Summary
Ce protocole décrit l'utilisation de bromodésoxyuridine (BrdU) absorption pour permettre le suivi temporel des cellules qui étaient en phase S à un moment précis dans le temps. Addition de colorants d'ADN et de l'étiquetage d'anticorps facilite l'analyse détaillée du sort des cellules en phase S au temps plus tard.
Introduction
L'évaluation des caractéristiques du cycle cellulaire et les changements qui se produisent dans les cellules au cours de la progression du cycle cellulaire est fondamentale pour comprendre de nombreux aspects de la biologie, en particulier la biologie du cancer. De nombreux agents de développement pour le traitement de tumeurs malignes ont des effets profonds sur la progression du cycle cellulaire ou induire la mort cellulaire par l'intermédiaire de mécanismes dépendants-du cycle cellulaire. Afin d'étudier la dynamique du cycle cellulaire ou des cellules dans une phase particulière du cycle cellulaire, il est usuel de synchroniser les cellules. Cependant, les méthodes de synchronisation peuvent avoir des effets néfastes sur les cellules étudiées, potentiellement confondant les résultats obtenus. 1 analyse Récemment, l'utilisation de protéines marquées par fluorescence qui ne sont présents à des phases particulières du cycle de cellules ont permis la progression du cycle cellulaire dans des cellules individuelles au fil du temps 2, cependant les cellules à étudier besoin d'être génétiquement manipulée pour exprimer ces protéines marquées, ce qui limite leur utilisation à des systèmes dans lesquels il peut être luily atteint.
Le cycle cellulaire est constitué de deux phases actives: la phase de synthèse (S), où l'ADN est répliqué et la mitose (M) où la division cellulaire a lieu. Ces phases sont séparées par trois phases de l'écart, G 0, G 1 et G 2. G 0 ou quiescence, est une phase de repos où la cellule a laissé le cycle, G 1 est où les cellules augmentent de taille avant replication de l'ADN et G 2 dans laquelle la croissance cellulaire continue entre l'achèvement de la replication de l'ADN, mais avant la division cellulaire. La progression à travers le cycle cellulaire est régulée par un certain nombre de points de contrôle. Le G 1 point de contrôle est activé lorsque les conditions environnementales ne sont pas favorables à la synthèse d'ADN et empêche l'entrée en phase S. La phase checkpoint ou de retard intra-S peuvent être déclenchées par des dommages de l'ADN qui peuvent entraîner des fourches de réplication bloquées. Pendant G 2 de la fidélité de l'ADN répliqué est confirmée et si le dommage est détecté, le G 2 3 L'activation de ces points de contrôle est communément utilisé pour synchroniser des populations cellulaires. points de contrôle du cycle cellulaire peuvent être activés par un certain nombre de facteurs, mais dans la biologie du cancer le plus commun est la détection des lésions de l'ADN. La réponse aux dommages de l'ADN est initiée par la PI3-kinase comme le télangiectasie kinases de l'ataxie et Rad3 liées (ATR) et protéine atm (ATM) qui activent les kinases effectrices aval Chk1 et Chk2, respectivement. 3 Une gamme d'événements active Chk1 y compris l'impasse fourches de réplication, réticulations d'ADN, et ultraviolet dégâts d'irradiation tout Chk2 est principalement activés par cassures double-brin.
La méthode habituelle pour étudier l'effet de conditions modifiées de la durée du cycle cellulaire is pour synchroniser les cellules dans une phase particulière du cycle cellulaire. 1 Ceci peut être réalisé par plusieurs procédés. Les cellules peuvent être physiquement séparés en fonction de la taille, la densité, la diffusion latérale (granularité), et des marqueurs d'expression de surface cellulaire. Plus concrètement, les cellules peuvent être synchronisées par des moyens chimiques. Plusieurs agents tels que la thymidine, l'hydroxyurée et la cytosine arabinoside peuvent être utilisés pour inhiber la synthèse d'ADN dans la phase S du cycle cellulaire résulte en une accumulation de cellules en phase S qui continuent après cyclage les agents sont enlevés. Les cellules traitées avec le nocodazole, ce qui empêche la formation du fuseau mitotique, avec un arrêt G 2 - phase M ou la teneur en ADN. Élimination de sérum à partir des résultats de milieu de culture dans l'accumulation de cellules en G 0 phase. Le rajout des éléments nutritifs dans le sérum de culture relance le vélo normal des cellules. Cependant, toutes ces méthodes de synchronisation normale interférer avec le vélo et la croissance des cellules et peut Result dans la mort cellulaire significative.
