Summary
Während eine hohe Auflösung Schmelzanalyse bietet die Möglichkeit, zwischen den Single Nucleotide Polymorphismen in einer heterogenen Population zu unterscheiden, können mutante Allel amplification bias seine Fähigkeit, bei relativ niedrigen Prozentsätzen in einer Probe vorhandenen Allele detektieren erhöhen. Dieses Protokoll beschreibt Verbesserungen, die die Empfindlichkeit der hochauflösende Schmelzanalyse zu verbessern.
Abstract
Trotz jahrzehntelanger Bemühungen Tilgung bleibt Malaria eine globale Belastung. Neueste erneutes Interesse an regionalen Eliminierung und weltweiten Abschaffung durch erhöhte genomische Informationen über Parasit Plasmodium Arten von Malaria verantwortlich, darunter Merkmale der geographischen Populationen sowie Varianten mit reduzierter Empfindlichkeit gegenüber Anti-Malaria-Medikamenten assoziiert begleitet.
Eine häufige genetische Variation, Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), bietet attraktive Ziele für Parasiten Genotypisierung. Diese Marker sind nicht nur für die Verfolgung von Drogenresistenzmarker, sondern auch für die Verfolgung von Parasitenpopulationen mit Markern nicht unter Drogen oder andere Selektionsdruck.
SNP-Genotypisierung Methoden bieten die Möglichkeit, Resistenzen zu verfolgen als auch auf einzelne Parasiten für Bevölkerungsüberwachung Fingerabdruck, insbesondere als Reaktion auf die Bekämpfung von Malaria Bemühungen in Regionen kurz vor EliminatIonen-Status.
Während informative SNPs wurden identifiziert, agnostisch, spezifische Genotypisierung Technologien sind, ist hochauflösenden Schmelz (HRM) Analyse besonders geeignet zu Feld-basierte Studien. Im Vergleich zu Standard-Fluoreszenzsonde basierte Methoden, die einzelne SNPs in einem einzigen markierten Sonde erfordern und bieten im besten Fall 10% Sensitivität gegen SNPs in Proben, die mehrere Genome (polygenomic) enthalten, zu erkennen, bietet HRM 2-5% Sensitivität. Modifikationen HRM, wie blockierte Sonden und asymmetrische Primerkonzentrationen sowie die Optimierung der Amplifikation Glühtemperaturen vorzuspannen PCR zur Amplifikation der kleinere Allel, die Empfindlichkeit des HRM weiter zu erhöhen. Während die Empfindlichkeitsverbesserung hängt von den spezifischen Assay haben wir Detektionsempfindlichkeiten auf weniger als 1% der kleinere Allel erhöht.
In Regionen nähern Ausrottung der Malaria ist die frühzeitige Erkennung aufkommender oder importierte Arzneimittel-Resistenz wichtig für prOmpT Antwort. In ähnlicher Weise kann die Fähigkeit, polygenomic Infektionen zu erkennen und zu differenzieren Parasit Typen aus kryptischen lokalen Reservoirs Steuerprogramme zu informieren.
Dieses Manuskript beschreibt Änderungen an hochauflösende Schmelztechnologie, die die Empfindlichkeit weiter zu erhöhen, um polygenomic Infektionen in Patientenproben zu identifizieren.
Introduction
Trotz erneuten Interesse an Malaria Kontrolle und Tilgung bleibt Malaria eine weltweite Belastung, mit fast die Hälfte der Weltbevölkerung dem Risiko einer Infektion und mehr als 550.000 Todesfälle pro Jahr, vor allem Kinder in Afrika südlich der Sahara 1.
Diese neuen Bekämpfungs- und Tilgungsprogramme wurden von der genomischen Renaissance unterstützt wurde, mit einer großen Zahl von Malaria-Parasiten sequenziert und auf Mutationen mit reduzierter Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten assoziiert analysiert, erhöhte Virulenz und für Bevölkerungsmerkmale 2,3. Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) gehören zu den am häufigsten identifizierten genetischen Varianten 4-7.
