قالب من 10 خريج -10 نانوغرام لكل ميكرولتر في مستوى الشركة المصرية للاتصالات، TE، أو المياه لكل رد فعل 10 ميكرولتر.
- التضخيم مباشرة من خلايا الدم الحمراء مكعبات
- تحديد الطفيل خلايا الدم الحمراء باستخدام رقيقة اللطاخة المجهر
ملاحظة: تتوفر طرق لتحديد الطفيل خلايا الدم الحمراء المصابة من مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC): HTTP: //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html - تمييع parasitemias فوق 0.5٪ 1: 400 في PCR الصف المياه، TE، أو الشركة المصرية للاتصالات. استخدام 3 ميكرولتر لكل ميكرولتر رد فعل 5- 10.
- تحديد الطفيل خلايا الدم الحمراء باستخدام رقيقة اللطاخة المجهر
- ضوابط
ملاحظة: إدارة الموارد البشرية يمكن أن تستخدم للمسح الضوئي للكشف عن الجينات تسلسل المتغيرات في عدد سكانها 12؛ ومع ذلك، يتطلب التنميط الجيني دقيقة يجري التحقيق معهم معايير لاحتواء SNP-التحقق من التسلسل. يبني البلازميد أو الملاريا المعزولة مع المورثات المعروفة يمكن استخدامها. بالنسبة لمعظم التطبيقات، ويستخدم 3D7 (MR4 MRA-151) كجهاز تحكم من النوع البري. بسبب التباين بين التي تديرها، وتشمل دائما الضوابط الإيجابية والسلبية.- الضوابط الإيجابية: إعداد 10 خريج - 10 نانوغرام لكل 1 التخفيفات ميكرولتر من البلازميد أو المعايير مع التحقق من تسلسل المورثات SNP.
- السيطرة السلبية: استخدام PCR المياه الصف كوسيلة لمراقبة أي قالب (NTC) لردود الفعل التضخيم.
- تحضير خليط التفاعل
- تراكب النفط (اختياري) المعدنية. ملاحظة: بعض أنظمة إدارة الموارد البشرية هي منصات ذوبان بذاتها وليس لها غطاء ساخنة لمنع التكثيف والتبخير المنتج خلال التضخيم.
- إضافة 20 ميكرولتر الزيوت المعدنية الخفيفة إلى كل لوحة جيدا قبل تحميل خليط التفاعل.
- إعداد 10X الأسهم عمل جميع المقايسات
- الرجوع إلى الجدول رقم 1 لالموصى 10X العمل تركيزات الأسهم وكذلك تركيزات النهائية لمقرها منعت مسبار-HRM التنميط الجيني.
- إعداد الخلائط رد فعل
- إلى كل بئر في لوحة أو أنبوب، إضافة 1 ميكرولتر 10X العمل الأسهم إلى الأمام والاشعال وتحقيقات، 4.0 عكس - 5.0 ميكرولتر 2.5X 2.0X أو HRM مزيج الرئيسي، 1 قالب ميكرولتر، وPCR المياه الصف لحجم رد الفعل الكلي لل10 ميكرولتر .
- بطانات أو أنابيب
- استخدام لوحة الضوئية الصورةeals لتضخيم القائم على لوحة، والقبعات البصرية للأنظمة المستندة إلى قطاع أنبوب، وأغطية بلاستيكية لأنظمة المستندة إلى الشعيرات الدموية. كن على يقين تغطية كاملة والأطباق والقبعات ومختومة تماما وتأمينها لمنع التبخر خلال التضخيم.
- عينات تدور
- لوحات تدور 3 دقائق في 1800 x ج لإزالة فقاعات الهواء وفصل مراحل النفط والمائية إذا تم استخدام الزيوت المعدنية.
- تراكب النفط (اختياري) المعدنية. ملاحظة: بعض أنظمة إدارة الموارد البشرية هي منصات ذوبان بذاتها وليس لها غطاء ساخنة لمنع التكثيف والتبخير المنتج خلال التضخيم.
- بروتوكول التضخيم
- وضع لوحات رد فعل أو الأنابيب في cycler الحرارية. تشغيل مستوى بروتوكولات منعت مسبار أو مآب التضخيم (الجداول 2 و 3 على التوالي). لاحظ الفرق في درجة الحرارة الصلب بين هذه الأساليب.