Synchronisation des cellules de leucémie lymphoblastique aiguë est particulièrement difficile et ces cellules ne se prêtent pas à la manipulation génétique. Le procédé décrit ici permet l'évaluation de la dynamique du cycle cellulaire et l'étude des cellules en phases particulières du cycle cellulaire sans synchronisation traditionnel ou une modification génétique. Cette méthode peut également être utile pour d'autres types lorsque la modification génétique et les procédures de synchronisation traditionnels ne sont pas facilement obtenus cellulaires. La méthode est basée sur l'utilisation de longue date de bromodésoxyuridine (BrdU) l'incorporation, qui a très peu d'impact sur la croissance à court terme et la prolifération des cellules. 4 protocoles de BrdU établis profitent de l'incorporation de BrdU dans l'ADN nouvellement synthétisé pendant la phase S . Ceci marque en permanence des cellules comme ayant été en phase S pendant l'exposition au BrdU. Cette population peut être identifié à des temps plus tard par coloration pour BrdU Incorporation et ainsi agir comme une population synchronisé qui peut être suivie et évaluée dans le temps permettant l'étude des effets des médicaments sur le transit du cycle cellulaire. BrdU besoin d'être exposée avant la coloration des anticorps, généralement obtenus après traitement à l'acide ou DNase. 6,7 En utilisant la cytométrie en flux pour détecter la BrdU incorporée permet l'inclusion de marqueurs supplémentaires. Le plus important est l'utilisation de colorants pour mesurer la teneur en ADN, ce qui permet l'évaluation de la distribution de phase du cycle cellulaire des cellules qui étaient en phase S au début de l'étude. 8 surface ou intracellulaires des antigènes outre supplémentaires peuvent également être étudiés. 9 Ces peuvent se rapporter à des événements du cycle cellulaire telles que Ki67 ou fonctions cellulaires à apparemment indépendants tels que des marqueurs de l'apoptose tels que la caspase-3 clivée. Les applications potentielles sont limitées par l'imagination de l'enquêteur.
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Protocol
Le protocole décrit ici utilise la lignée cellulaire lymphoblastique leucémie aiguë NALM6 mais peut être appliquée à d'autres types de cellules.
1. Les solutions et réactifs
- RPMI complet
- Ajouter 56 ml de sérum de veau foetal (FCS) et 5,5 ml de 200 mM de L-glutamine à une bouteille de milieu RPMI-1640 500 ml.
- BrdU Stock Solution
- Préparer 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS).
- BrdU complet RPMI
- Ajouter 6,2 ul de BrdU solution stock à 10 ml de RPMI complet.
- Solution de DNase
- Préparez 1 mg DNase / ml dans du DPBS.
- La coloration du tampon
- Préparer 3% de FCS inactivé par la chaleur et de l'azoture de sodium à 0,09% dans du DPBS.
- Reportez-vous à la liste de matériaux pour les définitions de Fixation Buffer, Perméabilisation tampon et le tampon de lavage.
2. Cellules
NonTe: Les cellules ont été cultivées pendant pas plus de 6 mois. Cette méthode est directement adaptable à toute lignée de cellules non-adhérentes avec des ajustements à la densité des cellules et des milieux de culture. Utiliser les cellules qui croissent de façon exponentielle au début de l'expérience.
- Maintenir cellules NALM6 en flacons T-75 de la culture dans RPMI complet. Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles en utilisant une classe II Cabinet prévention des risques biotechnologiques.
- Maintenir cellules NALM6 entre 1-2 x 10 6 cellules par ml en divisant la culture trois fois par semaine.
- Incuber à 37 ° C dans 5% de CO2 dans l'air.
3. Pulse marquage des cellules avec BrdU
ATTENTION: Manipulez BrdU avec précaution car il est un mutagène potentiel et tératogène.
- Centrifuger les cellules à 150 g pendant 5 min. Remarque: Transfert de cellules dans un milieu frais améliore la reproductibilité des résultats.
- Effectuer une numération cellulaire et remettre les cellules en RPMI complet à 2 x 10 6 cElls / ml.