Tragbare SNP-Genotypisierung Methoden bieten Vor-Ort-und Echtzeit-Bevölkerungsüberwachung und Tracking-8. Neben den Fingerabdrücken einzelnen Parasiten wird der 'molekularen Barcode "auch verwendet, um dramatische zeitliche Verschiebungen in Allelfrequenz erkennensowie Varianz effektive Populationsgröße und Komplexität der Infektion 9.
Während diese Reihe von informativen SNPs ist leicht zu vielen Genotypisierung Plattformen angepasst, hochauflösende Schmelz (HRM), um feldbasierte Studien, in denen empfindliche und einfache Bedienung und Detektion von neuen Mutationen zu geringen Kosten im Vergleich zur Sequenzierung und anderen besonders gut geeignet Analyse Ansätze sind attraktiv in einem ressourcenarmen Umfeld.
HRM beginnt mit Standard-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die einen Fluoreszenzfarbstoff enthält. Post-PCR-Schmelzanalyse bestimmt die Spitzen Amplikon Schmelztemperatur; eine einzige SNP Unterschied in einer kurzen Amplikon kann zu erheblichen Spitzenschmelztemperatur (Tm) Differenzen ergeben.
Mehrere Verfeinerungen dieser Methode bieten bessere Genotypisierung Entschließung SNPs einschließlich Klasse IV (AT) SNPs in Proben mit Mehrfach vorliegenden Allele zu unterscheiden und zu erkennen kleinere mutierten Allelen (PolyGenomic Infektionen). Zunächst werden die Assays nehmen kurze Sonden über den Bereich SNP zentriert zusätzlich zur Vorwärts- und Rückwärts-Primern, die in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegen. Diese blockierten Sonden werden nicht während der PCR amplifiziert, sondern auf die im Überschuss Strang binden aufgrund von asymmetrischen Primerkonzentrationen, welche die Produktion der Sonde-Schablonenprodukt erhöhen. Diese separaten Doppelstrang-Amplikons aus Sonde, um das überschüssige Matrizenstrang gebunden sind ~ 20-30 bp; ihrer Länge deutlich zurückgegangen im Vergleich zu den gesamten Amplikons (80-150 bp) führen zu wesentlich größeren Tm Differenzen mit einzelnen oder mehreren Basissonde-Vorlage zugeordnet Material stimmt nicht 10.
Zweitens Mutantenallel amplification bias (MAAB) senkt die Reaktions Glühtemperatur zum Vorspannen der Reaktion in Richtung auf niedrige Verhältnisse in polygenomic Infektionen vorliegenden mutierten Allelen. Die Glühtemperatur zwischen den Tms von perfekt aufeinander abgestimmt (Wildtyp) und übereinstimmende (Mutante) Sondensatzs. Bei dieser Temperatur wird die Bindung des Wildtyp-Allels ist stabil genug, dass die Amplifikation im Vergleich zu ihrer Fehlanpassung gleichwertig behindert, wodurch das Vorspannen des Verstärker Richtung des mutierten Allels, wenn beide in einer einzigen Probe 10 vorhanden sind.
Mit diesen HRM Ausgestaltungen ist diese Technologie Nachführung Ursprung und die Identität des Parasiten mit epidemischen Infektionen in Südamerika 11 und Erkennung von neuen Mutationen, Differenzierung mehrerer SNPs unmittelbar nebeneinander in der Reihenfolge, und Mutationen assoziiert sind, vorhanden in weniger als 1 erlaubt % der Allele in Proben polygenomic 10.