تحليل 3. HRM
- ذوبان
- بعد PCR التضخيم، انتقل إلى ذوبان التحليل. لأنظمة ذوبان بذاتها التي ليس لديها المدمج في التضخيم (على سبيل المثال، نظم BioFire الدفاع LightScanner)، وإعادةنقل لوحة تضخيمها من cycler الحرارية ومكان في وثيقة HRM. من واجهة البرنامج نظام، تذوب لوحة 40-80 ° C لإنتاج كل من التحقيق وamplicon قمم ذوبان.
ملاحظة: لحفظ ذوبان وتحليل الوقت، يمكن اختصارها في إطار ذوبان لتغطية تتراوح درجة الحرارة لمجرد تحقيق أو المناطق amplicon ذوبان. بعد ذوبان، لوحات وأنابيب يمكن إعادة صهرها إذا لزم الأمر وتخزينها في -20 ° C أو 4 درجات مئوية. أنابيب متجر الزجاج فقط في 4 درجات مئوية لمنع أنابيب من التصدع.
- بعد PCR التضخيم، انتقل إلى ذوبان التحليل. لأنظمة ذوبان بذاتها التي ليس لديها المدمج في التضخيم (على سبيل المثال، نظم BioFire الدفاع LightScanner)، وإعادةنقل لوحة تضخيمها من cycler الحرارية ومكان في وثيقة HRM. من واجهة البرنامج نظام، تذوب لوحة 40-80 ° C لإنتاج كل من التحقيق وamplicon قمم ذوبان.
- تحليل ذوبان
- إزالة عينات سلبية
- ضمن برامج التحليل، وترفع من مزيد من عينات التحليل التي لم تضخيم أو التي لها قمم ذوبان خشنة. ملاحظة: بعد اختيار طريقة تحليل لملف التشغيل الفردي، وأداة تلقائيا مجموعة العينات الإيجابية والسلبية. قبل التنميط الجيني كل مجموعة فرعية، يمكن للمستخدم تغيير المكالمات يدويا.
- إما من ذوبانمنحنى أو ذوبان ذروة العرض، انقر بزر الماوس الأيمن على منحنيات المراد إزالتها لتحديدها. بعد اختيار العينات أساء تصنيف، انتقل إلى "مكالمة جديدة"، حدد تجمع المناسب، وانقر فوق "تطبيق التغيير."
- ضمن برامج التحليل، وترفع من مزيد من عينات التحليل التي لم تضخيم أو التي لها قمم ذوبان خشنة. ملاحظة: بعد اختيار طريقة تحليل لملف التشغيل الفردي، وأداة تلقائيا مجموعة العينات الإيجابية والسلبية. قبل التنميط الجيني كل مجموعة فرعية، يمكن للمستخدم تغيير المكالمات يدويا.
- تطبيع
- من مشتقات السلبية لمضان تطبيع مع الاحترام لدرجة حرارة (-dF / DT) ('المنحنيات الفرق') نظر، نقل قضبان التطبيع لتطويق التحقيق تذوب المنطقة.
ملاحظة: لجنة التحقيق تذوب المنطقة هي انخفاض درجة الحرارة في المناطق ذوبان اثنين. يجب أن تكون قضبان التطبيع في قاعدة القمم تذوب.
- من مشتقات السلبية لمضان تطبيع مع الاحترام لدرجة حرارة (-dF / DT) ('المنحنيات الفرق') نظر، نقل قضبان التطبيع لتطويق التحقيق تذوب المنطقة.
- حساب المجموعات
- بعد التطبيع، حدد "جماعات حساب" لتعيين تلقائيا العينات إلى مجموعات.
عينات إذا لزم الأمر،-تعيين إعادة يدويا إلى مجموعات محددة.
ملاحظة: بعض برامج التحليل له عتبات عالية الحساسية التي لا يمكن تغييرها. في هذه الحالات، لياليoftware قد تعيين عينات لمختلف الفئات التي تنتمي بصريا إلى آخر.
- بعد التطبيع، حدد "جماعات حساب" لتعيين تلقائيا العينات إلى مجموعات.
- تعيين الأنماط الجينية
- تعيين الأنماط الجينية لكل مجموعة على أساس المعايير (الضوابط الإيجابية).
- بعد يؤكد المستخدم أن الجماعات المحسوبة صحيحة (إذا لم يكن كذلك، بذلت أن التغييرات الصحيحة تحت علامة التبويب تجميع عن طريق اختيار عينات أساء تصنيف واختيار المجموعة المناسبة من القائمة المنسدلة مربع بجوار "نداء جديد")، حدد "تحرير أسماء المجموعة "تحت عنوان" التجمع "علامة التبويب.