- Diluer les cellules 1 à 2 avec du milieu RPMI complet BrdU production d'une concentration cellulaire finale de 1 x 10 6 cellules / ml.
- Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 45 minutes, puis diluer les cellules dans une 10 avec du milieu RPMI complet. Centrifuger les cellules à 150 g pendant 5 min et soigneusement jeter tout le surnageant.
- Resuspendre les cellules dans un petit volume (~ 100 ul) de RPMI complet, effectuer une numération des cellules et ajuster à 1 x 10 6 cellules / ml.
- Pipette 1 ml de cellules dans les puits d'une plaque de 48 puits. Pipette de 1 ml de DPBS dans tous les puits inoccupés pour obtenir des résultats plus reproductibles.
- Incuber à 37 ° C dans 5% de CO2 dans l'air pendant points temporels souhaités, ici 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, et 24 heures. Remarque: La longueur de temps dépendra de ce que la conception expérimentale vise à mesurer.
- Transférez toutes les cellules dans des tubes FACS aide d'une pipette. Rincez le bien séquentiellement avec 1 ml volumes de PBS à un volume total final de 5 ml.
- Centrifuger à 150 g pendant 5 min et retirez soigneusement tous les surnageant. Cellules sont prêtes pour la coloration, effectuer cette (section 4) immédiatement.
4. coloration des cellules
Remarque: si la coloration de surface des cellules est nécessaire exécuter avant la fixation, en veillant à ce que les cellules sont maintenues à 4 ° C tout au long.
- Resuspendre les cellules dans 100 ul de tampon de coloration (pour la coloration en surface en option, ajouter le volume recommandé de l'anticorps à des antigènes de surface et incuber pendant 30 min à 4 ° C).
- Ajouter 1 ml de tampon de coloration, centrifuger pendant 5 min à 150 xg et jeter le surnageant.
Nota: Les anticorps spécifiques, la concentration, le temps d'incubation, etc. variera en fonction des objectifs expérimentaux spécifiques. - Fixation et Perméabilisation
- Resuspendre les cellules dans 100 ul de tampon de fixation et incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter 1 ml otampon de lavage de f, centrifugeuse pendant 5 min à 150 xg et jeter le surnageant.
- Resuspendre les cellules dans 100 ul de tampon de perméabilisation et incuber les cellules pendant 10 min sur de la glace.
- Ajouter 1 ml de tampon de lavage, centrifuger pendant 5 min à 150 xg, et jeter le surnageant.
- Resuspendre les cellules dans 100 ul de tampon de fixation par tube et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
- Ajouter 1 ml de tampon de lavage, centrifuger pendant 5 min à 150 xg, et jeter le surnageant.
Remarque: Le protocole peut être mis en pause ici si nécessaire. Les cellules fixées sont stables pendant plusieurs jours à 4 ° C si on remet en suspension dans du tampon de coloration. Retirez le tampon de coloration après centrifugation avant de procéder.
- Traitement DNase
- Resuspendre les cellules dans 100 ul de solution de DNase (30 pg de DNase / 10 6 cellules) et incuber les cellules pendant 1 heure à 37 ° C.
- Ajouter 1 ml de tampon de lavage, centrifuger à 150 g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
- Anticorps Coloration
Note: La coloration de marqueurs intracellulaires autres que BrdU peut être réalisée simultanément avec la coloration de BrdU.- IMPORTANT: Préparer des témoins de compensation comprenant des cellules non colorées et les cellules marquées avec chaque fluorochrome unique. Idéalement, utilisez les mêmes anticorps pour les contrôles de rémunération que celles utilisées dans les tubes expérimentaux. Cependant, si cela est possible, des anticorps contre des antigènes de substitution hautement exprimés conjugués à la même fluorochrome.
- Remettre en suspension les cellules dans 50 ul de tampon de lavage et ajouter 1 pl / 10 6 cellules d'anticorps BrdU. Remarque: les anticorps directement conjugués à d'autres antigènes intracellulaires spécifiques peuvent également être ajoutés.
REMARQUE:. Les anticorps anti-histone H3 phosphorylée sur Ser10 peuvent être utilisées pour établir une discrimination entre les cellules dans G2 et M, l'histone H3 est phosphorylée sur Ser10 lors de la mitose 10 Les anticorps anti-cdc2 phosphorylés sur Tyr15 peut être utilisé pour détecter des cellules qui HAVe engagée à la mitose. 11 - Incuber les cellules pendant 20 min à température ambiante.
