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Biology

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

doi: 10.3791/52840 Published: August 16, 2015

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Bromdesoxyuridin (BrdU) -Aufnahme, die zeitliche Verfolgung von Zellen, die in der S-Phase auf einen bestimmten Zeitpunkt waren ermöglichen. Die Zugabe von DNA-Farbstoffen und Antikörpermarkierung erleichtert die detaillierte Analyse des Schicksals der S-Phasen-Zellen zu späteren Zeitpunkten.

Introduction

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Die Beurteilung der Zellzyklus-Funktionen und Änderungen, die in den Zellen auftreten, während der Zellzyklusprogression ist grundlegend für das Verständnis vieler Aspekte der Biologie, insbesondere der Krebsbiologie. Viele Agenten in Entwicklung für die Behandlung von malignen Erkrankungen haben tief greifende Auswirkungen auf die Zellzyklusprogression oder Zelltod durch Zellzyklus abhängige-Mechanismen. Um Zellzyklus Dynamik oder Zellen in einer bestimmten Phase des Zellzyklus zu untersuchen, ist es üblich, Zellen zu synchronisieren. Synchronisationsverfahren kann jedoch nachteilige Auswirkungen auf die Zellen untersucht, die möglicherweise verwirrende die erhaltenen Ergebnisse. 1 Kürzlich wurde die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Proteinen, die nur in bestimmten Phasen des Zyklus Zellen vorliegen erlaubt hätte Analyse der Zellzyklus-Progression in einzelnen Zellen über die Zeit 2, jedoch sind die Zellen, die untersucht werden müssen, um die genetisch manipuliert werden können, um diese markierten Proteine ​​exprimieren, was ihre Anwendung auf Systeme, in denen diese gelesen werden könnenily erreicht.

Der Zellzyklus besteht aus zwei aktiven Phasen: die Synthese (S) Phase, in der DNA repliziert und Mitose (M), wo die Zellteilung erfolgt. Diese Phasen werden durch drei Spaltphasen, G 0, G 1 und G 2 voneinander getrennt. G 0 oder Ruhe ist eine Ruhephase, in der die Zelle den Zyklus verlassen, G 1, wo die Zellen an Größe vor der DNA-Replikation und G 2, wo das Zellwachstum weiterhin zwischen Beendigung der DNA-Replikation, jedoch vor der Zellteilung. Die Progression durch den Zellzyklus wird durch eine Reihe von Kontrollpunkten gesteuert. Der G1 Kontrollpunkt wird aktiviert, wenn die Umweltbedingungen nicht unterstützend der DNA-Synthese und verhindert den Eintritt in die S-Phase. Die intra-S-Phasen-Kontrollpunkt oder Verzögerung kann durch DNA-Schädigung, die in ins Stocken geraten Replikationsgabeln führen kann ausgelöst werden. Während G 2 die Wiedergabetreue des replizierten DNA bestätigt wird und wenn ein Schaden wird dann detektiert die G 2 3 Aktivierung dieser Kontroll wird häufig verwendet, um Zellpopulationen zu synchronisieren. Zellzyklus-Kontrollpunkte können von einer Reihe von Faktoren ab, sondern in der Krebsbiologie die häufigste ist die Detektion von DNA-Schäden aktiviert wird. Die DNA-Schadensantwort wird durch die PI3-Kinase-like Kinasen Ataxie Teleangiektasien und Rad3 bezogenen (ATR) initiiert und Ataxie Teleangiektasie mutiert (ATM), die den nachgeschalteten Effektor-Kinasen Chk1 und Chk2 aktivieren sind. 3 Eine Reihe von Ereignissen aktiviert Chk1 einschließlich, ins Stocken geraten Replikationsgabeln, DNA-Vernetzungen und UV-Strahlung Schäden während Chk2 wird vor allem von Doppelstrangbrüchen aktiviert.

Das übliche Verfahren für die Untersuchung der Wirkung der veränderten Bedingungen auf die Länge des Zellzyklus is, um die Zellen zu synchronisieren in einer bestimmten Phase des Zellzyklus. 1 Dieses kann über verschiedene Verfahren erreicht werden. Die Zellen können physikalisch getrennt basieren auf Größe, Dichte, Seitenstreuung (Granularität) und Zelloberflächenexpression Marker. Praktischer ausgedrückt können Zellen durch chemische Mittel synchronisiert werden. Mehrere Mittel, wie Thymidin, Hydroxyharnstoff und Cytosinarabinosid kann zur DNA-Synthese in der S-Phase des Zellzyklus, was zu einer Anhäufung von Zellen in S-Phase, die auch nach cycling die Mittel entfernt zu hemmen. Oder M-Phase der DNA-Gehalt - Zellen mit Nocodazol, die die Bildung der mitotischen Spindel, Festnahme mit einem G 2 verhindert, behandelt. Beseitigung von Serum aus dem Kulturmedium führt zur Akkumulation von Zellen in G 0 -Phase. Die erneute Zugabe der Nährstoffe in der Kultur Serum führt zum Start des normalen Fahrradfahren der Zellen. Jedoch sind alle diese Synchronisationsverfahren mit normalen Radfahren und Wachstum der Zellen stören und Result in signifikanten Zelltod.

