Summary
בעוד ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה מציע את היכולת להבחין בין פולימורפיזם של נוקלאוטיד הבודד באוכלוסייה הטרוגנית, הטיה ההגברה אלל מוטנטי יכולה להגדיל את יכולתה לזהות אללים נוכחים באחוזים נמוכים יחסית בתוך מדגם. פרוטוקול זה מתאר שיפורים המשפרים את הרגישות של ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה.
Abstract
למרות עשרות שנים של מאמצי מיגור, מלריה נשארה נטל עולמי. עניין מחודש אחרון בחיסול אזורי ומיגור הגלובלי כבר מלווה במידע גנומי עלה על מיני Plasmodium טפיל מלריה אחראים ל, כוללים מאפיינים של אוכלוסיות גיאוגרפיות כמו גם וריאציות הקשורים רגישות מופחתת לתרופות נגד מלריה.
וריאציה אחת משותפת גנטית, פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNPs), מציעה יעדים אטרקטיביים לgenotyping טפיל. סמנים אלה הם שימושיים לא רק למעקב אחר סמני עמידות לתרופות, אלא גם למעקב אחר אוכלוסיות טפילות באמצעות סמנים לא תחת סמים או לחצים סלקטיביים אחרים.
שיטות genotyping SNP מציעות את היכולת לעקוב אחר עמידות לתרופות, כמו גם לטביעות אצבעות טפילי פרט למעקב אוכלוסייה, במיוחד בתגובה למאמצי שליטת מלריה באזורים מתקרבים eliminatמעמד יון.
בעוד SNPs אינפורמטיבי זוהה כי הם אגנוסטי לטכנולוגיות genotyping ספציפיים, ניתוח ברזולוציה גבוהה נמס (HRM) מתאים במיוחד מחקרים מבוססי שדה. בהשוואה לשיטות ניאון בדיקה סטנדרטית מבוססות הדורשות SNPs הבודד בבדיקה שכותרתו יחידה ומציעים רגישות במקרה הטוב 10% כדי לזהות SNPs בדגימות המכילות גנומים מרובים (polygenomic), HRM מציע רגישות 2-5%. שינויים HRM, כגון בדיקות חסומות וריכוזי פריימר סימטריים כמו גם אופטימיזציה של טמפרטורות חישול הגברה להטיה כלפי PCR הגברה של אלל הקטין, להגביר עוד יותר את הרגישות של HRM. בעוד שיפור הרגישות תלוי בassay הספציפי, הגדלנו רגישויות זיהוי פחות מ 1% מאלל הקטין.
באזורים מתקרבים מיגור מלריה, גילוי המוקדם של מתעוררים או עמידות לתרופות מיובאות הוא חיוני ליחסי ציבורתגובת ompt. כמו כן, את היכולת לזהות זיהומי polygenomic ולהבדיל סוגים טפילים מיובאים ממאגרים מקומיים נסתרים יכולה להודיע תוכניות בקרה.
כתב יד זה מתאר שינויים טכנולוגית התכה ברזולוציה גבוהה המגבירים עוד יותר את הרגישות שלו לזהות זיהומי polygenomic בדגימות מטופל.
Introduction
למרות התעניינות מחודשת בשליטת מלריה ומיגור, מלריה נשארה נטל בעולם, עם כמעט מחצית מאוכלוסיית העולם של בסיכון לזיהום ויותר מ 550,000 מקרי מוות בשנה, ילדים במיוחד באפריקה שמדרום לסהרה 1.
תוכניות בקרה ומיגור החדשות אלה נתמכים על ידי הרנסנס הגנומי, עם מספר גדול של טפילי מלריה רצף וניתחו למוטציות הקשורות לרגישות מופחתת סמים, אלימות מוגברת, ולמאפייני אוכלוסייה 2,3. פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNPs) הוא בין וריאנטים הגנטיים הנפוצה ביותר שזוהו 4-7.