- Ajouter 1 ml de tampon de lavage, les cellules de centrifugation à 150 g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
- Stain ADN pour l'analyse du cycle cellulaire
- Desserrer pastille et ajouter 20 ul de la solution de 7-AAD (0,25 ug). Remarque: Il est essentiel d'utiliser une quantité constante de 7-AAD / cellule.
- Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de coloration.
5. Collecte de données de cytométrie en flux
Remarque: La machine requis dépendra du nombre et de la nature des fluorochromes utilisés.
- Recueillir les paramètres suivants: FSC-A, SSC-A, FSC-H (FSC-W peuvent être utilisés à la place de FSC-H) et 7-AAD fluorescence sur une échelle linéaire. Recueillir le canal APC sur une échelle logarithmique. Recueillir tous les canaux supplémentaires nécessaires pour l'évaluation de surface ou internes des étiquettes en utilisant une échelle logarithmique.
- Effectuer comcompensation de chevauchement des signaux dans les spectres d'émission observée entre les différents fluorochromes avant d'analyser les échantillons. Note: La plupart des cytomètres de flux effectueront automatiquement.
- Recueillir au moins 10 000 événements pour chaque échantillon.
6. Analyse de cytométrie en flux de données
Remarque: FlowJo a été utilisé dans cette étude pour cytométrie de flux de données, mais d'autres logiciels peuvent également être utilisés. La stratégie de déclenchement est illustré sur la figure 1.
- Identifier la population de cellules viables en utilisant les paramètres FSC-A et SSC-A.
- Dans cette population exclure doublets et d'agrégats à l'aide de FSC-A et FSC-H (FSC-W peut également être utilisée ici).
- Dans cette population définir un tracé de points en utilisant 7-AAD sur l'axe des x et BrdU-APC sur l'axe-y.
Figure 1: Stratégie Gating Gauche pa.nel: cellules non synchronisées sont présentés sur une FCS-A vs SSC-A dot plot. La population de cellules viables est identifié par la grille présentée. Panneau central: cellules bloquées à partir du panneau gauche sont indiqués sur une FSC-A vs FSC-H tracé de points (FSC-W peut être utilisé à la place de la hauteur). Doublets et les agrégats sont identifiés et exclus par la porte montré. Panneau de droite: cellules gated partir de la date de l'exclusion de doublet dans le panneau central sont présentés sur un 7-AAD vs APC-A dot plot. L'anticorps est marqué avec BrdU APC permettant l'identification des cellules qui ont incorporé la BrdU au cours de l'étiquetage d'impulsions. 7-AAD fournit des informations sur la teneur en ADN. La porte supérieure définit cellules positives pour BrdU et donc en phase S au moment de l'impulsion de BrdU, la porte en bas à gauche, les cellules en G 0/1 et la porte en bas à droite ceux de G 2 / M. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.- Cell Cycle A nalyse
- Ouvrez le premier fichier de données et porte sur les cellules dans la porte de l'exclusion de doublet.
- Analyser cette population pour la distribution du cycle cellulaire (situé sous les plates-formes de logiciels FloJo) et utiliser le modèle de Dean-Jett-Fox.
- Procurez-vous les positions du G 0/1 et G 2 / M pics en utilisant créer portes.
- Porte sur la BrdU des cellules positives et sous cette même population à l'analyse du cycle cellulaire.
- Fournir les positions pour le G 0/1 et G 2 / M pics en appliquant les mêmes portes de créer des portes et la mise contraintes (en utilisant les portails créés) pour les positions du G 0/1 et G 2 / M pics. Ceci est illustré dans les deux premiers panneaux de la figure 2.
Remarque: Autre logiciel peut également être utilisé pour analyser les données et les instructions varie en conséquence.
