Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van broomdeoxyuridine (BrdU) om de tijdelijke opname volgen van cellen die op een bepaald tijdstip waren in de S-fase mogelijk. Toevoeging van DNA kleurstoffen en antilichamen etikettering bevordert gedetailleerde analyse van het lot van de S-fase cellen op latere tijdstippen.
Introduction
De beoordeling van de celcyclus eigenschappen en veranderingen die optreden in cellen tijdens de celcyclus is essentieel voor het begrijpen van vele aspecten van de biologie, in het bijzonder kanker biologie. Vele middelen in ontwikkeling voor de behandeling van maligne aandoeningen ingrijpende effecten op celcyclusprogressie en celdood induceren via celcyclus afhankelijke mechanismen. Om celcyclus dynamics of cellen te bestuderen in een bepaalde fase van de celcyclus, is het gebruikelijk om cellen te synchroniseren. Echter synchronisatiemethode kunnen nadelige effecten hebben op de cellen bestudeerd, potentieel verwarrende resultaten verkregen. 1 Onlangs het gebruik van fluorescent gelabelde eiwitten die alleen aanwezig op bepaalde stadia van de cyclus cellen hebben het mogelijk analyse van de celcyclus in individuele cellen in de tijd 2, maar de cellen te bestuderen moeten genetisch worden gemanipuleerd om deze gemerkte eiwitten tot expressie, beperkt het gebruik ervan tot systemen waarop dit kan worden gelezenily bereikt.
De celcyclus bestaat uit twee actieve fasen: de synthese (S) fase, waarin DNA wordt gerepliceerd en mitose (M), waar de celdeling plaatsvindt. De fasen worden gescheiden door drie spleet fasen G 0, G 1 en G2. G 0 of rust, een rustfase waarin de cel cyclus heeft verlaten, G 1 is waar de cellen in omvang toenemen voorafgaand aan DNA-replicatie en G 2 waarbij celgroei verder tussen de voltooiing van DNA-replicatie maar vóór de celdeling. Het doorlopen van de celcyclus wordt geregeld door een aantal checkpoints. De G 1 checkpoint wordt geactiveerd wanneer milieu-omstandigheden zijn niet ondersteunend van DNA-synthese en voorkomt toegang tot de S-fase. Het intra-S-fase checkpoint of vertraging kan worden veroorzaakt door DNA-schade die kan leiden tot stilstand gekomen replicatie vorken. Tijdens G 2 de trouw van de gerepliceerde DNA wordt bevestigd en als er schade dan wordt gedetecteerd de G 2 3 Activering van deze controleposten wordt vaak gebruikt om celpopulaties te synchroniseren. Celcyclus kan worden geactiveerd door een aantal factoren, maar in kankerbiologie de meest voorkomende is detectie van DNA schade. De DNA schade respons wordt geïnitieerd door de PI3-kinase-kinases ataxia telangiectasia en Rad3 verwante (ATR) en ataxia telangiectasia gemuteerd (ATM) de stroomafwaartse effector kinases Chk1 en Chk2 activeren resp. 3 een reeks gebeurtenissen activeert Chk1 inclusief stilstand replicatievorken, DNA verknopingen en ultraviolette straling beschadiging tijdens Chk2 wordt hoofdzakelijk geactiveerd door dubbelstrengige breuken.
De gebruikelijke methode voor het bestuderen van het effect van veranderde condities op de lengte van de celcyclus is om de cellen te synchroniseren in een bepaalde fase van de celcyclus. 1 Dit kan via verscheidene werkwijzen. Cellen kunnen fysisch gescheiden worden op basis van grootte, densiteit, zijwaartse verstrooiing (korreligheid) en expressie aan het celoppervlak markers. Meer praktisch kunnen cellen worden gesynchroniseerd door chemische middelen. Diverse middelen zoals thymidine, hydroxyurea en cytosinearabinoside kan worden gebruikt om DNA-synthese te remmen in de S-fase van de celcyclus resulteert in een accumulatie van cellen in de S fase die cycling voortgezet nadat de middelen worden verwijderd. Cellen behandeld met nocodazole, die de vorming van de mitotische spoel, aanhouding wordt gevormd met een G 2 - of M-fase DNA gehalte. Verwijdering van serum uit het kweekmedium resulteert in de accumulatie van cellen bij G 0 fase. De hernieuwde toevoeging van nutriënten in de kweek serum opnieuw start de normale cyclus van de cellen. Echter, al deze synchronisatiemethode hindert tijdens fietsen en de groei van cellen en kan Result in significante celdood.