Erhöhte Empfindlichkeit ist besonders wichtig in Regionen nähern Pre-Elimination-Status und die an der Gefahr für die Schwellen Resistenzen. Die Fähigkeit, schnell und einfach zu identifizieren importiert Parasiten und SNPs mit reduzierter Empfindlichkeit vor Ort assoziiert informiert Überwachungsbemühungen und Steuerprogramme zudie Wirksamkeit ihrer Implementierungen und identifiziert Hotspots für erhöhte Malariabekämpfung und Beseitigung Bemühungen. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden für die blockierten-Sonde-basierte und MAAB für erhöhte HRM Genotypisierung Empfindlichkeit.
Protocol
Hinweis: Dieses Protokoll enthält Volumina und Konzentrationen für 96-Well-Platte, 8er Streifen und Kapillar-basierten Systemen (10 ul Reaktionsvolumen); jedoch HRM auch in 384-Well-Platte-basierten Systemen mit einer 5 & mgr; l Reaktionsvolumen durch eine Skalierung alle Volumes entsprechend durchgeführt werden. Der Erfassungsbereich für die meisten Systeme ist 10 pg bis 10 ng Template-DNA.
1. Bereiten Sie Vorlagen
- Erhalten Plasmodium falciparum Proben direkt aus dem Blut von Patienten, die an Feldstudien vor Ort erhalten und als Vollblut gespeichert, pelletiert roten Blutzellen oder auf Filterpapier.
Bemerkung: Die Proben können auch kultur geeignet ist, in vitro zu wachsen; einige Standard-Laborstämmen für die Analyse von der Malaria-Forschung und Reference Reagent Resource Center (MR4 bestellt werden, können die Proben direkt von pelletierten roten Blutkörperchen oder Kultur verwendet oder aus Vollblut, rote Blutzellen, oder Filterpapier extrahiert werden. - DNA extrahiert ausFilterpapier oder Kultur-adaptierten Stämme
Hinweis: HRM ist empfindlich gegenüber Salzkonzentration; Konzentrationsunterschiede durch variable Extraktionsmethoden kann erhebliche Auswirkungen auf Schmelztemperaturen. Während spezifische endgültigen Puffer nicht ein wesentlicher Faktor für den Erfolg, mit einem Standard-gemeinsame Elution oder Resuspensionspuffer (dh Wasser, 1x Te ['niedrigen Te "oder" DNA Suspensionspuffer': 10 mM Tris-Cl, 0,10 mM EDTA] oder 1x TE [10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA]) für alle Proben, um anomale oder inkonsistente Schmelzkurven zu vermeiden.- Bereiten Vorlage Verdünnungen von 10 pg -10 ng pro & mgr; l in Standard-Te, TE oder Wasser für jeweils 10 & mgr; l-Reaktion.
- Direkte Amplifikation aus pelletierten roten Blutkörperchen
- Bestimmen Sie Parasitämie von roten Blutzellen unter Verwendung von Dünnschicht-Schmiermikroskopie
Hinweis: Methoden zur Bestimmung der Parasitämie der infizierten roten Blutkörperchen sind von den Centers for Disease Control and Prevention (CDC) zur Verfügung: http: //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html - Verdünnen Sie Parasitämien über 0,5% 1: 400 in PCR-grade Wasser, TE oder Te. Verwenden Sie 3 ul für jede 5 bis 10 & mgr; l-Reaktion.
- Bestimmen Sie Parasitämie von roten Blutzellen unter Verwendung von Dünnschicht-Schmiermikroskopie
- Kontrollen
Hinweis: HRM können für die Gen-Scan zur Erkennung Sequenzvarianten in einer Population 12 ist; jedoch genaue Genotypisierung erfordert Standards sequenzüberprüft, um die SNP enthalten verhört. Plasmidkonstrukte oder Malaria-Isolaten mit bekannten Genotypen verwendet werden. Für die meisten Anwendungen wird 3D7 (MR4 MRA-151) als Wildtyp-Kontrolle verwendet. Wegen zwischen geführtes Variabilität immer auch positive und negative Kontrollen.- Positive Kontrollen: Bereiten Sie 10 pg - 10 ng pro 1 ul-Verdünnungen von Plasmid oder Standards mit sequenzprüft SNP-Genotypen.