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Figure 2:. Progression du cycle cellulaire Le premier panneau (toutes les cellules) est fermée sur la population de cellules défini par la porte d'exclusion de doublet. Cette population a été affichée dans un histogramme avec 7-AAD sur l'axe-X. Le pic du pic G 0/1 est indiqué par la flèche en dessous de l'axe. Dans les panneaux ultérieures des cellules positives à la BrdU ont été fermée comme sur la figure 1. La valeur de la position de 0/1 G obtenue lorsque gating de la porte d'exclusion de doublet est appliquée aux cellules BrdU positives gated logiciel au sein du cycle cellulaire FlowJo. Chaque panneau a été fermée subséquent sur la population BrdU positives comme représenté sur la figure 1 et la position du pic G 0/1 sur la base de la valeur obtenue dans l'analyse de l'ensemble de la population comme indiqué dans les deux premiers panneaux. Utilisation de la fraction BrdU négatif pour identifier l'emplacement de la population G 0/1 pour les cellules positives à la BrdU dans la même sample contrôle des différences légères dans l'intensité de la tache d'ADN entre les échantillons. Le numéro indiqué sur chaque panneau représente le temps écoulé depuis l'impulsion BrdU terminé. Les phases du cycle cellulaire calculées sont indiquées en vert ombragé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Representative Results
Cette méthodologie peut être utilisée pour obtenir une série d'informations. Quelques applications sont décrites ici.
L'évaluation de la durée du cycle cellulaire
Pour déterminer le temps nécessaire pour les cellules de transit à travers le cycle cellulaire, les cellules sont récoltées à divers points de temps suivants l'impulsion de BrdU. Les intervalles entre les évaluations peuvent être adaptés à des cellules particulières en cours d'analyse. Des lignées de cellules hématopoïétiques ont été évalués toutes les heures sur une période de 24 heures en l'absence de tout traitement médicamenteux pour déterminer la longueur des phases du cycle cellulaire dans des conditions standard de culture. La figure 2 montre une sélection d'analyse de l'instantané de cellules NALM6 sur une période de 24 heures. Les cellules en phase S au moment de l'impulsion de BrdU (à l'intérieur de la porte positif BrdU dans la Figure 1) a progressé à travers G 2 / M, avec un pic de cellules dans cette phase du cycle cellulaire étant détectée 10 heures après la BrdU pUlse. La proportion de cellules BrdU marqués en phase S a atteint son nadir 14 h après l'impulsion et de presque toutes les cellules était retourné à G 1 après 17 h. En 24 heures une partie des cellules BrdU marqué avait réintégré la phase S dans le cadre de leur cycle de cellule suivante indiquant que les cellules peuvent compléter un cycle cellulaire dans les 24 heures, mais la plupart avaient pas encore entré dans une deuxième ronde de réplication, en accord avec le connu 36 hr temps de doublement de ces cellules.
la distribution du cycle cellulaire peut être encore affinée par l'inclusion de marqueurs supplémentaires. Par exemple, l'addition d'un anticorps contre l'histone H3 phosphorylée sur Ser10 (un marqueur des cellules en mitose) permet la discrimination des cellules en mitose de celles de G 2 (Figure 3 panneaux de gauche).
Figure 3: Confirmationde la phase de cycle cellulaire en utilisant des marqueurs supplémentaires. Les panneaux supérieurs montrent l'analyse du cycle cellulaire de cellules de la grille positives BrdU comme représenté sur la Figure 1. Les cellules ont été incubées en présence ou en l'absence de 3 nM vincristine pendant 18 heures après l'impulsion de BrdU . L'analyse du cycle cellulaire a été réalisée comme décrit dans la figure 2. Les panneaux inférieurs montrent les mêmes cellules sur 7-AAD contre Histone H3 phosphorylée sur des Ser10 tracé de points. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Évaluation des effets des médicaments sur le cycle cellulaire
Les agents cytotoxiques peuvent avoir des effets profonds sur les progrès du cycle cellulaire et peuvent induire la mort cellulaire. L'effet des médicaments sur la progression du cycle cellulaire peut être évaluée par adjonction des médicaments d'intérêt suivant l'impulsion de BrdU. Deux exemples sont présentés. La première est une situation dans laquelle l'induction of mort cellulaire confondu l'analyse des données du cycle cellulaire (panneaux de droite de la figure 3). NALM6 cellules avaient été exposés à 3 nM vincristine pendant 18 heures après l'impulsion de BrdU. Les cellules ont été attendus pour arrêter dans la mitose en tant que cibles de vincristine microtubules. Cependant, l'analyse du cycle cellulaire a suggéré que les cellules avaient pas arrêté, mais transité par 0/1 à G (Figure 3 du panneau supérieur droit). L'addition d'un anticorps contre l'histone H3 phosphorylée sur Ser10 a montré que les cellules avaient pas quitté la mitose (figure 3 du panneau inférieur droit), en dépit d'une teneur en ADN réduite. Il est probable que le contenu en ADN a été diminuée parce que les cellules subissaient une apoptose et avaient commencé à se dégrader leur ADN. Puisque les cellules initiées apoptose tandis que dans la mitose (ie avec 4N ADN), ils apparaissent comme la phase S ou G 0/1 cellules au lieu de la typique apoptotique sous-G 1 pointe.