שיטות genotyping SNP ניידים מציעות באתר ומעקב אוכלוסייה בזמן אמת ומעקב 8. בנוסף לטביעת אצבע טפילים בודדים, "ברקוד המולקולרי 'משמש גם לזהות שינויים זמניים דרמטיים בתדירות אללכמו גם גודל שונות יעיל אוכלוסייה ומורכבות של זיהום 9.
בעוד זו קבוצה של SNPs אינפורמטיבי מותאמת בקלות לפלטפורמות genotyping רבות, ברזולוציה גבוהה נמסה (HRM) הניתוח מתאים במיוחד היטב לשדה מבוסס מחקרים, שבו פעולה וזיהוי של מוטציות רומן בעלויות נמוכות רגישות ופשוטה בהשוואה לרצף ואחר גישות הן אטרקטיביות בהגדרות משאבים לעניים.
HRM מתחיל עם תגובת פולימראז הסטנדרטי שרשרת (PCR) שמשלב צבע ניאון. ההודעה-PCR ניתוח המסת קובע את טמפרטורת התכת amplicon שיא; הבדל יחיד SNP בamplicon קצר יכול לגרום לטמפרטורת התכת שיא המשמעותית הבדלים (TM).
כמה חידודים לשיטה זו מציעים רזולוציה genotyping טוב יותר להבחין SNPs כולל בכיתה ד (AT) SNPs, ולזהות אללים מוטציה קלים בדגימות עם אללים מרובים הנוכחיים (polygזיהומי enomic). ראשית, מבחני לשלב בדיקות קצרות מרוכזות על אזור SNP בנוסף לקדימה הפוך פריימרים שנמצאים בריכוזים שונים. בדיקות אלה אינן חסומים מוגברים במהלך PCR, אבל להיקשר לגדיל מיוצר בעודף עקב ריכוזי פריימר סימטריים שלהגדיל את הייצור של מוצר הבדיקה התבנית. amplicons פעמיים תקועים הנפרד אלה בהיקף של הבדיקה קשורה לגדיל התבנית העודף הן ~ 20-30 נ"ב; שלהם ירדו באופן משמעותי בהשוואה לאורך כל amplicon העופרת (80-150 נ"ב) להבדלי Tm הרבה יותר גדולים הקשורים לבדיקת תבנית בסיס בודד או מרובה חוסר ההתאמה 10.
שנית, ההטיה אלל מוטנטי הגברה (MAAB) מורידה את טמפרטורת חישול התגובה להטיה כלפי תגובת אללים מוטציה הנוכחיות ביחסים נמוכים בזיהומי polygenomic. חישול בטמפרטורה מוגדרת בין Tms של התאמה מושלמת (wild-type) והבדיקה תואמת (מוטציה)ים. בטמפרטורה זו, מחייב אלל wild-type הוא יציב מספיק ההגברה שמתעכבת בהשוואה למקבילתה אי התאמה, ובכך הטיית ההגברה לאלל מוטנטי כאשר שניהם נמצאים במדגם יחיד 10.
עם חידודי HRM אלה, טכנולוגיה זו אפשרה מעקב של מקורות וזהות של טפילים הקשורים זיהומי מגיפה בדרום אמריקה 11 וזיהוי של מוטציות חדשות, בידול של SNPs מרובה ממוקם מייד ליד שני ברצף, ומוטציות קיימים בפחות מ 1 % מאללים בדגימות polygenomic 10.