Synchronisatie van acute lymfatische leukemie cellen is bijzonder uitdagend en deze cellen zijn niet vatbaar voor genetische manipulatie. De hier beschreven methode laat de beoordeling van de celcyclus dynamiek en het onderzoek van cellen in bepaalde fasen van de celcyclus zonder de traditionele synchronisatie of genetische modificatie. Deze werkwijze kan ook nuttig zijn voor andere celtypen indien de genetische modificatie en traditionele synchronisatieprocedures zijn niet gemakkelijk verwezenlijkt. De methode is gebaseerd op de reeds lang bestaande gebruik van broomdeoxyuridine (BrdU) integratie, die zeer weinig invloed op de groei op korte termijn en de proliferatie van cellen heeft. 4 Opgericht BrdU protocollen profiteren van de incorporatie van BrdU in nieuw gesynthetiseerde DNA tijdens de S-fase . Dit markeert permanent cellen bij blootstelling BrdU in de S-fase te zijn geweest. Deze populatie kan op latere tijdstippen worden geïdentificeerd door kleuring BrdU incorporatie en daarmee fungeren als een gesynchroniseerde bevolking die kunnen worden gevolgd en beoordeeld in de tijd het toelaat de studie van de effecten van geneesmiddelen op de celcyclus transit. BrdU blootgesteld dient te worden vóór antilichaamkleuring, gewoonlijk bereikt na DNase of zuurbehandeling. 6,7 behulp van flow cytometrie op te sporen opgenomen BrdU maakt de opneming van bijkomende markers. Het belangrijkste is de toepassing van kleurstoffen om DNA gehalte te meten, waardoor de beoordeling van de celcyclus faseverdeling van de cellen die aan het begin van het onderzoek waren in de S-fase. 8 bovendien extra oppervlak of intracellulaire antigenen kunnen ook worden bestudeerd. 9 Die kunnen betrekking hebben op celcyclus gebeurtenissen zoals Ki67 of schijnbaar niets cel functies zoals apoptose markers zoals gesplitst caspase-3. De toepassingsmogelijkheden worden beperkt door de verbeelding van de onderzoeker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hier beschreven protocol gebruikt de acute lymfoblastische leukemie cellijn NALM6 maar kan worden toegepast op andere celtypen.
1. Oplossingen en reagentia
- Compleet RPMI
- Voeg 56 ml foetaal kalfsserum (FCS) en 5,5 ml van 200 mM L-glutamine om een fles van 500 ml RPMI-1640-medium.
- BrdU voorraadoplossing
- Bereid 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) in Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS).
- BrdU complete RPMI
- Voeg 6,2 ul van BrdU voorraad oplossing voor 10 ml compleet RPMI.
- DNase Solution
- Bereid 1 mg DNase / ml in DPBS.
- Kleuring Buffer
- Bereid 3% door warmte geïnactiveerd FCS en 0,09% natriumazide in DPBS.
- Raadpleeg Materials List voor definities van Fixatie Buffer, Permeabilisatie Buffer en Wash Buffer.
2. Cellen
Neete: Cellen werden gekweekt gedurende niet meer dan 6 maanden. Deze methode is rechtstreeks aanpasbaar aan elke niet-hechtende cellijn met aanpassingen die celdichtheid en cultuurmedia. Met cellen die exponentieel groeien in het begin van het experiment.
- Handhaaf NALM6 cellen in T-75 kolven in complete RPMI. Voer alle stappen onder steriele omstandigheden met behulp van een klasse II bioveiligheid kabinet.
- Handhaaf NALM6 cellen tussen 1-2 x 10 6 cellen per ml door het splitsen van de cultuur driemaal per week.
- Incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 in lucht.
3. Pulse Labeling van cellen met BrdU
LET OP: Behandel BrdU met zorg want het is een potentiële mutagene stof en teratogeen.
- Centrifugeer cellen bij 150 g gedurende 5 min. Opmerking: Overdracht cellen in vers medium verbetert de reproduceerbaarheid van de resultaten.