- Negative Kontrolle: Verwenden PCR-Wasser als Kontrolle ohne Matrize (NTC) für die Amplifikationsreaktionen.
- Bereiten Reaktionsgemisch
- (Optional) Mineralöl-Overlay. Hinweis: Einige HRM-Systeme sind eigenständige Schmelz Plattformen und nicht über eine beheizte Deckel, um Kondensation und Verdampfungsprodukt während der Amplifikation zu verhindern.
- In 20 ul leichtem Mineralöl in jede Vertiefung Platte vor dem Laden des Reaktionsgemisches.
- Bereiten 10x Arbeitsvorräte aller Assays
- Siehe Tabelle 1 für die empfohlene 10x Arbeitsstamm Konzentrationen sowie Endkonzentrationen für blockierte-Sonde-basierte HRM Genotypisierung.
- Bereiten Reaktionsmischungen
- Zu jeder Vertiefung in der Platte oder ein Rohr, fügen 1 ul 10x Arbeitsstamm Vorwärts- und Rückwärts-Primer und Sonden, von 4,0 bis 5,0 & mgr; 2.5x oder 2.0x HRM Master-Mix, 1 ul Vorlage, und PCR-Wasser für eine Gesamtreaktionsvolumen von 10 & mgr; .
- Deckplatten oder Rohre
- Verwenden Sie optische Platte sAale für plattenbasierte Amplifikation Optokappen für streifenröhrenbasierten Systemen und Kunststoffabdeckungen für die Kapillar-basierten Systemen. Seien Sie sicher, Abdeckung ist komplett und Teller und Deckel sind vollständig versiegelt und gesichert, um Verdunstung während der Amplifikation zu verhindern.
- Spin Proben
- Schleuderplatten 3 min bei 1800 xg, um Luftblasen zu entfernen und abzutrennen Öl- und Wasserphasen, wenn Mineralöl verwendet.
- (Optional) Mineralöl-Overlay. Hinweis: Einige HRM-Systeme sind eigenständige Schmelz Plattformen und nicht über eine beheizte Deckel, um Kondensation und Verdampfungsprodukt während der Amplifikation zu verhindern.
- Amplifikationsprotokoll
- Zeigen Reaktionsplatten oder Rohre im Thermocycler. Führen Sie Standard-blockiert-Sonde oder MAAB Amplifikationsprotokolle (Tabellen 2 und 3, respectively). Man beachte den Unterschied in Glühtemperatur zwischen dieser Methoden.
3. HRM-Analyse
- Schmelze
- Nach der PCR-Amplifikation, fahren Sie mit Schmelzanalyse. Für Standalone-Schmelzanlagen, die nicht integrierte Verstärkung haben (z. B. BioFire Defense LightScanner Systeme), rebewegen verstärkten Platte von Thermocycler und in HRM Instrument. Von der System-Software-Schnittstelle, schmelzen die Platte 40 bis 80 ° C, beide Sonde und Amplikon Schmelzpeaks zu produzieren.
Hinweis: Um das Schmelzen und die Analysezeit zu sparen, kann der Schmelzfenster verkürzt, um Temperaturbereiche decken für nur Sonde oder Amplikon Schmelzregionen werden. Nach dem Schmelzen können die Platten und Röhren wieder eingeschmolzen werden, wenn notwendig, und bei -20 ° C oder 4 ° C gelagert. Shop Glasröhren nur bei 4 ° C in Röhrchen von Rissbildung zu verhindern.
- Nach der PCR-Amplifikation, fahren Sie mit Schmelzanalyse. Für Standalone-Schmelzanlagen, die nicht integrierte Verstärkung haben (z. B. BioFire Defense LightScanner Systeme), rebewegen verstärkten Platte von Thermocycler und in HRM Instrument. Von der System-Software-Schnittstelle, schmelzen die Platte 40 bis 80 ° C, beide Sonde und Amplikon Schmelzpeaks zu produzieren.