רגישות מוגברת היא חשובה במיוחד באזורים מתקרבים מצב טרום-חיסול ואלו בסיכון לעמידות לתרופות מתעוררים. היכולת לזהות במהירות ובקלות טפילים מיובאים וSNPs קשורים ברגישות מופחתת באתר מודיעה מאמצי מעקב ותוכניות בקרה עלהיעילות של היישומים שלהם ונקודות חמות מזהה למאמצי מיגור מלריה וחיסול מוגברים. פרוטוקול זה מתאר שיטות לחסומות-בדיקה מבוססת וMAAB לרגישות genotyping HRM מוגבר.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה כולל כרכים וריכוזים ל96-גם צלחת, רצועות 8-צינור, ומערכות המבוססות על נימים (10 μl נפח תגובה); עם זאת, יכול גם להתבצע HRM במערכות המבוססת על צלחת 384 גם עם 5 μl נפח תגובה על ידי קנה מידה כל הכרכים בהתאם. מגוון של גילוי עבור רוב המערכות הוא 10 עמ 'לתבנית ה- DNA 10 ng.
1. הכינו תבניות
- להשיג דגימות Plasmodium falciparum ישירות מהדם שהתקבל מחולים שהשתתפו במחקרי שדה ואתר מאוחסן ככולו דם, תאי דם אדומים pelleted, או על נייר סינון.
הערה: דוגמאות יכולות להיות גם לגדול במבחנה מותאמת תרבות; כמה זני מעבדה סטנדרטיים לניתוח ניתן להזמין ממלרית המחקר ועיון מגיב מרכז משאבים (MR4, ניתן להשתמש בדוגמאות ישירות מתאי דם אדום pelleted או תרבות או מופקים מהדם כל, תאי דם אדומים, או נייר סינון. - ה- DNA שחולץ מנייר סינון או זנים מותאמים תרבות
הערה: HRM הוא רגיש לריכוז מלח; הבדלי ריכוז בשל שיטות חילוץ משתנים יכולים להשפיע באופן משמעותי לטמפרטורת היתוך. בעוד מאגרים סופיים ספציפיים אינם גורם משמעותי להצלחה, להשתמש חיץ סטנדרטי נפוץ elution או resuspension (כלומר, מים, 1x טה ['טה הנמוך' או 'חיץ ההשעיה DNA': 10 מ"מ טריס-Cl, 0.10 mM EDTA] או 1x TE [10 מ"מ טריס-Cl, 1 mM EDTA]) עבור כל הדגימות כדי למנוע עיקולים להמיס חריגים או בלתי עקביים.- הכן דילולים תבנית של 10 עמ -10 ng לμl בTe הסטנדרטי, TE, או מים לכל תגובת 10 μl.
- הגברה ישירה מתאי דם אדומים pelleted
- לקבוע parasitemia של תאי דם אדומים באמצעות מיקרוסקופ דק למרוח
הערה: שיטות לקביעת parasitemia של תאי דם אדומים נגועים זמינות מהמרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC): http: //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html - לדלל parasitemias מעל 0.5% 1: 400 בכיתת PCR מים, TE, או טה. להשתמש 3 μl לכל תגובת μl 5 10.
- לקבוע parasitemia של תאי דם אדומים באמצעות מיקרוסקופ דק למרוח
- בקרה
הערה: HRM יכול לשמש לסריקה גנטית כדי לזהות רצף גרסאות באוכלוסייה 12; עם זאת, genotyping מדויק דורש החקירה סטנדרטים להכיל SNP-מאומת רצף. בונה או מלריה פלסמיד מבודדת עם ניתן להשתמש גנוטיפים ידועים. עבור מרבית היישומים, 3D7 (MR4 MRA-151) משמש כביקורת wild-type. בשל שונות בין-הטווח, תמיד כוללים בקרות חיוביות ושליליות.- בקרות חיוביות: הכן 10 עמ '- 10 ng לדילולי 1 μl של פלסמיד או סטנדרטים עם גנוטיפים SNP-מאומת רצף.
- שליטה שלילית: מים כיתה השתמש PCR כביקורת לא-תבנית (NTC) לתגובות ההגברה.
- הכן תערובת תגובה
- שכבת שמן מינרלים (אופציונליים). הערה: מערכות HRM חלקם פלטפורמות היתוך עצמאיות ואין לי מכסה מחומם כדי למנוע עיבוי ואידוי מוצר בהגברה.