- Voer een celgetal en resuspendeer cellen in complete RPMI bij 2 x 10 6 cells / ml.
- Verdun 1 cellen in 2 met BrdU complete RPMI produceren van een uiteindelijke celconcentratie van 1 x 10 6 cellen / ml.
- Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 45 minuten, verdun 1 cellen in 10 met complete RPMI. Centrifugeer cellen bij 150 g gedurende 5 min en gooi zorgvuldig alle supernatant.
- Resuspendeer cellen in een klein volume (~ 100 ul) volledig RPMI, voert een celtelling en aanpassen aan 1 x 10 6 cellen / ml.
- Pipetteer 1 ml van cellen in de putjes van een 48 putjesplaat. Pipetteer 1 ml van DPBS in een onbezette putten meer reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
- Incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 in lucht gedurende de gewenste tijdstippen, hier 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23 en 24 uur. Opmerking: De tijdsduur zal afhangen van wat proefopzet wil meten.
- Breng alle cellen in FACS buisjes met een pipet. Spoel het goed achtereenvolgens met 1 ml Volumes PBS tot een totaal eindvolume van 5 ml.
- Centrifugeer bij 150 xg gedurende 5 minuten en verwijder alle supernatant. De cellen zijn klaar voor vlekken, deze (deel 4) onmiddellijk uit te voeren.
4. cel kleuring
Opmerking: Wanneer vlak kleuring van cellen noodzakelijk onderhoud verrichten vóór fixatie, zodat de cellen worden bewaard bij 4 ° C gedurende.
- Resuspendeer cellen in 100 pl buffer kleuring (voor optionele oppervlakte kleuring, voeg de aanbevolen hoeveelheid antilichaam tegen antigenen oppervlak en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C).
- Voeg 1 ml vlekken buffer, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 150 x g en de bovenstaande vloeistof.
Opmerking: specifieke antilichamen, concentratie, incubatietijd enz varieert afhankelijk van de specifieke experimentele doelen. - Fixatie en Permeabilisatie
- Resuspendeer cellen in 100 gl fixatie buffer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Voeg 1 ml of wasbuffer, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 150 x g en de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer cellen in 100 gl permeabilisatie buffer en incubeer de cellen gedurende 10 min op ijs.
- Voeg 1 ml wasbuffer, centrifugeer 5 min bij 150 xg, de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer cellen in 100 gl fixatie buffer per buis en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Voeg 1 ml wasbuffer, centrifugeer 5 min bij 150 xg, de bovenstaande vloeistof.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken, indien nodig. De gefixeerde cellen zijn stabiel gedurende verscheidene dagen bij 4 ° C indien geresuspendeerd in kleurbuffer. Verwijder de vlekken buffer volgende centrifugeren voordat u verder gaat.
- DNase behandeling
- Resuspendeer cellen in 100 ul DNase-oplossing (30 ug DNase / 10 6 cellen) cellen en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Voeg 1 ml wasbuffer, centrifugeer bij 150 xg gedurende 5 min en gooi supernatant.
- Antilichaamkleuring
Opmerking: Kleuring anders dan BrdU intracellulaire merkers simultaan worden uitgevoerd met BrdU kleuring.- BELANGRIJK: Bereid compensatie controles bestaande uit ongekleurde en cellen gelabeld met elke afzonderlijke fluorochroom. Gebruik bij voorkeur dezelfde antilichamen compensatie controles als die welke in het experimentele tubes. Indien dit niet mogelijk, vervanging antilichamen tegen sterk tot expressie gebrachte antigenen geconjugeerd met hetzelfde fluorochroom.
- Resuspendeer de cellen in 50 ui wasbuffer en voeg 1 pl / 10 6 cellen van BrdU antilichaam. Opmerking: Direct geconjugeerde antilichamen tegen andere specifieke intracellulaire antigenen kunnen ook worden toegevoegd.
NB. Antilichamen tegen histon H3 gefosforyleerd op SER10 kan worden gebruikt om te discrimineren tussen cellen in G2 en M, histon H3 is gefosforyleerd op SER10 tijdens mitose 10 Antilichamen tegen cdc2 gefosforyleerd op Tyr15 kan worden gebruikt om cellen te detecteren have vastbesloten om mitose. 11 - Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Voeg 1 ml wasbuffer, centrifuge cellen bij 150 g gedurende 5 min en gooi supernatant.