Figure 4:. Détection de la phase du cycle cellulaire spécifique Tuer Les tracés de points indiquent le pourcentage de cellules positives BrdU restantes dans la culture de 24 heures après l'impulsion de BrdU. Les cellules ont été cultivées en présence ou en l'absence de véhicule seul (témoin), 1,5 uM ou 16 RAD001 depuis la fin de l'impulsion de BrdU. Le panneau inférieur montre le pourcentage de cellules qui étaient BrdU positive sur l'incubation de 24 heures. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Dans un autre exemple, la figure 4 montre comment, en présence d'une faible concentration de RAD001 (un inhibiteur de mTOR) cellules ont pu terminer le cycle cellulaire, mais a ensuite subi un retard ou une arrestation en G 0/1. Une concentration plus élevée de cellules de tra RAD001 en grande partie empêchénsiting grâce à G 0/1. Surtout cellules en phase S (c.-à-BrdU positif) ont été présentés à disparaître préférentiellement de la culture a été ajouté lorsque RAD001. Ceci suggère que les cellules passent par G 2 / M étaient plus sensibles à la mort cellulaire par cette agence. 12
Il est également possible d'examiner les réponses des cellules dans les phases particulières du cycle cellulaire en utilisant des anticorps contre des antigènes spécifiques. Sur la figure 5 l'activation du point de contrôle du cycle cellulaire et le contrôle de protéines Chk1 Chk2 en réponse à un traitement par la vincristine est représenté. Chk1 et Chk2 sont activées par phosphorylation sur Ser345 et Thr68 respectivement. L'activation de Chk1 et Chk2 peut être vu dans les cellules qui semblent avoir une teneur en ADN de 2N mais comme le montre la Figure 5 sont susceptibles d'être des cellules en mitose qui ont commencé dégradation de l'ADN en raison de l'apoptose.
Il est possible d'ajouter des médicaments à différents points dans le temps après leimpulsion de BrdU à examiner l'effet de l'agent sur les cellules à divers stades du cycle cellulaire.
Figure 5:. Détection des modifications dans les cellules phases du cycle cellulaire particulier Le panneau supérieur montre des cellules gated sur les cellules positives BrdU comme dans la figure 1 en 7-AAD vs phosphorylée Chk1 (à gauche) ou Chk2 (à droite) Les tracés de points. Les cellules avaient été la culture pendant 18 heures suivant l'impulsion de BrdU dans la présence ou l'absence de 3 nM vincristine que pour la figure 3. Les panneaux inférieurs montrent des histogrammes superposition des mêmes cellules gated soit sur la fraction de 2N ou 4N comme indiqué. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La capacité d'analyse du cycle cellulaire est importante pour la compréhension de la biologie du cancer et le mécanisme d'action de ces deux médicaments et les gènes qui influencent la prolifération cellulaire et la croissance. Bien qu'il existe une multitude de dosages qui mesurent la prolifération cellulaire aurait, dont la majorité ne fournissent une mesure qui indique les cellules numériques présents. Ceux-ci comprennent des dosages qui mesurent le nombre de cellules par visualisation directe et le dépouillement, l'activité métabolique ou de la concentration de l'ATP. Le principal avantage d'un grand nombre de ces procédés est qu'ils sont relativement faciles à réaliser et se prêtent à des formats de microplaques et l'automatisation, ce qui les rend utiles pour le criblage de grands nombres de composés ou de conditions. Une lacune de plusieurs de ces méthodes est que la perte de cellules due à la mort ne sont pas pris en considération, pouvant conduire à une sous-estimation de la prolifération cellulaire. Ces méthodes mesurent la population en vrac et ne permettent pas l'étude des cellules isolées ou le transit de cellules parle cycle cellulaire.