- להוסיף שמן מינרלי אור 20 μl לכל צלחת היטב לפני טעינת תערובת התגובה.
- הכן 10x מניות עבודה של כל מבחני
- עיין בטבלה 1 ל10x ריכוזים מומלצים לעבוד המניה, כמו גם ריכוזים סופיים לgenotyping HRM מבוסס חסומה-בדיקה.
- הכן תערובת תגובה
- לכל אחד גם בצלחת או צינור, להוסיף 1 μl 10x עובד המניה קדימה הפוך פריימרים ובדיקות, 4.0 - תערובת 5.0 μl 2.5x או 2.0x HRM ראשי, תבנית μl 1, ומים כיתה PCR עבור הסכום כולל נפח תגובה של 10 μl .
- אטמי או צינורות
- השתמש של צלחת אופטיתeals להגברה מבוסס צלחת, כובעים אופטיים למערכות רצועה-מבוססת שפופרת, וכובעי פלסטיק למערכות המבוססות על נימים. הכיסוי בטוח להיות שלם וצלחות וכובעים אטומות לחלוטין ומאובטחים כדי למנוע אידוי בהגברה.
- דגימות ספין
- צלחות ספין 3 דקות ב1,800 XG כדי להסיר בועות אוויר ולהפריד שלבי נפט ומימיים אם נעשה שימוש בשמן מינרלים.
- שכבת שמן מינרלים (אופציונליים). הערה: מערכות HRM חלקם פלטפורמות היתוך עצמאיות ואין לי מכסה מחומם כדי למנוע עיבוי ואידוי מוצר בהגברה.
- פרוטוקול הגברה
- הנח צלחות תגובה או צינורות בCycler תרמית. פרוטוקולים סטנדרטיים לרוץ הגברה החסומה-בדיקה או MAAB (לוחות 2 ו -3, בהתאמה). שים לב להבדלים בטמפרטורת חישול בין שיטות אלה.
ניתוח 3. HRM
- לְהַמִיס
- לאחר ההגברה PCR, להמשיך להמסת ניתוח. למערכות עצמאיות היתוך שאינו מובנים בהגברה (למשל., מערכות BioFire ביטחון LightScanner), מחדשלהעביר צלחת מוגברת מCycler תרמית והמקום במכשיר HRM. מממשק תוכנת מערכת, להמס את הצלחת 40-80 מעלות צלזיוס כדי לייצר שתי פסגות היתוך הבדיקה וamplicon.
הערה: כדי לחסוך זמן היתוך וניתוח, חלון ההיתוך יכול להתקצר כדי לכסות טווחי טמפרטורה רק לחקור או אזורי היתוך amplicon. לאחר התכה, יכולים להיות מחדש נמסו צלחות וצינורות במידת צורך ומאוחסן ב -20 ° C או 4 מעלות צלזיוס. צינורות זכוכית חנות רק ב 4 ° C כדי למנוע מצינורות פיצוח.
- לאחר ההגברה PCR, להמשיך להמסת ניתוח. למערכות עצמאיות היתוך שאינו מובנים בהגברה (למשל., מערכות BioFire ביטחון LightScanner), מחדשלהעביר צלחת מוגברת מCycler תרמית והמקום במכשיר HRM. מממשק תוכנת מערכת, להמס את הצלחת 40-80 מעלות צלזיוס כדי לייצר שתי פסגות היתוך הבדיקה וamplicon.
- ניתוח להמיס
- הסר דגימות שליליות
- בתוך תוכנת הניתוח, להסיר מדגימות ניתוח נוספות שלא להגביר או שיש לי פסגות משוננות היתוך. שים לב: לאחר בחירת המצב של ניתוח לקובץ הפעלה בודד, המכשיר באופן אוטומטי קבוצות דגימות החיוביות ושליליות. לפני genotyping כל תת-קבוצה, המשתמש יכול לשנות באופן ידני את השיחות.