- Stain DNA voor celcyclusanalyse
- Maak pellet en voeg 20 ul van de 7-AAD-oplossing (0,25 ug). Opmerking: Het is belangrijk om een constante hoeveelheid 7-AAD / cel gebruiken.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml buffer kleuring.
5. Het verzamelen van flowcytometrie gegevens
Opmerking: De machine vereiste afhangen van het aantal en de aard van de gebruikte fluorochromen.
- Verzamel de volgende parameters: A FSC-SSC-A, FSC-H (FSC-W kan worden gebruikt in plaats van FSC-H) en 7-AAD fluorescentie op een lineaire schaal. Verzamel de APC-kanaal op een log schaal. Verzamel alle extra kanalen die nodig zijn voor de beoordeling van de ondergrond of interne labels met een log schaal.
- Voer comcompensatie van overlappende signalen in emissie spectra waargenomen tussen verschillende fluorochromen vóór de analyse van de monsters. Opmerking: De meeste flowcytometers zal deze automatisch uit te voeren.
- Verzamel minstens 10.000 events voor elk monster.
6. Analyse van de flowcytometrie gegevens
Opmerking: FlowJo werd gebruikt in deze studie flowcytometrie gegevensanalyse maar andere softwarepakketten kunnen gebruikt worden. De gating strategie is geïllustreerd in figuur 1.
- Identificeer de levensvatbare celpopulatie met FSC-A en SSC-A parameters.
- Binnen deze populatie uit te sluiten wambuizen en aggregaten met FSC-A en FSC-H (FSC-W kan ook hier worden gebruikt).
- Binnen deze populatie set een puntenplot behulp 7-AAD op de x-as en BrdU-APC op de y-as.
Figuur 1: Gating Strategy Links pa.nel: ungated cellen worden getoond op een FCS-A vs. SSC-A dot plot. De levensvatbare celpopulatie wordt geïdentificeerd door de getoonde poort. Center panel: cellen gated uit het linker paneel worden weergegeven op een FSC-A versus FSC-H dot plot (FSC-W kan worden gebruikt in plaats van de hoogte). Wambuizen en aggregaten worden geïdentificeerd en uitgesloten door de getoonde poort. Rechter paneel: cellen gated van het doublet datum uitsluiting in het middenpaneel worden weergegeven op een 7-AAD vs. APC-A dot plot. De BrdU antilichaam wordt gelabeld met APC voor identificatie van cellen die BrdU hebben opgenomen tijdens de puls labeling. 7-AAD geeft informatie over DNA-inhoud. De bovenste poort definieert cellen positief voor BrdU en dus in S-fase op het moment van de BrdU puls, de linker poort, cellen in G 0/1 en de lagere juiste poort die in de G2 / M. Klik hier om te bekijken grotere versie van deze figuur.- Celcyclus A NALYSE
- Open het eerste gegevensbestand en hek aan de cellen in het doublet uitsluiting gate.
- Analyseer deze populatie voor de celcyclus distributie (onder platforms in FloJo software) en het gebruik van de decaan-Jett-Fox model.
- Verkrijgen van de posities van de G 0/1 en G 2 / M pieken gebruik maken gates.
- Poort aan de BrdU positieve cellen en onder deze populatie aan dezelfde celcyclusanalyse.
- Bepaalt de precieze positie van de G 0/1 en G 2 / M pieken volgens dezelfde gates van aanmaken gates en die beperkingen (de geschapen gates) van de posities van de G 0/1 en G 2 / M pieken. Dit wordt geïllustreerd in de eerste panelen 2 van figuur 2.
Opmerking: andere software kan ook worden gebruikt om de gegevens te analyseren en de instructies zouden dienovereenkomstig.