- أدخل المورثات من المعايير في مربع ملون المقابلة (على سبيل المثال، إذا 3D7 القياسية لديه المعروف أن النمط الجيني وغير في المجموعة الحمراء، المجموعة الحمراء لديه التركيب الوراثي A). اضغط على "موافق" وانقاذ النتائج.
- تعيين الأنماط الجينية لكل مجموعة على أساس المعايير (الضوابط الإيجابية).
- تصدير النتائج
- يدعو تصدير الوراثي كجدول بيانات لمزيد من التحليل العينة.
- إزالة عينات سلبية
Representative Results
يمكن تصور البيانات في عدة طرق مختلفة، اعتمادا على برامج التحليل والصك. عادة، مؤامرة من مشتقات السلبية لمضان تطبيع مع الاحترام لدرجة حرارة (-dF / DT) ضد نتائج درجة الحرارة الأكثر مباشرة لتصور قمم ذوبان وتحديد الأنماط الجينية.
نافذة ذوبان كامل (40 ° C-80 ° C) سيؤدي في كلتا المنطقتين amplicon والتحقيق انصهار الشكل يظهر 1 مثال على قمم ذوبان طبيعية لكلا المنطقتين. وضع إطار التحليل لمجرد نتائج التحقيق المنطقة في تمايز واضح من قمم المقابلة لتعدد الأشكال محددة (الشكل 2).
ويظهر تحليل يستند التحقيق بشكل واضح وجود كل من الأليلات كما القمم الفردية مع درجات حرارة انصهار التي تتطابق قمم SNP متماثل (الشكل 3).
ويبين الشكل 4 أن progressi الحد vely درجة الحرارة الصلب خلال التضخيم (مآب) النتائج في التحيز لأليل متحولة (الذروة في الجانب الأيسر) (الشكل 4A)، مما أدى إلى زيادة الحساسية للأليل متحولة في عدد سكانها الأليلات مختلطة (الشكل 4B).
الشكل 1. التحقيق وamplicon ذوبان المناطق. التآمر مشتق السلبية لمضان تطبيع مع الاحترام لدرجة الحرارة على مستوى النتائج نافذة ذوبان في كل من المسبار (انخفاض درجة الحرارة) وقمم amplicon ذوبان التي يمكن تحليلها. (مقتبس من دانيلز وآخرون دوى: 10.1128 / AAC.05737-11) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
> 
الشكل 2. التحقيق قمم ذوبان. مباريات الكمال (عادة من النوع البري الأليلات) تؤدي إلى قمم انصهار أعلى (الأحمر)، في حين أن عدم التطابق SNP لها درجات حرارة منخفضة ذوبان (الرمادي). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. Polygenomic ذوبان القمم. عندما تكون موجودة في عينة كل من الأليلات، وتحليل HRM القائم على التحقيق يمثل كل من الأليلات كما المنحنيين الذروة (برتقالي) مع القمم التي تطابق العينات واحدة أليل (الأحمر والرمادي). (مقتبس من دانيلز وآخرون دوى: 10.1128 / AAC.05737-11) الرجاء انقر هنا لعرض أكبر الخامسersion من هذا الرقم.
الرقم 4. المسخ أليل التضخيم التحيز (مآب). A. خفض تدريجيا درجة حرارة التضخيم الصلب التحيز الذروة رد فعل ذوبان نحو ذروة المقابلة لمتحولة (انخفاض درجة الحرارة) أليل في عينة polygenomic أو polyallelic. النتائج B. مآب في حساسية HRM للكشف عن الأليلات طفيفة الحاضرة في أقل من 1٪ في عينات polygenomic أو polyallelic. (الجزء B مقتبس من دانيلز وآخرون دوى: 10.1128 / AAC.05737-11) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. مجموعة المتابعة ارتفاع القرار ردود فعل ذوبان التضخيم القائم على التحقيق.
| مكون | حجم في إعادةالعمل (96-جيدا لوحة والأنابيب الشعرية) | حجم في رد الفعل (384 جيدا لوحة) | التركيز النهائي |
| HRM ميكس ماجستير | 4-5 ميكرولتر | 2-2،5 ميكرولتر | 1 × |
| 10 × التمهيدي الزائد | 1 ميكرولتر | 0.5 ميكرولتر | 0.50 ميكرومتر |
| 10 × التمهيدي الأخرى | 1 ميكرولتر | 0.5μl | 0.1 ميكرومتر |
| 10X التحقيق | 1 ميكرولتر | 0.5 ميكرولتر | 0.40 ميكرومتر |
| المياه PCR الصف | 1-2 ميكرولتر | 0،5-1 ميكرولتر | |
| DNA قالب | 1 ميكرولتر | 0.5 ميكرولتر | 0،01-10 نانوغرام / ميكرولتر |
| 10 ميكرولتر | 5 ميكرولتر |
الجدول 2. القياسيهعالية الدقة الظروف ذوبان التضخيم د.