- משני ההיתוךעקומה או שיא היתוך תצוגה, לחץ לחיצה ימנית על העקומות ליוסרה כדי לבחור אותם. לאחר בחירת הדגימות סווגו כהלכה, ללכת "ניו שיחה," בחר בקיבוץ המתאים, ולחץ על "החל שינוי."
- בתוך תוכנת הניתוח, להסיר מדגימות ניתוח נוספות שלא להגביר או שיש לי פסגות משוננות היתוך. שים לב: לאחר בחירת המצב של ניתוח לקובץ הפעלה בודד, המכשיר באופן אוטומטי קבוצות דגימות החיוביות ושליליות. לפני genotyping כל תת-קבוצה, המשתמש יכול לשנות באופן ידני את השיחות.
- לנרמל
- מנגזר השלילית של הקרינה מנורמלת ביחס לטמפרטורת תצוגה (-dF / DT) ("Curves הבדל"), להעביר את הברים נורמליזציה להקיף את הבדיקה להמס אזור.
הערה: הבדיקה להמס אזור הוא הטמפרטורה נמוכה יותר של אזורי שני ההיתוך. הברים הנורמליזציה צריכים להיות בבסיס של הפסגות להמיס.
- מנגזר השלילית של הקרינה מנורמלת ביחס לטמפרטורת תצוגה (-dF / DT) ("Curves הבדל"), להעביר את הברים נורמליזציה להקיף את הבדיקה להמס אזור.
- לחשב קבוצות
- לאחר נורמליזציה, להקצות קבוצות חישוב "בחרו באופן אוטומטי דגימות לקבוצות.
במידת צורך, מחדש להקצות באופן ידני דגימות לקבוצות ספציפיות.
הערה: יש תוכנת ניתוח חלק ספי רגישות גבוהות שלא ניתן לשנות; במקרים אלה, שלoftware עשוי להקצות דגימות לקבוצות שונות שויזואלית שייכת לאחר.
- לאחר נורמליזציה, להקצות קבוצות חישוב "בחרו באופן אוטומטי דגימות לקבוצות.
- הקצאת גנוטיפים
- הקצאת גנוטיפים לכל קבוצה המבוססת על סטנדרטים (בקרות חיוביות).
- לאחר שהמשתמש מאשר כי הקבוצות ממוחשבת נכונות (אם לא, כי שינויים נכונים נעשו תחת לשונית הקיבוץ על ידי בחירת דגימות סווגו כהלכה ובחירת הקבוצה הנכונה מתפריט התיבה ליד "ניו שיחה"), בחר באפשרות "שמות קבוצת עריכה "תחת" כרטיסיית הקיבוץ ".
- הזן את גנוטיפים של הסטנדרטים לתיבה בצבע המתאים (לדוגמא, אם יש 3d7 הסטנדרטי ידוע גנוטיפ והוא בקבוצה האדומה, הקבוצה האדומה יש גנוטיפ). לחץ על "אישור" ולשמור את התוצאות.
- הקצאת גנוטיפים לכל קבוצה המבוססת על סטנדרטים (בקרות חיוביות).
- תוצאות יצוא
- גנוטיפ היצוא קורא כגיליון אלקטרוני לניתוח אוכלוסיית מדגם נוסף.
- הסר דגימות שליליות
Representative Results
ניתן דמיינו נתונים במספר דרכים שונות, בהתאם לתוכנת הניתוח והמכשיר. בדרך כלל, עלילה של הנגזר השלילי של הקרינה מנורמלת ביחס לטמפרטורה (-dF / DT) נגד תוצאות טמפרטורה היא פשוטה ביותר המאפשר הדמיה פסגות היתוך וקביעת גנוטיפים.
חלון התכה מלא (40 ° C-80 ° C) יגרום לשני אזורי amplicon והתכת בדיקה. איור 1 מציג דוגמא של פסגות היתוך מנורמלות לשני האזורים. הגדרת חלון הניתוח רק את תוצאות בדיקה באזור בידול ברור של הפסגות המתאימות SNPs הספציפי (איור 2).