840 / 52840fig2highres.jpg "width =" 700 "/>
Figuur 2:. Celcyclusprogressie Het eerste paneel (alle cellen) is afgesloten op de celpopulatie bepaald door het doublet uitsluiting gate. Deze populatie werd weergegeven in een histogram met 7-AAD op de X-as. De piek van de G 0/1 piek aangegeven door de pijl onder de as. In daaropvolgende panels BrdU-positieve cellen werden afgesloten als figuur 1. De waarde voor de G 0/1 positie verkregen wanneer het poorten van het doublet uitsluiting gate wordt toegevoerd aan het BrdU positieve gated cellen in FlowJo celcyclus software. Elke volgende panel werd afgesloten op BrdU positieve populatie zoals getoond in figuur 1 en de positie van de G 0/1 piek op basis van de verkregen bij het analyseren van de gehele populatie zoals in de eerste twee panelen waarde. De BrdU negatieve fractie om de locatie van de G 0/1 populatie te identificeren voor BrdU positieve cellen in dezelfde sample bedieningsorganen voor een geringe verschuiving van de intensiteit van de DNA vlek tussen de monsters. Het nummer dat op elk paneel nummer de sinds de BrdU pulse beëindigd. De berekende celcyclus fasen worden weergegeven in schaduwrijke groen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methodologie kan worden gebruikt om verschillende informatie te verkrijgen. Enkele toepassingen zijn hier geschetst.
Beoordeling van de duur van de celcyclus
Om de tijd die nodig is voor de cellen om doorvoer door de celcyclus te bepalen, worden de cellen geoogst op verschillende tijdstippen na de BrdU pulse. De intervallen tussen evaluaties kan worden aangepast aan de specifieke cellen geanalyseerd. Hematopoietische cellijnen werden beoordeeld elk uur gedurende een 24 uurs periode in de afwezigheid van behandeling met geneesmiddelen om de lengte van de celcyclus fasen onder standaard kweekomstandigheden te bepalen. Figuur 2 toont een selectie van snapshot analyse van NALM6 cellen gedurende een 24 uurs periode. De cellen in de S-fase ten tijde van de BrdU puls (binnen een BrdU positieve poort in figuur 1) doorliep G2 / M, met een piek van cellen in die fase van de celcyclus wordt gedetecteerd 10 uur na de BrdU pulse. De hoeveelheid BrdU gelabelde cellen in de S-fase bereikte een dieptepunt 14 uur na de puls en bijna alle cellen waren na 17 uur teruggekeerd naar G 1. Door 24 uur een deel van de BrdU gelabelde cellen S-fase was opnieuw ingevoerd als onderdeel van hun volgende celcyclus aangeeft dat de cellen van een cel cyclus kan voltooien binnen 24 uur, maar de meeste waren nog niet een tweede ronde van replicatie, in overeenstemming met de bekende 36 ingevoerd hr verdubbelingstijd van deze cellen.
Celcyclusverdeling kan verder worden verfijnd door het opnemen van additionele markers. Bijvoorbeeld, de toevoeging van een antilichaam tegen gefosforyleerd histon H3 op SER10 (een marker van cellen in mitose) maakt de discriminatie van cellen in mitose dan in G 2 (linker panelen van figuur 3).
Figuur 3: Bevestigingvan celcyclus fase met behulp van aanvullende markeringen. De bovenste panelen tonen de celcyclus analyse van cellen van de BrdU positieve Hek figuur 1. De cellen werden geïncubeerd in de aanwezigheid of afwezigheid van 3 nM vincristine 18 uur na de BrdU pulse . De celcyclus analyse werd uitgevoerd zoals beschreven in figuur 2. De onderste panelen tonen dezelfde cellen op 7-AAD vs. histon H3 gefosforyleerd op SER10 dot plot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Beoordeling van de Drug Effecten op de celcyclus
Cytotoxische stoffen kan ingrijpende gevolgen op de celcyclus voortgang en kan celdood veroorzaken. Het effect van geneesmiddelen op celcyclusprogressie kan worden bepaald door toevoeging van de geneesmiddelen van belang na de BrdU pulse. Twee voorbeelden zijn getoond. De eerste was een situatie waarin de inductie of celdood overtuigde de analyse van celcyclus data (rechts panelen van figuur 3). NALM6 cellen waren blootgesteld aan 3 nM vincristine gedurende 18 uur na de BrdU puls. De cellen werden verwacht te arresteren in mitose als vincristine targets microtubuli. Maar de celcyclus analyse suggereerde dat de cellen niet had gearresteerd, maar doorreis door naar G 0/1 (Figuur 3 rechtsboven paneel). De toevoeging van een antilichaam tegen gefosforyleerd histon H3 op SER10 gebleken dat cellen niet heeft verlaten mitose (figuur 3 rechter paneel), ondanks een verminderde DNA inhoud. Het is waarschijnlijk dat het DNA gehalte werd verlaagd omdat de cellen apoptose ondergaan en waren begonnen hun DNA af te breken. Omdat de cellen geïnitieerd apoptose terwijl in mitose (dwz met 4N DNA), verschijnen ze als S-fase of G 0/1 cellen in plaats van de typische apoptotische sub-G 1 piek.