Synchronisation der akuten lymphoblastischen Leukämiezellen, ist eine besondere Herausforderung und diese Zellen nicht zugänglich sind Genmanipulation. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Beurteilung von Zellzyklusdynamik und die Untersuchung von Zellen, die in bestimmten Phasen des Zellzyklus ohne traditionelle Synchronisation oder genetischen Veränderung. Dieses Verfahren kann auch für andere Zelltypen, bei denen genetische Veränderung und traditionelle Synchronisationsverfahren nicht leicht erreicht werden. Die Methode basiert auf der seit langem etablierten Einsatz von Bromdesoxyuridin (BrdU) Einbau, die sehr wenig Einfluss auf die kurzfristige Wachstum und die Vermehrung von Zellen hat basierend. 4 Gegründet BrdU-Protokolle nutzen den Einbau von BrdU in die neu synthetisierte DNA während der S-Phase . Dies markiert dauerhaft Zellen mit BrdU während der Belichtung in der S-Phase gewesen. Diese Population kann zu späteren Zeitpunkten durch Färbung auf BrdU incorpor identifiziert werdenation und damit zu handeln als Synchron Bevölkerung, die folgten und mit der Zeit zu beurteilen erlaubt die Untersuchung von Arzneimittelwirkungen auf die Zellzyklustransit werden kann. BrdU muss vor der Antikörperfärbung ausgesetzt sind, werden in der Regel folgende DNase oder Säurebehandlung erreicht. 6,7 mittels Durchflusszytometrie zu erkennen eingebautem BrdU ermöglicht die Aufnahme von zusätzlichen Markern. Die wichtigste ist die Verwendung von Farbstoffen auf den DNA-Gehalt zu messen, so dass die Beurteilung der Zellzyklusphasenverteilung der Zellen, in die S-Phase zu Beginn der Studie waren. 8 ferner zusätzliche Oberfläche oder intrazelluläre Antigene können ebenfalls untersucht werden. 9 Dies kann zu Zellzyklusereignisse wie Ki67 beziehen oder auf scheinbar unabhängige Zellfunktionen wie Apoptose-Marker wie gespalten Caspase-3. Die Einsatzmöglichkeiten sind durch die Phantasie des Forschers begrenzt.

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Protocol

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Das hier beschriebene Protokoll verwendet die akute lymphatische Leukämie-Zelllinie NALM6 sondern kann auch auf andere Zelltypen angewendet werden.

1. Lösungen und Reagenzien

  1. Komplettes RPMI
    1. Hinzuzufügen 56 ml fötales Kälberserum (FCS) und 5,5 ml von 200 mM L-Glutamin in einer 500 ml Flasche mit RPMI-1640-Medium.
  2. BrdU-Stammlösung
    1. Vorbereitung 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS).
  3. BrdU komplettem RPMI
    1. In 6,2 ul der BrdU-Stammlösung zu 10 ml vollständigem RPMI.
  4. DNase-Lösung
    1. Bereiten Sie 1 mg DNase / ml in DPBS.
  5. Färbepuffer
    1. Vorbereitung 3% hitzeinaktiviertem FCS und 0,09% Natriumazid in DPBS.
  6. Siehe Materialliste für Definitionen der Fixation Buffer, Permeabilisierung Puffer und Waschpuffer.

2. Zellen

Neinte: Die Zellen waren nicht für mehr als 6 Monate kultiviert. Dieses Verfahren ist direkt anwendbar zu jeder nicht-adhärenten Zelllinie mit Anpassungen der Zelldichte und Kulturmedien. Zellen einzusetzen, die exponentiell zu Beginn des Experiments wachsen.

  1. Pflegen NALM6 Zellen in T-75 Kulturflaschen in komplettem RPMI. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen mit einem Klasse II Biosicherheitswerkbank.
    1. Aufrechtzuerhalten NALM6 Zellen zwischen 1-2 x 10 6 Zellen pro ml durch Aufteilung der Kultur dreimal wöchentlich.
    2. Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 in Luft.

3. Pulse Markierung von Zellen mit BrdU

VORSICHT: Gehen Sie BrdU mit Sorgfalt, da es eine potentielle mutagen und teratogen.