ניתוח מבוסס בדיקה מראה בבירור את נוכחותם של שני אללים כמו פסגות בודדות עם טמפרטורות התכה התואמות את הפסגות הומוזיגוטים SNP (איור 3).
איור 4 מראה progressi ש vely הפחתת טמפרטורת חישול בהגברת תוצאות (MAAB) בהטיה כלפי אלל מוטנטי (השיא בצד שמאל) (איור 4 א), וכתוצאה מכך הרגישות מוגברת לאלל מוטנטי באוכלוסייה של אללים מעורבים (איור 4).
1. אזורי איור בדיקה והתכת amplicon. שרטוט הנגזר השלילית של הקרינה המנורמלת ביחס לטמפרטורה מעל תוצאות חלון היתוך רחבות בשתי הבדיקה (הטמפרטורה נמוכה יותר) ופסגות היתוך amplicon שניתן לנתח. (מעובד מתוך דניאלס et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
> 
פסגות איור 2. בדיקה היתוך. התאמות מושלמת (בדרך כלל אללים wild-type) לגרום לפסגות גבוהות יותר התכה (אדום), בעוד שחוסר ההתאמה SNP טמפרטורות התכה נמוכות (אפורות). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Polygenomic נמס פסגות. כאשר שני אללים נמצאים במדגם, ניתוח HRM מבוסס בדיקה מייצג שני אללים כמו עקומות שני-שיא (כתום) עם פסגות התואמות את הדגימות בודדות אלל (אדום ואפור). (מעובד מתוך דניאלס et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) אנא לחץ כאן לצפייה בV גדול יותרersion של נתון זה.
איור 4. הטיה ההגברה אלל מוטנטי (MAAB). א בהדרגה הורדת טמפרטורת חישול ההגברה הטיות תגובת שיא ההיתוך לשיא מקביל לאלל מוטנטי (טמפרטורה נמוכה יותר) במדגם polygenomic או polyallelic. ב MAAB תוצאות ברגישות HRM כדי לזהות אללים קטין נוכחים בפחות מ -1% בדגימות polygenomic או polyallelic. (חלק ב 'מותאם מדניאלס et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הטבלה 1. סט-אפ של תגובות הגברה היתוך ברזולוציה גבוהה המבוסס על בדיקה.
| רְכִיב | נפח למחדשפעולה (96-גם צלחת וצינור נימים) | נפח לכל תגובה (384 גם צלחת) | ריכוז סופי |
| HRM מיקס מאסטר | 4-5 μl | 2-2.5 μl | 1 x |
| 10 x פריימר העודף | 1 μl | 0.5 μl | 0.50 מיקרומטר |
| 10 x פריימר אחר | 1 μl | 0.5μl | 0.1 מיקרומטר |
| 10x Probe | 1 μl | 0.5 μl | 0.40 מיקרומטר |
| מים בדרגת PCR | 1-2 μl | 0.5-1 μl | |
| תבנית ה- DNA | 1 μl | 0.5 μl | .01-10 Ng / μl |
| 10 μl | 5 μl |
טבלה 2. standarתנאי הגברה היתוך ד ברזולוציה גבוהה.
| טֶמפֶּרָטוּרָה | זְמַן | |
| לְהַחזִיק | 95 מעלות צלזיוס | 120 שניות |
| 45 מחזורים | 95 מעלות צלזיוס | 30 שניות |
| C ° 68 * | 30 שניות | |
| מחזור 1 | 95 מעלות צלזיוס | 30 שניות |
| 28 מעלות צלזיוס | 30 שניות |
* טמפרטורה זו היא amplicon תלוי
טבלה 3. תנאי הגברה להטית ההגברה אלל מוטנטי.