Figuur 4:. Detectie van Cell Cycle Stage Specifieke Killing The dot plots tonen het percentage BrdU positieve cellen die nog in de cultuur 24 uur na de BrdU puls. Cellen werden gekweekt in aanwezigheid of afwezigheid van alleen vehiculum (controle), 1,5 en 16 uM RAD001 sinds het einde van de BrdU pulse. Het onderste paneel toont het percentage van cellen die BrdU positief over de 24 uur incubatie waren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In een ander voorbeeld, Figuur 4 toont hoe in aanwezigheid van een lage concentratie van RAD001 (een mTOR remmer) cellen in staat waren om de celcyclus te voltooien maar onderging een vertraging of arrestatie in G 0/1. Een hogere concentratie RAD001 verregaand verhinderd cellen uit transiting tot en met G 0/1. Belangrijk cellen in de S fase (bijv BrdU positieve) bleken voorkeur verdwijnen uit de kweek bij RAD001 werd toegevoegd. Dit suggereert dat cellen die door G 2 / M waren gevoeliger voor celdood van deze agent 12.
Het is ook mogelijk om responsen van cellen die vooral fasen van de celcyclus behulp van antilichamen tegen specifieke antigenen te onderzoeken. In figuur 5 het activeren van de celcyclus regelen eiwitten Chk1 en Chk2 in respons op vincristine behandeling weergegeven. Chk1 en Chk2 worden geactiveerd door fosforylering op Ser345 en Thr68 respectievelijk. Activering van Chk1 en Chk2 te zien in cellen die lijken een 2N DNA inhoud maar zoals getoond in figuur 5 waarschijnlijk cellen in mitose dat DNA degradatie zijn begonnen tengevolge van apoptose.
Het is mogelijk om middelen toe te voegen op verschillende tijdstippen na deBrdU puls om het effect van het middel op cellen in verschillende stadia van de celcyclus te onderzoeken.
Figuur 5:. Detectie van wijzigingen in cellen met name celcyclus fasen Het bovenste paneel toont cellen gated op BrdU positieve cellen zoals in figuur 1 in 7-AAD vs. gefosforyleerd Chk1 (links) of Chk2 (rechts) dot plots. De cellen waren cultuur voor 18 uur na de BrdU puls in de aanwezigheid of afwezigheid van 3 nM vincristine als voor Figuur 3. De onderste panelen tonen overlay histogrammen van dezelfde cellen gated op ofwel de 2N en 4N gedeelte waar aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het vermogen om de celcyclus analyse is belangrijk voor het begrijpen van kankerbiologie en het werkingsmechanisme van beide geneesmiddelen en genen die de celproliferatie en groei beïnvloeden. Hoewel er een groot aantal assays die naar verluidt meten celproliferatie, de meeste geven slechts een maatregel die het aantal cellen aanwezig aangeeft. Deze omvatten testen die het aantal cellen door directe visualisatie en tellen, metabole activiteit of ATP concentratie te meten. Het belangrijkste voordeel van veel van deze werkwijzen is dat ze relatief gemakkelijk uit te voeren en vatbaar voor microplaat formats en automatisering, waardoor ze bruikbaar zijn voor het screenen van grote aantallen omstandigheden of verbindingen. Een tekortkoming van veel van deze methoden is dat celverlies door dood niet in aanmerking wordt genomen, kan leiden tot een onderschatting van celproliferatie. Ook deze methoden meten van de grootste bevolking en niet de studie van enkele cellen of de doorvoer van cellen door niet toede celcyclus.