  1. Zentrifuge Zellen bei 150 g für 5 min. Hinweis: Übertragen von Zellen in frischem Medium verbessert die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.
  2. Durchführen einer Zellzahl und resuspendieren Zellen in komplettem RPMI mit 2 × 10 6 cEllen / ml.
  3. Verdünnte Zellen 1 in 2 mit BrdU komplettem RPMI Herstellung einer endgültigen Zellkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml.
  4. Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 45 min, dann verdünnt 1 in 10 Zellen mit komplettem RPMI. Zentrifuge Zellen bei 150 g für 5 min und sorgfältig berücksichtigen keines der überstehenden Flüssigkeit.
  5. Die Zellen in einem kleinen Volumen (~ 100 & mgr; l) von kompletten RPMI Führen einer Zellzahl und anpassen, um 1 x 10 6 Zellen / ml.
  6. Pipette 1 ml der Zellen in die Vertiefungen einer 48 Well-Platte. Pipette 1 ml DPBS in jede unbesetzte Brunnen, mehr reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.
  7. Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 in Luft für die gewünschten Zeitpunkte, hier 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23 und 24 Stunden. Anmerkung: Die Länge der Zeit ab, was die Versuchsanordnung zielt darauf ab, zu messen abhängen.
  8. Übertragen Sie alle Zellen in FACS-Röhrchen mit einer Pipette. Die auch nacheinander mit 1 ml volu Spülenmes von PBS zu einem endgültigen Gesamtvolumen von 5 ml.
  9. Zentrifuge bei 150 xg für 5 min und entfernen Sie vorsichtig alle den Überstand. Zellen sind bereit für die Färbung, führen Sie diese (Abschnitt 4) sofort.

4. Zellfärbung

Anmerkung: Wenn eine Oberflächenfärbung von Zellen erforderlich zuführen es vor der Fixierung, so dass die Zellen bei 4 ° C durchgehend beibehalten.

  1. Die Zellen in 100 ul Färbepuffer (für optionale Oberflächenfärbung, fügen Sie die empfohlenen Volumen von Antikörper gegen Oberflächenantigene und Inkubation für 30 min bei 4 ° C).
  2. 1 ml der Färbepuffer, Zentrifuge für 5 Minuten bei 150 xg und den Überstand verwerfen.
    Hinweis: Spezifische Antikörper, Konzentration, Inkubationszeit usw. in Abhängigkeit von bestimmten experimentellen Ziele variieren.
  3. Fixierung und Permeabilisierung
    1. Die Zellen in 100 ul Puffer Fixierung und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
    2. 1 ml of Waschpuffer, Zentrifuge für 5 Minuten bei 150 xg und den Überstand verwerfen.
    3. Die Zellen in 100 ul Permeabilisierung Puffer und Inkubation der Zellen für 10 Minuten auf Eis.
    4. 1 ml Waschpuffer, Zentrifuge für 5 Minuten bei 150 · g, und den Überstand verwerfen.
    5. Die Zellen in 100 ul Puffer pro Röhrchen Fixierung und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
    6. 1 ml Waschpuffer, Zentrifuge für 5 Minuten bei 150 · g, und den Überstand verwerfen.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier bei Bedarf angehalten werden. Die fixierten Zellen werden bei 4 ° C mehrere Tage lang stabil, wenn sie in Färbepuffer resuspendiert. Entfernen Sie die Färbepuffer nach der Zentrifugation, bevor Sie fortfahren.
  4. DNase-Behandlung
    1. Die Zellen in 100 ul DNase-Lösung (30 ug DNase / 10 6 Zellen) und inkubieren Zellen für 1 h bei 37 ° C.
    2. 1 ml Waschpuffer, Zentrifuge bei 150 xg für 5 min und Überstand verwerfen.
    3. Antikörper-Färbung
      Anmerkung: Die Färbung für andere als BrdU intrazellulären Marker können gleichzeitig mit der BrdU-Färbung durchgeführt werden.
      1. WICHTIG: Bereiten Kompensationskontrollen, bestehend aus ungefärbten Zellen und Zellen, die mit jedem einzelnen Fluorochrom markiert. Idealerweise verwenden die gleichen Antikörper für die Entschädigung Kontrollen, wie sie in der experimentellen Röhren verwendet. Wenn dies jedoch nicht möglich ist, ersatz Antikörper stark exprimierten Antigene auf den gleichen Fluorochrom konjugiert ist.
      2. Die Zellen in 50 ul Waschpuffer und fügen 1 ul / 10 6 Zellen von BrdU-Antikörpers. Anmerkung: direkt konjugierten Antikörpern gegen andere spezifische intrazelluläre Antigene können ebenfalls zugegeben werden.
        HINWEIS:. Antikörper gegen Histon H3 an Ser10 phosphoryliert kann zwischen den Zellen in der G2 und M zu unterscheiden ist phosphoryliert Histon H3 an Ser10 während der Mitose 10 Antikörper gegen cdc2 phosphoryliert am Tyr15 verwendet, um Zellen zu detektieren have Mitose verpflichtet. 11
      3. Inkubieren der Zellen für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
      4. 1 ml Waschpuffer, Zentrifuge Zellen bei 150 xg für 5 min und Überstand verwerfen.
    1. Stain DNA für Zellzyklusanalyse
      1. Lösen Pellet und fügen Sie 20 ul der 7-AAD-Lösung (0,25 ug). Anmerkung: Es ist wichtig, eine konstante Menge von 7-AAD / Zelle zu verwenden.
      2. Resuspendieren der Zellen in 1 ml Färbepuffer.