| درجة الحرارة | وقت | |
| عقد | 95 درجة مئوية | 120 ثانية |
| 45 دورات | 95 درجة مئوية | 30 ثانية |
| 68 ° C * | 30 ثانية | |
| 1 دورة | 95 درجة مئوية | 30 ثانية |
| +28 درجة مئوية | 30 ثانية |
* هذه هي درجة الحرارة التي تعتمد على amplicon
الجدول 3. شروط التضخيم لمتحولة التحيز أليل التضخيم.
| درجة الحرارة | وقت | دورات | معدل المنحدر | وضع الاستحواذ | وضع تحليل | |
| تفسد | 95 درجة مئوية | 30 ثانية | 1 | 20 | لا شيء لا شيء | |
| دورة | 95 درجة مئوية | 2 ثانية | 55 | 20 | لا شيء | الكمي |
| 56 ° C * | 15 ثانية | 20 | أعزب | |||
| ذوبان | 40 ° C | 0 ثانية | 0.3 | لا شيء | لا شيء | |
| 45 ° C * | 0 ثانية | المستمر | ذوبان | |||
| 90 ° C * | 0 ثانية |
* هذه هي درجة الحرارة التي تعتمد على amplicon وسيتم تخفيض عند تنفيذ مآب
Discussion
المستمر HRM خطوة تحليل ما بعد PCR. لذا، عينة وإعداد مقايسة مشابهة لبروتوكولات PCR القياسية، مع إدماج إضافية من صبغة الفلورسنت الإقحام استخدامها لتعقب الانتقال من المزدوج تقطعت بهم السبل على الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل خلال خطوة انصهار عالية الدقة. العامل الوحيد الأكثر أهمية لتحليل HRM الناجح هو منتج قوي PCR. تصميم الاختبار هو المفتاح، وتتوفر العديد من الأدوات الأمثل لتصميم HRM فحص تجاريا والانترنت 13. أطوال Amplicon من 80-150 أزواج قاعدة مع المرافق ~ 20 قاعدة الزوج منعت تحقيقات تركز على SNP أو تعدد الأشكال التي تهم عمل أفضل للتمييز تعدد الأشكال وكذلك النسخ المتنوعة من تعدد الأشكال متعددة داخل المنطقة التحقيق. تحقيقات يمكن أن يكون قد تم حظره باستخدام إما 3 'هل C3 أو الزوج عدم تطابق 2 قاعدة في نهاية 3'، التي تمنع التمديد خلال التضخيم. تحقيقات يمكن أن تكون مصممة لتتناسب مع حبلا قالب واتسون أو كريك. الاختياريعتمد على الاختبارات التجريبية لتحديد أي مسبار تصميم تنتج قمم ذوبان مقبولة. تستخدم الزائدة إلى الأمام أو عكس الاشعال لإنتاج واحد الذين تقطعت بهم السبل المنتج التضخيم التي anneals لتحقيقات المحظورة. إذا كان المسبار يحتوي على تسلسل حبلا إلى الأمام، ثم عكس يستخدم التمهيدي في الزائدة، وعادة في نسبة 1: 5، والعكس بالعكس للتحقيقات التي تطابق حبلا الاتجاه المعاكس.
وبالمثل، HRM يعمل بشكل أفضل مع المنتج كافية وقوية PCR. PCR تفاعل الأمثل يتطلب التدرج PCR والاغاروز المواد الهلامية أو تحليل Bioanalyzer لتحديد درجات الحرارة الصلب المثلى. ويمكن زيادة تركيز قالب باستخدام أساليب مثل ما قبل التضخيم، التضخيم المضاعفة متحيز لجميع الأهداف باستخدام تركيز منخفض التمهيدي وأرقام دورة لزيادة تركيز قالب 13.