Van de algemeen gebruikte proliferatie assays, misschien de meest betrouwbare en accurate zijn die DNA-synthese te meten. Traditionele celproliferatie assays incubeer cellen gedurende een paar uur tot overnacht met 3 H-thymidine, dat wordt geïncorporeerd in nieuw gesynthetiseerd DNA. 13 de hand liggende probleem met deze methode is het gebruik van radioactieve materialen, maar andere beperking is dat het resultaat meet het gemiddelde proliferatie van een populatie cellen. BrdU kunnen op soortgelijke wijze worden gebruikt zonder de straling kwesties, maar extra stappen nodig zijn en BrdU is een potentieel mutageen. Echter, BrdU heeft het voordeel verenigbaar met flowcytometrie, waardoor de analyse van enkelvoudige cellen. 14 Andere flowcytometrie verenigbare ter beoordeling celproliferatie bij de enkele cel niveau ook steeds meer kleurstoffen die de celmembraan of cellulaire eiwitten te labelen ( bijvoorbeeld CFSE), die te verdelen tussen daughtER-cellen, DNA intercalerende kleurstoffen en celcyclus-specifiek antigen detectie door antilichamen. De beste cel labeling kleurstoffen toe celdeling transport op een aantal celdelingen. 15 Zij bieden een directe maat voor proliferatie, hoewel geen informaties celcyclus stadium of verspreiding wordt verkregen. De meting van DNA gehalte met behulp van DNA intercalerende kleurstoffen zoals propidiumjodide of 7-AAD verschaffen sterke celcyclusverdeling 16, maar niet tijdelijke gegevens. Zelfs met de beoordeling van meerdere tijdstippen blijft het onmogelijk om de lengte van de celcyclus of specifieke fasen van de celcyclus te bepalen. Celcyclus specifieke antigenen kunnen worden gebruikt voor celcyclusfase beoordeelt een gesynchroniseerde celpopulatie. Veel gebruikte celcyclus specifieke antigenen omvatten Ki-67, 17 die wordt uitgedrukt in de S, G2 en M fasen van de celcyclus niet tijdens G 0/1, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) 18 en fosforylering van hIstone H3. 19 Hoewel deze zorgen voor een goede gegevens over de celcyclus stadium informatie over de celcyclus dynamiek ontbreekt.
Het verkrijgen van gegevens over de celcyclus dynamica werd traditioneel behandeld door het synchroniseren cellen behulp middelen of kweekomstandigheden die celcyclusprogressie blokkeren. Dit veroorzaakt een opeenhoping van cellen achter het blok, dat nadat het is verwijderd, resulteren in ronde cellen vorderen samen door de celcyclus. 1 De berekening van de duur van de celcyclus en de lengte van de verschillende fasen van de celcyclus is dan mogelijk. Cellen kunnen worden aangezet tot actieve cel fietsen invoeren G 0 door serumdeprivatie verlaten. Bij het opnieuw toevoeging van serum de cellen daarna samen bewegen naar vervolgfasen. 20 Hoewel dit een betrouwbare methode voor bepaalde celtypes, anderen, waaronder vele getransformeerde celtypen niet de celcyclus verlaten en vaak ondergaan celdood als resultaat. 21 Inderdaad onze stusterft deze gevonden om de situatie voor acute lymfatische leukemie cellen. Bovendien zullen cellen vaak geen celcyclus opnieuw invoeren in voldoende gesynchroniseerde wijze. Chemische methoden kunnen worden gebruikt om de celcyclus op specifieke fasen van de celcyclus te induceren. Bijvoorbeeld, agentia die DNA-synthese (bijvoorbeeld overmaat thymidine) te voorkomen respectievelijk te voorkomen dat de mitotische spoel vormen (bijv nocodazole) gearresteerd cellen in S en M fasen, maar zijn giftig en kan leiden tot groeiverstoringen of dodelijke een aanzienlijk deel van de cellen. 22 in alle cellen deze werkwijzen niet de meeste cellen arrestatie zonder het doden een aanzienlijke fractie. Aangezien het doel was om het effect van een mogelijk anti-leukemische agent op celcyclus parameters te beoordelen, de cellen dood door synchronisatie onaanvaardbaar. Ondanks de beschrijving van een groot aantal werkwijzen om cellen te synchroniseren, hebben tekortkomingen. De voornaamste problemen zijn: onvoldoendeverrijking op cellen in het gewenste deel van de celcyclus, verstoring van het normale fysiologie van de celcyclus of, zoals waargenomen, overmatige toxiciteit.