    5. Sammlung von Durchflusszytometrie Daten

    Der benötigte hängt von der Anzahl und Art der verwendeten Fluorochromen abhängen Maschine.

    1. Sammeln Sie die folgenden Parameter: FSC-A, SSC-A, FSC-H und 7-AAD-Fluoreszenz auf einer linearen Skala (FSC-W kann anstelle von FSC-H verwendet werden). Sammeln Sie die APC-Kanal auf einer logarithmischen Skala. Sammeln Sie alle zusätzlichen Kanäle für die Beurteilung der Oberfläche und im Inneren von Etiketten mit einer logarithmischen Skala erforderlich.
    2. Führen comKompensation von überlappenden Signalen in vor der Analyse der Proben zwischen verschiedenen Fluorochromen Emissionsspektren beobachtet. Hinweis: Die meisten Durchflusszytometer wird dies automatisch durchführen.
    3. Sammeln Sie mindestens 10.000 Ereignisse für jede Probe.

    6. Analyse der Durchflusszytometrie Daten

    Anmerkung: FlowJo wurde in dieser Studie für die Strömung verwendet Zytometrie Datenanalyse, sondern auch andere Softwarepakete können ebenfalls verwendet werden. Die Gating-Strategie ist in Figur 1 veranschaulicht.

    1. Identifizieren Sie die Lebendzellpopulation mit FSC-A und SSC-A-Parameter.
    2. Innerhalb dieser Population auszuschließen Dubletten und Aggregate mit FSC-A und FSC-H (FSC-W kann natürlich auch verwendet werden).
    3. Innerhalb dieser Population eingestellt ein Punkt-Diagramm mit 7-AAD auf der x-Achse und BrdU-APC auf der y-Achse.

    Abbildung 1
    Abbildung 1: Gating-Strategie Left pa.nel: ungated Zellen auf einem FCS-A vs. SSC-ein Punkt-Diagramm dargestellt. Die lebensfähige Zellpopulation wird durch die gezeigte Gate identifiziert. Mitteltafel: Zellen aus dem linken Fenster gated auf einer FSC-A vs. FSC-H-Punktediagramm (FSC-W kann anstelle der Höhe verwendet werden) gezeigt. Dubletts und Aggregate werden identifiziert und durch die gezeigte Gate ausgeschlossen. Rechts: Zellen aus dem Wams Ausschlussdatum in der Mittelplatte gated sind auf einem 7-AAD vs. APC-ein Punkt-Diagramm dargestellt. Die BrdU-Antikörper wird mit APC, die die Identifizierung von Zellen, die BrdU während des Puls-Markierung inkorporiert haben markiert. 7-AAD bietet Informationen über die DNA-Gehalt. Die obere Gate definiert Zellen positiv für BrdU und damit in die S-Phase zu der Zeit des BrdU Puls, der unteren linken Tor, Zellen in G 0/1 und der rechten unteren Gate jene in G 2 / M. Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Figur.

    1. Cell Cycle A nalyse
      1. Öffnen der ersten Datendatei und Gate auf die Zellen in dem Dublett Ausschluss Gate.
      2. Analysieren Sie diese Bevölkerung für Zellzyklus-Verteilung (unter Plattformen in FloJo Software befindet) und verwenden Sie die Dean-Jett-Fox-Modell.
      3. Besorgen Sie sich die Positionen der G 0/1 und G 2 / M mit Spitzen erstellen Tore.
      4. Tor auf der BrdU-positiven Zellen und unterliegen diese Bevölkerung zu gleichen Zellzyklusanalyse.
      5. Stellen die Positionen der G 0/1 und G 2 / M-Spitzen, die durch die Anwendung der gleichen Toren aus schaffen Gatter und Einstellen Bedingungen (mit den Gates angelegt) für die Positionen der G 0/1 und G 2 / M Spitzen. Dies wird in den ersten 2 Platten der Fig. 2 dargestellt
        Hinweis: andere Software kann auch verwendet werden, um die Daten zu analysieren, und die Anweisungen würden entsprechend variieren.