Des tests de prolifération couramment utilisés, peut-être la plus fiable et précis sont ceux qui mesurent la synthèse d'ADN. Essais classiques de prolifération de cellules incuber les cellules pendant quelques heures à une nuit avec de la 3H-thymidine, qui est incorporé dans l'ADN nouvellement synthétisé. 13 Le problème évident de cette méthode est l'utilisation de matières radioactives, mais un autre limitation est que les mesures de résultat la moyenne la prolifération d'une population de cellules. BrdU peut être utilisé de la même sans les problèmes de rayonnement, même si des mesures supplémentaires sont nécessaires et BrdU est un mutagène potentiel. Cependant, BrdU a l'avantage d'être compatible avec la cytométrie de flux, permettant l'analyse de cellules uniques. 14 Autres cytométrie en flux méthodes compatibles pour évaluer la prolifération cellulaire au niveau de la cellule unique inclure un nombre croissant de colorants qui étiquettent la membrane cellulaire ou des protéines cellulaires ( par exemple CFSE) qui divisent entre daughtcellules er, colorants intercalants de l'ADN et cycle cellulaire détection de l'antigène spécifique par des anticorps. Le meilleur de colorants d'étiquetage cellulaire permettent cellule de suivi de division sur un certain nombre de divisions cellulaires. 15 Ils fournissent une mesure directe de la prolifération, même si aucune information à propos de l'étape du cycle cellulaire ou de la distribution est obtenue. La mesure de la teneur en ADN en utilisant des colorants intercalants d'ADN, tels que l'iodure de propidium ou 7-AAD fournir la distribution du cycle cellulaire 16 solide, mais pas temporel, données. Même avec l'évaluation de multiples points de temps il reste impossible de déterminer la longueur du cycle cellulaire ou des phases spécifiques du cycle cellulaire. des antigènes spécifiques du cycle cellulaire peuvent être utilisés pour évaluer la phase du cycle cellulaire dans une population de cellules non synchronisées. Des antigènes spécifiques du cycle cellulaire couramment utilisés comprennent le Ki-67, 17 qui est exprimé au cours des S, G et M 2 phases du cycle cellulaire, mais pas pendant 0/1 G, PCNA (antigène nucléaire de prolifération cellulaire) 18, et la phosphorylation de hiStone H3. 19 Bien que ces fournir de bonnes données sur le stade du cycle cellulaire, des informations relatives dynamique du cycle cellulaire qui manque.
L'obtention de données sur la dynamique du cycle cellulaire a traditionnellement été examiné par la synchronisation de cellules en utilisant des agents ou des conditions de culture qui bloquent la progression du cycle cellulaire. Cela provoque une accumulation de cellules derrière le bloc, qui une fois retiré, entraîner onde de cellules progressent en même temps à travers le cycle cellulaire. 1 Le calcul de la durée du cycle cellulaire et de la durée des différentes phases du cycle cellulaire est alors possible. Les cellules peuvent être amenés à quitter le cycle cellulaire actif entrant G 0 par la privation de sérum. Après la ré-addition de sérum, les cellules peuvent alors se déplacent ensemble dans les phases ultérieures. 20 Bien que ce soit une méthode fiable pour certains types de cellules, d'autres, y compris de nombreux types de cellules transformées, ne parviennent pas à sortir du cycle cellulaire et subissent fréquemment la mort cellulaire comme un résultat. 21 En effet, notre stumatrices trouvé ceci pour être la situation pour les cellules de la leucémie lymphoblastique aiguë. En outre, les cellules ne parviennent pas à rentrer souvent cycle cellulaire d'une manière suffisamment synchronisé. Les procédés chimiques peuvent être utilisés pour induire l'arrêt du cycle cellulaire à des phases spécifiques du cycle cellulaire. Par exemple, les agents qui empêchent la synthèse d'ADN (par exemple un excès de thymidine) ou empêchent la formation du fuseau mitotique (par exemple le nocodazole) des cellules d'arrêt en S et M phases respectivement, mais sont toxiques et peuvent entraîner des troubles de la croissance et même la mort dans une proportion significative de la cellules. 22 dans toutes les cellules de ces méthodes ont échoué à arrêter la majorité des cellules sans tuer une fraction significative. Considérant que le but était d'évaluer les effets d'un agent anti-leucémique potentiel sur les paramètres du cycle cellulaire, la mort cellulaire résultant de synchronisation est inacceptable. En dépit de la description d'un grand nombre de méthodes pour synchroniser les cellules, ont tous défauts. Les principaux problèmes sont les suivants: une insuffisanteenrichissement de cellules dans la partie souhaitée du cycle cellulaire, des troubles de la physiologie normale du cycle cellulaire ou, comme on l'observe, la toxicité excessive.