- Schmelzanalyse
- Entfernen Sie negative Proben
- Innerhalb der Analyse-Software, von der weiteren Analyse Proben, die nicht zu verstärken hat, oder dass weisen gezackte Schmelzpeaks zu entfernen. Hinweis: Nach der Auswahl des Analysemodus für einen einzelnen Durchlauf-Datei, das Gerät automatisch Gruppen die positiven und negativen Proben. Vor Genotypisierung jeder Teilsatz kann der Benutzer manuell die Anrufe zu ändern.
- Entweder aus dem SchmelzKurve oder Schmelzpeak Ansicht mit der rechten Maustaste auf den Kurven entfernt werden, um sie auszuwählen. Nach der Auswahl der Proben falsch klassifiziert, gehen Sie auf "Neuer Anruf", wählen Sie die entsprechende Gruppierung, und klicken Sie auf "Änderungen übernehmen".
- Innerhalb der Analyse-Software, von der weiteren Analyse Proben, die nicht zu verstärken hat, oder dass weisen gezackte Schmelzpeaks zu entfernen. Hinweis: Nach der Auswahl des Analysemodus für einen einzelnen Durchlauf-Datei, das Gerät automatisch Gruppen die positiven und negativen Proben. Vor Genotypisierung jeder Teilsatz kann der Benutzer manuell die Anrufe zu ändern.
- Normalisieren
- Von der negativen Ableitung des normalisierten Fluoreszenz bezüglich der Temperatur (-dF / dT) ("Difference Curves ') Ansicht fahren Normalisierung Bars, um die Sonde zu umgeben schmelzen Region.
Anmerkung: Die Sonde Schmelzbereich ist die niedrigere Temperatur der zwei Schmelzbereiche. Die Normalisierungsstäbe sollte an der Basis des Schmelzpeaks sein.
- Von der negativen Ableitung des normalisierten Fluoreszenz bezüglich der Temperatur (-dF / dT) ("Difference Curves ') Ansicht fahren Normalisierung Bars, um die Sonde zu umgeben schmelzen Region.
- Berechnen Gruppen
- Nach der Normalisierung, wählen Sie "Gruppen berechnen ', um automatisch Proben zu Gruppen zuweisen.
Falls erforderlich, manuell an bestimmte Gruppen neu zuweisen Proben.
Hinweis: Einige Analysesoftware hat eine hohe Empfindlichkeit Schwellenwerte, die nicht geändert werden können; in diesen Fällen wird die software könnten Proben zu verschiedenen Gruppen, die optisch zu einem anderen gehören, zuzuordnen.
- Nach der Normalisierung, wählen Sie "Gruppen berechnen ', um automatisch Proben zu Gruppen zuweisen.
- Weisen Sie Genotypen
- Weisen Sie Genotypen für jede Gruppe auf Basis von Standards (Positivkontrollen).
- Nachdem der Benutzer bestätigt, dass die berechneten Gruppen richtig sind (wenn nicht, dass die richtigen Änderungen wurden auf der Registerkarte Gruppierung indem Sie falsch klassifiziert Proben und die Auswahl der richtigen Gruppe aus dem Dropdown-Feld neben "Neuer Anruf" gemacht), wählen Sie "Gruppennamen ändern "unter der Registerkarte" Gruppieren ".
- Geben Sie die Genotypen der Normen in das entsprechende Farbfeld (zum Beispiel, wenn Standard-3D7 hat einen bekannten Genotyp und ist in der roten Gruppe hat der roten Gruppe Genotyp A). Drücken Sie "OK" und speichern Sie die Ergebnisse.
- Weisen Sie Genotypen für jede Gruppe auf Basis von Standards (Positivkontrollen).