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    Fig. 2: Zellzyklusprogression Die erste Platte (alle Zellen) auf der Zellpopulation durch das Dublett Ausschluss Gate definiert sucht. Diese Population wurde in einem Histogramm auf der X-Achse 7-AAD angezeigt. Der Peak der G 0/1 Peak durch den Pfeil unter der Achse angegeben. In den Folgeplatten BrdU-positiven Zellen wurden auf gated wie in Abbildung 1 dargestellt. Der Wert für das G 0/1 Position erreicht, wenn Gating des Dubletts Ausschluss Gate mit der BrdU positive Zellen in gated FlowJo Zellzyklus-Software angewendet. Jeder nachfolgende Tafel wurde auf der BrdU-positiven Population gated wie in Figur 1 und der Position der G 0/1 Peak, basierend auf der erhaltenen bei der Analyse der Gesamtbevölkerung in den ersten zwei Platten gezeigt Wert dargestellt. Verwendung des BrdU negative Fraktion, um die Position des G 0/1 Population für die BrdU-positiven Zellen in demselben samp identifizierenle steuert für leichte Unterschiede in der Intensität der DNA-Färbung zwischen den Proben. Die Zahl auf jeder Tafel gezeigt ist, stellt die Zeit seit dem BrdU puls beendet. Die berechneten Zellzyklus-Phasen werden in schattierten grün dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Representative Results

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Diese Methode kann verwendet werden, um eine Reihe von Informationen zu erhalten. Einige Anwendungen sind hier aufgeführt.

Ermittlung der Dauer des Zellzyklus

Die Zeit für die Zellen durch den Zellzyklus erforderlich ist, um Durchgangs bestimmen, werden die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der BrdU puls geerntet. Die Intervalle zwischen den Bewertungen können auf die jeweiligen Zellen analysiert angepasst werden. Hämatopoetischen Zelllinien wurden stündlich über eine 24-Stunden-Zeitraum, in Ermangelung einer medikamentösen Behandlung, die Länge der Zellzyklusphasen unter Standardkulturbedingungen zu bestimmen, untersucht. Abbildung 2 zeigt eine Auswahl von Snapshot-Analyse NALM6 Zellen über einen Zeitraum von 24 Std. Die Zellen in die S-Phase zu der Zeit des BrdU Impuls (dh innerhalb des BrdU positive Gate in Figur 1) durchliefen G 2 / M, mit einem Spitzenwert von Zellen in dieser Phase des Zellzyklus detektiert 10 h nach der BrdU pUlse. Der Anteil der BrdU-markierten Zellen in die S-Phase erreichte ihren Nadir 14 Stunden nach dem Impuls, und fast alle Zellen waren zu G 1 nach 17 h ergab. Von 24 Stunden ein Anteil der BrdU-markierten Zellen hatte die S-Phase im Rahmen ihrer nächsten Zellzyklus anzeigt, dass Zellen einen Zellzyklus innerhalb von 24 Stunden zu vervollständigen, aber die meisten hatten eine zweite Runde der Replikation, was mit der bekannten 36 noch nicht eingegeben neu eingegeben hr Verdopplungszeit für diese Zellen.

Zellzyklus-Verteilung kann weiter durch den Einschluss von zusätzlichen Markern verfeinert werden. Zum Beispiel kann die Zugabe eines Antikörpers gegen Histon H3 an Ser10 phosphoryliert (ein Marker von Zellen in Mitose) ermöglicht die Unterscheidung von Zellen in die Mitose von denen in G 2 (linke Felder von Figur 3).

Figur 3
Abbildung 3: Bestätigungder Zellzyklusstadium Verwenden zusätzlicher Marker. Die oberen Felder zeigen den Zellzyklus-Analyse von Zellen aus der BrdU positive Gate wie in Fig. 1 gezeigt die Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von 3 nM Vincristin 18 Stunden nach der BrdU puls inkubierten . Der Zellzyklus-Analyse wurde wie in 2 beschrieben, durchgeführt. Die unteren Felder zeigen die gleichen Zellen auf 7-AAD gegen Histone H3 an Ser10 Punktdiagramm phosphoryliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Beurteilung der Wirkstoff-Effekten auf den Zellzyklus

Zytotoxischen Wirkstoffen kann tiefgreifende Auswirkungen auf die Zellzyklusfortschritt aufweisen und Zelltod zu induzieren. Die Wirkung von Drogen auf den Zellzyklus durch Zugabe der Drogen von Interesse nach der BrdU Puls beurteilt werden. Zwei Beispiele werden gezeigt. Die erste war eine Situation, wo die Induktions of Zelltod verwechselt die Analyse der Zellzyklusdaten (rechte Bilder von Abbildung 3). NALM6 Zellen hatte bis 3 nM Vincristin 18 Stunden nach der BrdU Puls ausgesetzt. Die Zellen wurden erwartet, dass in der Mitose als Vincristin Ziele Mikrotubuli zu verhaften. Doch die Zellzyklus-Analyse vorgeschlagen, dass die Zellen nicht verhaftet, aber bis zur G 0/1 (Abbildung 3 obere rechte Platte) übergeht. Die Zugabe eines Antikörpers gegen Histon H3 an Ser10 phosphoryliert zeigten, dass Zellen nicht verlassen Mitose (Figur 3 rechte untere Tafel), obwohl sie eine reduzierte DNA-Gehalt. Es ist wahrscheinlich, dass die DNA-Gehalt wurde verringert, weil die Zellen einer Apoptose unterliegen und hatte begonnen, ihre DNA abbauen. Da die Zellen eingeleitet Apoptose während der Mitose (dh mit 4N DNA), wie S-Phase oder G 0/1 Zellen anstelle der typischen apoptotischen Sub-G 1 Peak erscheinen sie.