De werkwijze beschreven in een verlenging van de lange puls gebruikte systeem, waarbij cellen worden geïncubeerd gedurende een korte periode met BrdU aan cellen in S-fase te identificeren. We vonden een 45 min puls optimaal in ons systeem maar kortere perioden kunnen worden gebruikt indien voldoende labeling verkregen worden. Door verder te kweken cellen na verwijdering van de BrdU is het mogelijk om de voortgang te volgen gedurende de rest van S-fase, G2, mitose, G 1 en binnenkomst in de volgende celcyclus. Het kan mogelijk zijn om de cellen verder te volgen. Het voordeel van dit systeem is dat er geen bewijs van toxiciteit voor de cellen gedurende de termijn van deze experimenten en er minimale verstoring van de groei van de cellen, aangezien slechts enkele media veranderingen nodig. De cellen worden verder gehandhaafd contimanent cultuur. De flowcytometrie gebaseerd aard van de werkwijze betekent dat het kan worden gecombineerd met de identificatie van cel subpopulaties van aanvullende ondergrond of intracellulaire kleuring. We gebruikten APC geconjugeerde BrdU-antilichamen maar andere conjugaten kunnen worden gesubstitueerd voor de ontwikkeling van antilichamen panelen vergemakkelijken. We gebruikten 7-AAD plaats propidium iodide omdat 7-AAD fluoresceert in een enkel kanaal maximaliseren opties multicolor kleuring. Evenzo DAPI en Hoechst worden gebruikt als DNA vlekken maar vereisen een UV laser. Strengere cv's voor DNA kleuring kan worden verkregen met behulp van ethanol fixatie maar dit compromissen vaak antilichaamkleuring, het beperken van de mogelijkheden voor extra oppervlak of cytoplasma vlekken. Het grootste nadeel is dat de S-fase duurt ongeveer 8 uur, dus gelabelde cellen kan gewoon zijn aangegaan of over naar S-fase gedurende de puls periode af te sluiten. Hierdoor is de synchronisatie niet zo strak als bij andere systemen. Echter, door het combineren van de BrdU labeling met kleurstoffen aangeeft DNAinhoud en antilichamen tegen specifieke celcyclus afhankelijke proteïnen kunnen sterke gegevens verzameld.
Om een consistente gegevens te verkrijgen is het belangrijk ervoor te zorgen dat cellen in de juiste concentratie en de celconcentratie is consistent in alle omstandigheden worden vergeleken. Kritisch de helderheid van de 7-AAD kleuring is zeer gevoelig voor celconcentratie. Met behulp van een geautomatiseerd celtelling systeem kan ervoor zorgen dat celconcentraties consistent in alle monsters bij elke stap in het proces. Een ander belangrijk punt is de lengte van tijd dat de cellen worden blootgesteld aan BrdU. Kleine variaties kunnen vertalen in aanzienlijke verschillen, dus is het belangrijk dat alle monsters worden geïncubeerd met BrdU gedurende exact hetzelfde moment. Tenslotte is het belangrijk dat antilichamen titreren optimale kleuring te verkrijgen en dit moet worden herhaald telkens wanneer een partij wordt gewijzigd. Als alle stappen consequent worden gevolgd en celconcentraties constant gehouden toen deze method betrouwbaar zal toelaten het volgen van cellen door de celcyclus zonder synchronisatie. Er is ook veel ruimte om deze methode om specifieke celtypes passen en aan te pakken specifieke vragen te wijzigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150 cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200 µl | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1 ml | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
References
- Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Harper, J. W., Elledge, S. J. The DNA damage response: ten years after. Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).
- Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218, 474-475 (1982).
- Carayon, P., Bord, A. Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA. Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).
- Gonchoroff, N. J., et al. S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment. Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).
- Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells. Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).
- Hendzel, M. J., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106, 348-360 (1997).
- Draetta, G., Beach, D. Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement. Cell. 54, 17-26 (1988).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. , (2012).
- Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester. Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).
- Beck, H. P. Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine. Cytometry. 2, 170-174 (1981).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells. Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).
- Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67. Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).
- Danova, M., et al. Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors. Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).
- Juan, G., et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry. 32, 71-77 (1998).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).
- Kues, W. A., et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).
- Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization. Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).