- Export-Ergebnisse
- Export-Genotyp nennt als eine Tabellenkalkulation für die weitere Probenpopulation Analyse.
- Entfernen Sie negative Proben
Representative Results
Daten können auf verschiedene Weise sichtbar gemacht werden, abhängig von der Analyse-Software und Geräte. Typischerweise ist eine graphische Darstellung der negativen Ableitung der normalisierten Fluoreszenz bezüglich der Temperatur (-dF / dT) gegen die Temperatur ergibt einfachste zur Visualisierung Schmelzpeaks und Bestimmen Genotypen.
Ein vollständiges Schmelzen Fenster (40 ° C-80 ° C) wird in beiden Amplikon und Sondenschmelzbereichen führen. 1 zeigt ein Beispiel eines normierten Schmelzpeaks für die beiden Regionen. Einstellung des Analysefenster, um nur den Sondenbereich führt zu klaren Differenzierung von Peaks, die bestimmte SNPs (Abbildung 2).
Sondenbasierte Analyse zeigt deutlich die Anwesenheit beider Allele als Einzelpeaks bei Schmelztemperaturen, die homozygot SNP Peaks (Figur 3) entsprechen.
4 zeigt, dass progressidie Glühtemperatur während der Amplifikation (MAAB) Ergebnisse vely Verringerung in einer Ausrichtung auf das mutierte Allel (linksseitiger Peak) (4A), was zu einer erhöhten Empfindlichkeit des mutanten Allels in einer Population von gemischten Allele (4B).
Abbildung 1. Probe und Amplikon Schmelz Regionen. Die Auftragung der negativen Ableitung des normalisierten Fluoreszenz bezüglich der Temperatur über einen weiten Schmelz Fenster Ergebnisse sowohl Sonde (niedriger Temperatur) und Amplikon Schmelzpeaks, die analysiert werden können. (Angepasst von Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Sondenschmelzpeaks. Perfekt Spielen (in der Regel Wildtyp-Allele) führen zu höheren Schmelzpeaks (rot), während SNP Fehlanpassungen haben niedrigere Schmelztemperaturen (grau). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Polygenomic Schmelzpeaks. Wenn beide Allele in einer Probe vorhanden sind, sondenbasierten HRM-Analyse stellt beide Allele als Zwei-Peak-Kurven (orange) mit Gipfeln, die Single-Allel Proben (rot und grau) entsprechen. (Angepasst von Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) Bitte klicken Sie hier, um eine größere v ansehenersion dieser Figur.
Abbildung 4. Mutant Allel amplification bias (MAAB). A. Schrittweise Absenken der Verstärkung Glühtemperatur spannt die Schmelzpeak-Reaktion in Richtung Spitze entsprechend der Mutante (niedrigere Temperatur) Allels in einer polygenomic oder polyallelic Probe. B. MAAB führt HRM Empfindlichkeit bei weniger als 1% in polygenomic oder polyallelic Proben vorhanden kleinere Allele zu erkennen. (Teil B angepasst von Daniels et al DOI:. 10,1128 / AAC.05737-11) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1 Set-up der Sonde-basierte hochauflösende Schmelz Amplifikationsreaktionen.
| Komponente | Volumen pro reAktion (96-Lochplatte und ein Kapillarrohr) | Volumen pro Reaktion (384-Well-Platte) | Endkonzentration |
| HRM Master Mix | 4-5 & mgr; | 2-2,5 & mgr; | 1 x |
| 10 x Überschüssiger Primer | 1 & mgr; | 0,5 ul | 0,50 & mgr; M |
| 10 x Andere Primer | 1 & mgr; | 0,5 ul | 0,1 & mgr; M |
| 10x-Sonde | 1 & mgr; | 0,5 ul | 0,40 & mgr; M |
| PCR-grade Wasser | 1-2 & mgr; | 0,5-1 & mgr; | |
| Templat-DNA | 1 & mgr; | 0,5 ul | 0,01-10 ng / ul |
| 10 & mgr; | 5 & mgr; |
Tabelle 2. Standard hochauflösende Schmelz Amplifikationsbedingungen.