Figur 4
Abb. 4: Nachweis von Zellzyklusstadium spezifische Tötung der Dot-Plots zeigen den Anteil der BrdU-positiven Zellen in der Kultur 24 Stunden nach der BrdU Puls bleibt. Zellen waren in der Gegenwart oder Abwesenheit von Träger allein (Kontrolle), 1,5 oder 16 & mgr; M RAD001 seit dem Ende des BrdU puls kultiviert worden. Das untere Feld zeigt den Prozentsatz der Zellen, die BrdU positiv in der 24-stündigen Inkubation wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

In einem anderen Beispiel 4 zeigt, wie in Gegenwart einer niedrigen Konzentration von RAD001 (ein mTOR Inhibitor) Zellen waren in der Lage, den Zellzyklus zu vervollständigen, aber dann einer Verzögerung oder Anhalten in G 0/1. Eine höhere Konzentration von RAD001 weitgehend verhindert Zellen aus transiting bis zur G 0/1. Wichtig Zellen in S-Phase (dh BrdU positive) wurde gezeigt, bevorzugt aus der Kultur verschwinden, wenn RAD001 zugegeben. Dies deutet darauf hin, dass die Zellen, die durch G 2 / M waren anfälliger für Tod durch dieses Anbieters Zelle. 12

Es ist auch möglich, um Antworten von Zellen in bestimmten Phasen des Zellzyklus unter Verwendung von Antikörpern gegen spezifische Antigene zu untersuchen. In 5 ist die Aktivierung des Zellzyklus-Checkpoint-Proteine ​​steuern Chk1 und Chk2 ansprechend auf Vincristin-Behandlung dargestellt. Chk1 und Chk2 werden durch Phosphorylierung an Ser345 und Thr68 jeweils aktiviert. Aktivierung Chk1 und Chk2 können in Zellen, die eine 2N-DNA-Gehalt haben scheinen gesehen werden, aber wie in Figur 5 gezeigt sind wahrscheinlich Zellen in der Mitose, die DNA-Abbau als Folge von Apoptose begonnen haben.

Es ist möglich, Arzneimittel zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem HinzufügenBrdU Impuls, um die Wirkung des Mittels auf die Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu untersuchen.

Figur 5
Fig. 5: Nachweis von Änderungen in Zellen insbesondere Zellzyklusphasen Das obere Feld zeigt Zellen auf den BrdU-positiven Zellen, wie in 1 gated in 7-AAD gegen phosphoryliertes Chk1 (links) oder Chk2 (rechts) Dot-Plots. Die Zellen-Kultur 18 h nach der BrdU Impuls in der Gegenwart oder Abwesenheit von 3 nM Vincristin wie für Tabelle 3 ist. Die unteren Felder zeigen Overlay Histogramme der gleichen Zellen auf entweder der 2N oder 4N Fraktion wie angegeben sucht. Hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Die Fähigkeit, den Zellzyklus zu analysieren ist wichtig für das Verständnis der Krebsbiologie und den Wirkmechanismus beider Medikamente und Gene, die die Zellproliferation und das Wachstum beeinflussen. Zwar gibt es eine Vielzahl von Assays, welche angeblich die Zellproliferation zu messen, wird nur die Mehrheit ein Maß, daß die Anzahl Zellen vorhanden angibt. Dazu gehören Tests, die Zellzahl durch direkte Visualisierung und Zählen, Stoffwechselaktivität oder ATP-Konzentration zu messen. Der Hauptvorteil bei vielen dieser Verfahren ist, daß sie relativ einfach durchzuführen und zugänglicher für den Mikroplatten und Automatisierung, so dass sie für das Screening einer großen Anzahl von Bedingungen oder Verbindungen nützlich. Ein Nachteil vieler dieser Methoden ist, dass Zellverlust aufgrund der Tod nicht berücksichtigt, was möglicherweise zu einer Unterschätzung der Zellproliferation führt. Auch diese Verfahren messen die Masse der Bevölkerung und nicht die Untersuchung von einzelnen Zellen oder den Transit von Zellen durch erlaubenZellzyklus.