| טֶמפֶּרָטוּרָה | זְמַן | מחזורים | שיעור רמפה | מצב רכישה | מצב ניתוח | |
| לְפַגֵל | 95 מעלות צלזיוס | 30 שניות | 1 | 20 | אַף לֹא אֶחָד אַף לֹא אֶחָד | |
| מַחזוֹר | 95 מעלות צלזיוס | 2 שניות | 55 | 20 | אַף לֹא אֶחָד | קְבִיעַת כָּמוּת |
| C ° 56 * | 15 שניות | 20 | אֶחָד | |||
| לְהַמִיס | 40 מעלות צלזיוס | 0 שניות | 0.3 | אַף לֹא אֶחָד | אַף לֹא אֶחָד | |
| C ° 45 * | 0 שניות | רציף | לְהַמִיס | |||
| C ° 90 * | 0 שניות |
* טמפרטורה זו היא amplicon תלוי ותופחת בעת ביצוע MAAB
Discussion
רציף HRM הוא צעד ניתוח פוסט-PCR; לכן, לדוגמא והתקנת assay דומה לפרוטוקולים PCR סטנדרטיים, עם שילוב נוסף של צבע intercalating פלורסנט המשמש למעקב אחר המעבר לדנ"א חד-גדילים במהלך שלב ההתכה ברזולוציה הגבוהה פעמיים תקועים. הגורם החשוב ביותר לניתוח HRM מוצלח הוא מוצר PCR חזק. עיצוב assay הוא מפתח, וכמה כלים מותאמים לעיצוב assay HRM זמינים מסחרי והאינטרנט 13. אורכי amplicon של 80-150 זוגות בסיסים עם נלווה ~ 20 זוג בסיס חסום בדיקות מרוכזות על SNP או SNPs עבודת אינטרס להבדיל SNPs כמו גם haplotypes של SNPs מרובה באזור הבדיקה. ניתן לחסום בדיקות או באמצעות "spacer C3 או אי-התאמת 2 בסיס זוג ב3 '3 סוף, המונעת הרחבה בהגברה. יכולות להיות מתוכננות בדיקות כדי להתאים את גדיל התבנית ווטסון או קריק; הבחירהתלוי בבדיקות אמפיריות כדי לקבוע שבדיקת עיצוב מייצרת פסגות היתוך מקובלות. פריימרים עודפים קדימה או לאחור משמשים לייצור מוצר הגברה חד-גדילים שanneals לבדיקות החסומות. אם הבדיקה מכילה את רצף הגדיל קדימה, אז לאחור תחל משמש בעודף, בדרך כלל ביחס של 1: 5, ולהיפך לבדיקות התואמות את הגדיל ההפוך.
באופן דומה, HRM עובד הכי טוב עם מוצר ה- PCR מספיק וחזק. אופטימיזציה תגובת PCR דורשת ג'לי PCR וagarose שיפוע או ניתוח Bioanalyzer כדי לקבוע טמפרטורות חישול אופטימליות. ריכוז תבנית יכול להיות מוגבר באמצעות שיטות כגון מראש הגברה, הגברה מרובבת מוטה של כל המטרות באמצעות ריכוז פריימר נמוך ומספרי מחזור להגדיל את ריכוז תבנית 13.
רק קומץ של מכשירים תואמים MAAB. תכונות התרמיות של צינורות זכוכית נימים משמשות in מערכות אלה להקל בשיטה זו. הקוטר הקטן הפנים של הנימים כמו גם העברת החום המהירה דרך הזכוכית מציעה בקרת טמפרטורה מחמירה יותר מאשר plasticware PCR הסטנדרטי, שבו יש שיעורי מעבר איטיים בין מחזורי חישול וdenaturation בשל תכונות בידוד התרמית של הפלסטיק. בשיטה זו, ניתן להפחית רגישויות זיהוי בין 2-5% בפחות מ 1% מאלל מוטנטי בתערובת של wild-type ואללים מוטציה 10.