سوى عدد قليل من الأدوات متوافقة مع مآب. الخصائص الحرارية للأنابيب الزجاج الشعيرات الدموية المستخدمة طن هذه الأنظمة تسهل هذه الطريقة. قطر الداخلية صغيرة من الشعيرات الدموية فضلا عن نقل الحرارة السريع من خلال الزجاج توفر التحكم في درجة الحرارة أكثر صرامة من معيار PCR بلستيكور، التي لديها أبطأ معدلات الانتقال بين دورات الصلب وتمسخ بسبب خصائص العزل الحراري من البلاستيك. مع هذا الأسلوب، والحساسيات الكشف يمكن تخفيض 2-5٪ إلى أقل من 1٪ من أليل متحولة في خليط من النوع البري وأليل متحولة 10.
HRM هو أداة السطحية وفعالة واقتصادية للSNP التنميط الجيني في مجموعة متنوعة من إعدادات وتطبيقات عديدة، من ترصد الأمراض المعدية إلى المسح الضوئي للمتغيرات جينية السرطان. العديد من الأدوات الأخرى، مثل نانو روش وأنظمة LightCycler (480 و 96) وكذلك منظمة التعاون الاقتصادي في الوقت الحقيقي عرض نظام PCR HRM بالإضافة إلى التضخيم القياسية، في الوقت الحقيقي، وظائف النسخ العدد. باستخدام آلات إنتاجية أعلى، وتكاليف HRM المتوازية ليهالصورة من 0.50 $ لكل فحص في أيدينا، بما في ذلك جميع المواد الكيميائية والمواد الاستهلاكية.
في سياق وصفها هنا، تطبيقات ميدانية تسمح المراقبة السكان في الوقت الحقيقي لتغيرات المرتبطة بجهود مكافحة الملاريا، بما في ذلك انخفاض التنوع السكاني، والكشف عن أنواع الطفيليات المستوردة، وظهور وانتشار تعدد الأشكال المرتبطة مع انخفاض حساسية العقاقير. تحسينات على طريقة العرض حساسية إضافية مفيدة للإبلاغ التقدم نحو التخلص من الملاريا والقضاء عليها.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
الكتاب أشكر مؤسسة بيل وميليندا غيتس لدعمها لتطوير التكنولوجيا والتدريب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LightScanner Master Mix | BioFire Defense | HRLS-ASY-0003 | |
| Light mineral oil | Sigma | M5904 | for BioFire Defense plate-based HRM systems |
| TE | Teknova | T0226 | |
| Te | Teknova | T0221 | TE buffer with reduced EDTA |
| PCR grade water | Teknova | W3330 | |
| Plasmodium falciparum standards | MR4 | MRA-151, 156, 205, 330 | MR4.org offers free genomic DNA |
| Light Scanner Primer Design Software | BioFire Defense | commercial sofware for HRM assay design | |
| LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix | Roche | 4909631001 | For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration |
| Bioanalyzer | Agilent | G2938A | Agilent 2100 bioanalyzer |
| LightCycler 2.0 | Roche | 3531414001 | Capillary-based system for MAAB |
| LightCycler Nano | Roche | 6407773001 | Strip tube-based HRM and amplification |
| LightCycler 96 | Roche | 5815916001 | Strip-tube and plate-based HRM and amplification |
| LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification |
| LightScanner-96 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0011 | plate-based HRM (96-well) |
| LightScanner-384 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0001 | plate-based HRM (96-well) |
| 96-well plates | Roche | 4729692001 | 96-well plates for HRM (LightCycler |
| 384-well plates | Roche | 4729749001 | 384-well plates for HRM (LightCycler) |
| 96-well plates | Bio-Rad | HSP-9665 | 96-well plates for HRM (LightScanner) |
| 384-well plates | Bio-Rad | HSP-3865 | 384-well plates for HRM (LightScanner) |
| LightCycler 8-Tube Strips (clear) | Roche | 6327672001 | strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano) |
| LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche | 4929292001 | capillaries for HRM |
| Optical plate seals | Roche | 4729757001 | other brands also work |
References
- World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).
- Hayton, K., Su, X. -Z. Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum. Current genetics. 54 (5), (2008).
- Neafsey, D. E., et al. Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence. Genome biology. 9 (12), R171 (2008).
- Volkman, S. K., et al. A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum. Nature. 39 (1), 113-119 (2007).
- Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).
- Manske, M., et al. Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing. Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).
- Auburn, S., et al. Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data. PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).
- Daniels, R., et al. A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking. Malaria Journal. 7, 223 (2008).
- Daniels, R., et al. Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal. PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).
- Daniels, R. R., et al. field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum. Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).
- Olbadia, N., et al. Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama. The Journal of infectious diseases. , (2014).
- Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis. Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).
- Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia. Malaria Journal. 13, 89 (2014).