| Temperatur | Zeit | |
| Halten | 95 ° C | 120 sec |
| 45 Zyklen | 95 ° C | 30 sec |
| 68 ° C * | 30 sec | |
| 1 Zyklus | 95 ° C | 30 sec |
| 28 ° C | 30 sec |
* Diese Temperatur Amplikon-abhängige
Tabelle 3. Amplification Bedingungen für mutierte Allel amplification bias.
| Temperatur | Zeit | Fahrräder | Anstiegsgeschwindigkeit | Erfassungsmodus | Analysemodus | |
| Denaturieren | 95 ° C | 30 sec | 1 | 20 | Keine Keine | |
| Fahrrad fahren | 95 ° C | 2 sec | 55 | 20 | Keine | Quantifizierung |
| 56 ° C * | 15 sec | 20 | Single | |||
| Schmelze | 40 ° C | 0 sec | 0,3 | Keine | Keine | |
| 45 ° C * | 0 sec | Kontinuierliche | Schmelze | |||
| 90 ° C * | 0 sec |
* Diese Temperatur Amplikon abhängig und wird bei der Durchführung MAAB reduziert werden
Discussion
Kontinuierliche HRM ist eine Post-PCR-Analyseschritt; daher ist Proben- und Testaufbau ähnlich wie Standard-PCR-Protokollen, wobei der zusätzliche Einbau einer fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff verwendet, um den Übergang von der Spur doppelsträngigen zu einzelsträngigen DNA während der hochauflösenden Schmelzschritt. Der wichtigste Faktor für eine erfolgreiche HRM-Analyse ist eine robuste PCR-Produkt. Assay-Design ist der Schlüssel, und einige Werkzeuge für die HRM-Assay-Design optimiert sind im Handel und Online-13 zur Verfügung. Amplicon Längen von 80 bis 150 Basenpaaren mit begleitenden ~ 20 Basenpaar blockiert Sonden über den SNP oder SNP von Interesse funktionieren am besten zentriert um SNPs sowie Haplotypen von mehreren SNPs innerhalb der Sonde Region unterscheiden. Sonden können entweder unter Verwendung eines 3'-C3 Spacer oder eine 2-Basenpaar-Fehlpaarung am 3'-Ende, die Verlängerung während der Amplifikation zu verhindern, blockiert werden. Sonden entwickelt, um die Watson und Crick Matrizenstrang angepasst werden; die Wahlhängt von empirischen Tests, um festzustellen, welche Sondendesign akzeptablen Schmelzpeaks erzeugt. Überschüssige Vorwärts- oder Rückwärts-Primer werden verwendet, um einzelsträngige Amplifikationsprodukt, die den blockierten Sonden hybridisiert herzustellen. Wenn die Sonde die Vorwärtsstrangsequenz enthält, dann Reverse-Primer im Überschuß eingesetzt, typischerweise in einem 1: 5-Verhältnis, und umgekehrt für Sonden, die die Rückwärtsstrang entsprechen.
Ähnlich funktioniert HRM besten mit ausreichender und robuste PCR-Produkt. PCR-Reaktion Optimierung erfordert Gradienten PCR und Agarose-Gelen oder Bioanalyzer-Analyse, um eine optimale Annealing-Temperaturen zu bestimmen. Template-Konzentration kann mit Methoden wie Vorverstärkung, voreingenommen Multiplex-Amplifikation von allen Zielen mit niedrigem Primerkonzentration und Zyklenzahlen, um die Vorlage 13 zu erhöhen Konzentration erhöht werden.