La méthode décrite ici est une simple extension du système d'impulsion utilisée depuis longtemps, où les cellules sont incubées pendant une brève période avec BrdU pour identifier les cellules en phase S. Nous avons trouvé une impulsion de 45 min pour être optimal dans notre système, mais des périodes plus courtes peuvent être utilisées si un étiquetage adéquat est obtenu. En continuant à cellules en culture après l'enlèvement de la BrdU il est possible de suivre leur progression à travers le reste de la phase S, G 2, mitose, G 1 et l'entrée dans le cycle cellulaire suivant. Il peut être possible de suivre les cellules plus loin. L'avantage de ce système est qu'il n'y a aucune preuve de toxicité pour les cellules dans le laps de temps de ces expériences et il ya une perturbation minimale de la croissance des cellules, comme seul un couple de changements de médias sont obligatoires. Les cellules sont par ailleurs maintenus en continuous culture. La cytométrie en flux de la nature méthode basée signifie qu'il peut être combiné avec l'identification de sous-populations de cellules par surface supplémentaire ou coloration intracellulaire. Nous avons utilisé APC anticorps BrdU conjugué mais d'autres conjugués peuvent être substitués à faciliter le développement de panneaux d'anticorps. Nous avons utilisé 7-AAD plutôt que de l'iodure de propidium parce 7-AAD fluorescent dans un seul canal en maximisant les options pour la coloration multicolore. De même DAPI ou Hoechst peuvent être utilisés comme les taches d'ADN, mais nécessitent un laser UV. CV strictes pour coloration de l'ADN peuvent être obtenus en utilisant la fixation de l'éthanol, mais ce qui compromet souvent la coloration des anticorps, ce qui limite les options pour surface supplémentaire ou des taches cytoplasmiques. Le plus grand inconvénient est que S phase dure environ 8 heures, de sorte cellules marquées peuvent viennent d'entrer sur le point de quitter ou de phase S au cours de la période d'impulsion. En conséquence, la synchronisation ne sont pas aussi serrée que certains autres systèmes. Cependant, en combinant le marquage BrdU avec des colorants indiquant ADNle contenu et les anticorps à des protéines dépendantes du cycle cellulaire spécifiques, des données solides peuvent être obtenues.
Afin d'obtenir des données cohérentes il est important de veiller à ce que les cellules sont à la concentration correcte et que la concentration cellulaire est constante dans toutes les conditions étant comparés. Critique de la luminosité de la coloration 7-AAD est très sensible à la concentration des cellules. L'utilisation d'un système de comptage de cellules automatisé peut aider à assurer que les concentrations cellulaires sont compatibles dans tous les échantillons à chaque étape du processus. Un autre point important est la longueur de temps les cellules sont exposées à BrdU. De petites variations peuvent se traduisent en différences considérables, il est donc important que tous les échantillons sont incubés avec BrdU pour exactement le même temps. Enfin, il est important de titrer les anticorps pour obtenir une coloration optimale et ce doit être répété chaque fois qu'un lot est modifiée. Si toutes les étapes sont suivies de manière cohérente et des concentrations de cellules maintenues constantes, alors ce méthod va permettre de façon fiable le suivi des cellules à travers le cycle cellulaire sans la nécessité d'une synchronisation. Il ya aussi des possibilités considérables de modifier cette méthode en fonction des types de cellules et de répondre à des questions spécifiques.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150 cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200 µl | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1 ml | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
References
- Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Harper, J. W., Elledge, S. J. The DNA damage response: ten years after. Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).
- Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218, 474-475 (1982).
- Carayon, P., Bord, A. Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA. Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).
- Gonchoroff, N. J., et al. S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment. Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).
- Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells. Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).
- Hendzel, M. J., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106, 348-360 (1997).
- Draetta, G., Beach, D. Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement. Cell. 54, 17-26 (1988).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. , (2012).
- Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester. Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).
- Beck, H. P. Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine. Cytometry. 2, 170-174 (1981).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells. Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).
- Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67. Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).
- Danova, M., et al. Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors. Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).
- Juan, G., et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry. 32, 71-77 (1998).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).
- Kues, W. A., et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).
- Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization. Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).