HRM הוא כלי קליל, יעיל, וחסכוני עבור genotyping SNP במגוון רחב של הגדרות ויישומים רבים, ממעקב מחלה מדבק לסריקה ולריאנטים גנטיים לסרטן. כמה מכשירים אחרים, כגון ננו רוש ומערכות LightCycler (480 ו -96), כמו גם את הצעת מערכת PCR HRM בזמן אמת אקו בנוסף להגברה סטנדרטית, בזמן אמת, ופונקציונליות עותק-מספר. באמצעות מכונות גבוהה יותר תפוקה, barcoding HRM עולה lesים מ $ 0.50 לכל assay בידיים שלנו, הכולל את כל חומרים כימיים וחומרים מתכלה.
בהקשר המתואר כאן, יישומים מבוססים-שדה לאפשר מעקב אוכלוסייה בזמן אמת לשינויים הקשורים למאמצי שליטת מלריה, כוללים מגוון מופחת אוכלוסייה, זיהוי של סוגים מיובאים טפילים, ואת המראה ואת ההתפשטות של SNPs קשור ברגישות תרופה מופחתת. חידודים לשיטה להציע רגישות נוספת שימושית עבור ליידע התקדמות לקראת חיסול מלריה ומיגור.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים ביל ומלינדה גייטס לתמיכתה של התפתחות טכנולוגיה והכשרה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LightScanner Master Mix | BioFire Defense | HRLS-ASY-0003 | |
| Light mineral oil | Sigma | M5904 | for BioFire Defense plate-based HRM systems |
| TE | Teknova | T0226 | |
| Te | Teknova | T0221 | TE buffer with reduced EDTA |
| PCR grade water | Teknova | W3330 | |
| Plasmodium falciparum standards | MR4 | MRA-151, 156, 205, 330 | MR4.org offers free genomic DNA |
| Light Scanner Primer Design Software | BioFire Defense | commercial sofware for HRM assay design | |
| LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix | Roche | 4909631001 | For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration |
| Bioanalyzer | Agilent | G2938A | Agilent 2100 bioanalyzer |
| LightCycler 2.0 | Roche | 3531414001 | Capillary-based system for MAAB |
| LightCycler Nano | Roche | 6407773001 | Strip tube-based HRM and amplification |
| LightCycler 96 | Roche | 5815916001 | Strip-tube and plate-based HRM and amplification |
| LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification |
| LightScanner-96 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0011 | plate-based HRM (96-well) |
| LightScanner-384 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0001 | plate-based HRM (96-well) |
| 96-well plates | Roche | 4729692001 | 96-well plates for HRM (LightCycler |
| 384-well plates | Roche | 4729749001 | 384-well plates for HRM (LightCycler) |
| 96-well plates | Bio-Rad | HSP-9665 | 96-well plates for HRM (LightScanner) |
| 384-well plates | Bio-Rad | HSP-3865 | 384-well plates for HRM (LightScanner) |
| LightCycler 8-Tube Strips (clear) | Roche | 6327672001 | strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano) |
| LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche | 4929292001 | capillaries for HRM |
| Optical plate seals | Roche | 4729757001 | other brands also work |
References
- World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).
- Hayton, K., Su, X. -Z. Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum. Current genetics. 54 (5), (2008).
- Neafsey, D. E., et al. Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence. Genome biology. 9 (12), R171 (2008).
- Volkman, S. K., et al. A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum. Nature. 39 (1), 113-119 (2007).
- Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).
- Manske, M., et al. Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing. Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).
- Auburn, S., et al. Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data. PLoS ONE. 7 (2), e32891 (2012).
- Daniels, R., et al. A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking. Malaria Journal. 7, 223 (2008).
- Daniels, R., et al. Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal. PLoS ONE. 8 (4), e60780 (2013).
- Daniels, R. R., et al. field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum. Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).
- Olbadia, N., et al. Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama. The Journal of infectious diseases. , (2014).
- Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis. Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).
- Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia. Malaria Journal. 13, 89 (2014).