Nur eine Handvoll Instrumente sind mit MAAB kompatibel. Die thermischen Eigenschaften der Glaskapillaren Röhren in Diese Systeme erleichtern dieses Verfahrens. Die kleine Innendurchmesser der Kapillaren sowie die schnelle Wärmeübertragung durch Glas bieten strengere Temperaturregelung als Standard-PCR-Kunststoffprodukte, die langsameren Übergangsraten zwischen Tempern und Denaturierung Zyklen aufgrund der thermischen Isolationseigenschaften der Kunststoffe hat. Mit dieser Methode Detektionsempfindlichkeiten kann von 2-5% auf weniger als 1% eines mutierten Allels in einer Mischung von Wildtyp und mutierten Allele 10 reduziert werden.
HRM ist eine einfache, effiziente und wirtschaftliche Werkzeug für die SNP-Genotypisierung in einer Vielzahl von Einstellungen und zahlreiche Anwendungen, von infektiösen Krankheitsüberwachung, um das Scannen für Krebs-Gen-Varianten. Mehrere andere Instrumente, wie die Roche LightCycler Nano und Systeme (480 und 96) sowie die Eco Real-time PCR-System bieten HRM zusätzlich zu den Standard-Amplifikation in Echtzeit, und die Kopienzahl-Funktionalität. Durch höhere Durchsatzmaschinen, kostet HRM Barcoding less als $ 0.50 pro Assay in unseren Händen, mit allen Reagenzien und Verbrauchsmaterialien.
In dem hier beschriebenen Zusammenhang Feld-basierten Anwendungen ermöglichen Echtzeit-Überwachung für die Bevölkerung ändert sich mit Malaria-Kontrolle Bemühungen, einschließlich reduzierten Bevölkerungsvielfalt, Erkennung von Parasit-Typen, und das Auftreten und die Ausbreitung von SNPs mit reduzierter Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten assoziiert. Verfeinerungen der Methode bieten zusätzliche Empfindlichkeit nützlich für die Unterrichtung Fortschritte Malaria Elimination und Tilgung.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Bill und Melinda Gates-Stiftung für die Unterstützung der Technologieentwicklung und Ausbildung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LightScanner Master Mix | BioFire Defense | HRLS-ASY-0003 | |
| Light mineral oil | Sigma | M5904 | for BioFire Defense plate-based HRM systems |
| TE | Teknova | T0226 | |
| Te | Teknova | T0221 | TE buffer with reduced EDTA |
| PCR grade water | Teknova | W3330 | |
| Plasmodium falciparum standards | MR4 | MRA-151, 156, 205, 330 | MR4.org offers free genomic DNA |
| Light Scanner Primer Design Software | BioFire Defense | commercial sofware for HRM assay design | |
| LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix | Roche | 4909631001 | For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration |
| Bioanalyzer | Agilent | G2938A | Agilent 2100 bioanalyzer |
| LightCycler 2.0 | Roche | 3531414001 | Capillary-based system for MAAB |
| LightCycler Nano | Roche | 6407773001 | Strip tube-based HRM and amplification |
| LightCycler 96 | Roche | 5815916001 | Strip-tube and plate-based HRM and amplification |
| LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification |
| LightScanner-96 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0011 | plate-based HRM (96-well) |
| LightScanner-384 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0001 | plate-based HRM (96-well) |
| 96-well plates | Roche | 4729692001 | 96-well plates for HRM (LightCycler |
| 384-well plates | Roche | 4729749001 | 384-well plates for HRM (LightCycler) |
| 96-well plates | Bio-Rad | HSP-9665 | 96-well plates for HRM (LightScanner) |
| 384-well plates | Bio-Rad | HSP-3865 | 384-well plates for HRM (LightScanner) |
| LightCycler 8-Tube Strips (clear) | Roche | 6327672001 | strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano) |
| LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche | 4929292001 | capillaries for HRM |
| Optical plate seals | Roche | 4729757001 | other brands also work |
References
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