Der üblicherweise verwendeten Proliferationsassays, vielleicht die zuverlässig und genau sind diejenigen, die DNA-Synthese zu messen. Traditionellen Zellproliferationsassays inkubiert Zellen für einige Stunden bis über Nacht mit 3 H-Thymidin, das in neu synthetisierte DNA eingebaut wird. 13 Die offensichtliche Problem bei diesem Verfahren ist die Verwendung von radioaktiven Substanzen, sondern eine andere Einschränkung ist, dass das Ergebnis, misst die durchschnittliche Proliferation einer Population von Zellen. BrdU kann ebenfalls ohne den Strahlungs Probleme verwendet werden, wobei zusätzliche Schritte benötigt werden und BrdU ist ein potentieller mutagen. Hat BrdU jedoch den Vorteil, dass mit Fluss kompatibel Zytometrie und ermöglicht die Analyse von Einzelzellen. 14 Sonstige Durchflusszytometrie kompatible Methoden zur Beurteilung der Zellproliferation in der Einzelzellebene sind eine wachsende Zahl von Farbstoffen, die die Zellmembran oder zelluläre Proteine ​​zu markieren ( zB CFSE), die zwischen daught teilener Zellen, DNA interkalierende Farbstoffe und Zellzyklus-spezifischen Antigen-Nachweis von Antikörpern. Das Beste aus Zellmarkierung Farbstoffe ermöglichen Zellteilung Tracking über mehrere Zellteilungen. 15 Sie bieten ein direktes Maß für die Proliferation, wenn auch keine Angaben zur Zellzyklusstadium oder Verteilung erhalten. Die Messung der DNA-Gehalt unter Verwendung von DNA interkalierende Farbstoffe wie Propidiumiodid oder 7-AAD liefern starke Zellzyklus-Verteilung 16, aber nicht zeitlich, Daten. Auch bei der Beurteilung der mehreren Zeitpunkten bleibt es unmöglich, die Länge des Zellzyklus oder spezifischer Zellzyklusphasen zu bewerten. Zellzyklus-spezifische Antigene können verwendet werden, um Zellzyklusphase in einer nicht synchronisierten Zellpopulation zu bewerten. Häufig verwendete Zellzyklus-spezifischen Antigene umfassen Ki-67, 17, die während der S ausgedrückt wird, G 2 und M-Phasen des Zellzyklus, jedoch nicht während G 0/1, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) 18, und die Phosphorylierung von hiStone H3. 19 Während diese bieten gute Daten zur Zellzyklusstadium, Informationen über Zellzyklus Dynamik fehlt.

Abrufen von Daten aus Zellzyklusdynamik ist traditionell durch die Synchronisierung Zellen unter Verwendung von Mitteln oder Kulturbedingungen, die Zellzyklusprogression zu blockieren untersucht worden. Dies führt zu einer Anhäufung von Zellen hinter dem Block, die einmal entfernt wird, ergeben sich in der Welle der Zellen fort zusammen durch den Zellzyklus. 1 Die Berechnung der Dauer des Zellzyklus und der Länge der verschiedenen Phasen des Zellzyklus ist dann möglich. Zellen induziert werden kann, um aktive Zellzyklus Eingabe G 0 durch Serumentzug beenden. Beim Wieder Zugabe von Serum werden die Zellen können dann gemeinsam bewegen, in aufeinanderfolgenden Phasen. 20 Dies ist zwar eine zuverlässige Methode für bestimmte Zelltypen, andere, darunter viele transformierte Zelltypen, ausfallen, um den Zellzyklus zu verlassen und häufig unterziehen Zelltod als Ergebnis. 21 In der Tat unsere stustirbt dieses gefunden, um die Situation für die akute lymphatische Leukämie-Zellen sein. Außerdem werden Zellen häufig nicht Zellzyklus in einer ausreichend synchronisiert erneut einzugeben. Chemische Verfahren verwendet werden, um Zellzyklusarrest in bestimmten Phasen des Zellzyklus zu induzieren. Beispielsweise Mittel, die DNA-Synthese (zB Über Thymidin) zu verhindern oder zu verhindern, die mitotischen Spindelbildung (zB Nocodazol) Verhaftung Zellen in S und M-Phasen sind, sind jedoch toxisch und können in Wachstumsstörungen und sogar zum Tod einer signifikanten Anteil des Ergebnisses Zellen. 22 in allen Zellen diese Methoden konnte die Mehrzahl der Zellen, ohne zu töten einen signifikanten Anteil zu verhaften. Dass es das Ziel war es, die Auswirkungen einer möglichen antileukämische Mittel auf die Zellzyklusparametern beurteilen, das den Zelltod von Synchronisations resultierende war inakzeptabel. Obwohl die Beschreibung einer Vielzahl von Verfahren, um Zellen zu synchronisieren, haben alle Nachteile. Die Hauptprobleme sind: eine unzureichendeAnreicherung für Zellen in dem gewünschten Teil des Zellzyklus, Störungen der normalen Physiologie des Zellzyklus, oder, wie beobachtet wird, überschüssige Toxizität.

Das hier beschriebene Verfahren ist eine einfache Erweiterung des Langpulssystem verwendet wird, bei der Zellen für einen kurzen Zeitraum mit BrdU inkubiert, um die Zellen in die S-Phase zu identifizieren. Wir fanden eine 45 min Puls optimal in unser System aber kürzere Zeiträume verwendet werden, wenn eine ausreichende Kennzeichnung erhalten zu sein. Durch die weitere Kulturzellen nach der Entfernung des BrdU ist es möglich, deren Verlauf durch den Rest der S-Phase, G 2, Mitose, G 1 und dem Eintritt in den nächsten Zellzyklus zu verfolgen. Es kann möglich sein, um die Zellen weiter zu folgen. Der Vorteil dieses Systems ist, dass es keine Anzeichen von Toxizität für die Zellen in dem Zeitrahmen dieser Experimente und eine minimale Störung des Wachstums der Zellen, da nur ein paar Medienwechsel erforderlich sind. Die Zellen werden sonst in Conti gehaltennuierliche Kultur. Die Durchflusszytometrie basierend Natur des Verfahrens bedeutet, dass es mit der Identifizierung Zellsubpopulationen durch zusätzliche Oberfläche oder die intrazelluläre Färbung kombiniert werden. Wir verwendeten APC konjugierten BrdU Antikörper, sondern auch andere Konjugate kann ersetzt werden, um die Entwicklung von Antikörper-Panels zu erleichtern. Wir haben 7-AAD statt Propidiumiodid, weil 7-AAD fluoresziert in einem einzigen Kanal zu maximieren Optionen für mehrfarbige Färbung. Ebenso DAPI oder Hoechst als DNA Flecken verwendet werden, sondern erfordern einen UV-Laser. Engere CVs für DNA-Färbung kann unter Verwendung von Ethanol Fixierung erhalten werden, aber diese häufig Kompromisse Antikörper-Färbung, die Begrenzung der Optionen für zusätzliche Oberfläche oder cytoplasmatische Flecken. Der größte Nachteil ist, dass die S-Phase dauert etwa 8 Stunden, so markierten Zellen können einfach eingegeben oder über die S-Phase während der Pulsperiode verlassen haben. Als Ergebnis ist die Synchronisation nicht so eng wie bei einigen anderen Systemen. Jedoch wird durch Kombinieren des BrdU-Markierung mit Farbstoffen anzeigt DNAInhalt und Antikörper gegen spezifische Zellzyklus abhängige Proteine ​​können starke Daten erhalten werden.

Um konsistente Daten zu erhalten, ist es wichtig sicherzustellen, dass die Zellen in der richtigen Konzentration und die Zellkonzentration ist konsistent alle Bedingungen verglichen wird. Kritisch wird die Helligkeit des 7-AAD-Färbung ist sehr empfindlich auf die Zellkonzentration. Verwendung eines automatisierten Zellzählsystem dazu beitragen, dass die Zellkonzentration konsistent in allen Proben bei jedem Schritt in dem Verfahren sind. Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Länge der Zeit, die Zellen BrdU ausgesetzt. Kleine Abweichungen können in beträchtlichen Unterschiede zu übersetzen, so ist es wichtig, dass alle Proben werden mit BrdU für genau gleichzeitig inkubiert. Schließlich ist es wichtig, Antikörper zu titrieren, um eine optimale Färbung zu erhalten, und dies sollte wiederholt werden, wenn ein Stapel geändert. Wenn alle Schritte werden konsequent verfolgt und Zellkonzentrationen konstant gehalten wird dann dieser method zuverlässig die Verfolgung von Zellen durch den Zellzyklus zu ermöglichen, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation. Außerdem gibt es beträchtliche Möglichkeiten, dieses Verfahren auf bestimmte Zelltypen zu entsprechen und zu adressieren spezifische Fragen zu modifizieren.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC BrdU Flow Kit BD Biosciences 552598 Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm
Buffer (referred to as Fixation Buffer)
BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus BD Biosciences 561651 Referred to as Permeabilization buffer
BD Perm/Wash Buffer BD Biosciences 554723 Referred to as Wash buffer
DNase Sigma D-4513
BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes BD Biosciences 352008
BD Pharmingen Stain Buffer BD Biosciences 554656
BD LSR FORTESSA flow cytometer BD Biosciences FORTESSA
Pipetman Gilson P2, P20, P100, P1000
RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml Lonza 12-167F
DPBS Lonza 17-512F
Fetal Bovine Serum FisherBiotec FBS-7100113
L-Glutamine Sigma G7513-100ML
5-Bromo-2′-deoxyuridine Sigma B5002-1G
Falcon TC 150 cm2 vented Flasks BD Biosciences 355001
Pipettes 25 ml Greiner 760180
Aersol Pipettes 200 µl Interpath 24700
Aersol Pipettes 1 ml Interpath 24800
Centrifuge Spintron GT-175R
CO2 incubator Binder C 150
AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody Cell Signalling 9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb Cell Signalling 2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb Cell Signalling 2348S
NALM6  DSMZ ACC-128

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References

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Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation
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Welschinger, R., Bendall, L. J. Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization. J. Vis. Exp. (102), e52840, doi:10.3791/52840 (2015).More

Welschinger, R., Bendall, L. J. Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization. J. Vis. Exp. (102), e52840, doi:10.3791/52840 (2015).

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