Summary
Denne protokol beskriver anvendelsen af bromdeoxyuridin (BrdU) -optagelse at tillade den tidsmæssige sporing af celler, der var i S-fase på et bestemt tidspunkt. Tilsætning af DNA farvestoffer og antistof mærkning letter detaljeret analyse af skæbne S faseceller på senere tidspunkter.
Introduction
Vurderingen af cellecyklus funktioner og ændringer, der opstår i celler under cellecyklusprogression er fundamental for forståelsen mange aspekter af biologi, især kræft biologi. Mange agenter i udvikling til behandling af maligniteter har dybtgående virkninger på cellecyklusprogression eller fremkalde celledød via cellecyklus afhængige-mekanismer. For at studere cellecyklus dynamik eller celler i en bestemt fase af cellecyklussen, er det sædvanligt at synkronisere celler. Men synkronisering metoder kan have skadelige virkninger på cellerne blive undersøgt, potentielt confounding de opnåede resultater. 1 For nylig brug af fluorescens mærkede proteiner, der kun er til stede på bestemte faser af celler cyklus har tilladt analyse af cellecyklusprogression i enkelte celler over tid 2, men de celler, der skal undersøges behov for at blive genetisk manipuleret til at udtrykke disse mærkede proteiner, begrænser deres anvendelse til systemer, hvor dette kan læsesily opnået.
Cellecyklussen består af to aktive faser: syntesen (S) fase, hvor DNA replikeres og mitose (M), hvor celledeling finder sted. Disse faser er adskilt af tre gap faser, G 0, G 1 og G 2. G 0 eller hvile, er en hvilefase, hvor cellen har forladt cyklus, G 1 er hvor cellerne vokse i størrelse forud for DNA-replikation og G2, hvor cellevækst fortsætter mellem færdiggørelsen af DNA-replikation, men før celledeling. Den progression gennem cellecyklus kontrolleres af en række checkpoints. G 1 checkpoint aktiveres, når miljøforholdene ikke støtter af DNA-syntese og forhindrer indrejse i S-fasen. Den intra-S-fasen checkpoint eller forsinkelse kan udløses af DNA-skader, der kan resultere i gået i stå replikation gafler. Under G2 bekræftes nøjagtighed for de replikerede DNA og hvis der registreres skader derefter G 2 3 Aktivering af disse checkpoints er almindeligt anvendt til at synkronisere cellepopulationer. Cellecykluskontrolpunkter kan aktiveres af en række faktorer, men cancerbiologi de mest almindelige er detektion af DNA-beskadigelse. DNA skade responset initieres af PI3-kinase-lignende kinaser ataksi telangiectasia og Rad3 relateret (ATR) og ataksi telangiectasia muteret (ATM), der aktiverer de nedstrøms effektor kinaser Chk1 og Chk2 hhv. 3 En række arrangementer aktiverer Chk1 herunder gået i stå replikation gafler, DNA krydsbindinger og ultraviolet stråling skader, mens Chk2 primært aktiveres ved dobbelt-strenget pauser.
Den sædvanlige fremgangsmåde til at studere effekten af ændrede forhold af længden af cellecyklus is at synkronisere cellerne i en bestemt fase af cellecyklussen. 1 Dette kan opnås via adskillige fremgangsmåder. Celler kan adskilles fysisk baseret på størrelse, densitet, sidespredning (kornethed) og celleoverfladeekspression markører. Mere praktisk, kan celler synkroniseres med kemiske midler. Adskillige midler, såsom thymidin, hydroxyurea og cytosinarabinosid kan anvendes til at inhibere DNA-syntese i S-fasen af cellecyklus resulterer i en ophobning af celler i S-fase, som fortsætter cykle efter midlerne fjernes. Celler behandlet med nocodazol, som forhindrer dannelsen af den mitotiske spindel, arrest med en G 2 - eller M-fase-DNA-indhold. Eliminering af serum fra dyrkningsmediet resulterer i akkumulering af celler ved G 0 fase. Den fornyede tilsætning af næringsstofferne i kulturen serum igen starter den normale cykling af cellerne. Men alle disse synkroniseringsfremgangsmåder forstyrrer den normale cykling og vækst af celler og kan Result i signifikant celledød.
Synkronisering af akut lymfoblastisk leukæmi-celler er særligt udfordrende og disse celler ikke modtagelige for genetisk manipulation. Den her beskrevne fremgangsmåde tillader vurdering af cellecyklus dynamik og studiet af celler i bestemte faser af cellecyklus uden traditionel synkronisering eller gensplejsning. Denne metode kan også være nyttige til andre celletyper når genetisk modifikation og traditionelle synkronisering procedurer er ikke let opnås. Metoden er baseret på den lange etablerede brug af bromdeoxyuridin (BrdU) inkorporering, som har meget ringe indflydelse på den kortsigtede vækst og proliferation af celler. 4 Etablerede BrdU protokoller drage fordel af inkorporeringen af BrdU i nysyntetiseret DNA under S-fasen . Dette markerer permanent celler som har været i S-fase under BrdU eksponering. Denne population kan identificeres på senere tidspunkter ved farvning for BrdU incorporation og derved fungere som en synkroniseret population, der kan følges og evalueres over tid tillader undersøgelse af virkningen af stoffet på transit cellecyklus. BrdU skal udsættes før antistoffarvning, normalt opnået efter DNase eller syrebehandling. 6,7 Brug flowcytometri at opdage indarbejdet BrdU muliggør medtagelse af yderligere markører. Det vigtigste er brugen af farvestoffer til at måle DNA-indhold, hvilket muliggør vurdering af cellecyklusfase fordeling af cellerne, der var i S-fasen ved begyndelsen af studiet. 8 Endvidere ekstra overflade eller intracellulære antigener kan også undersøges. 9 Disse kan vedrøre cellecyklus begivenheder såsom Ki67 eller tilsyneladende uafhængige celle funktioner såsom apoptose markører som kløvet caspase-3. De potentielle anvendelser er begrænset af fantasien af investigator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen beskrevet her anvender akut lymfoblastisk leukæmi cellelinje NALM6 men kan anvendes på andre celletyper.
1. Løsninger og reagenser
- Komplet RPMI
- Tilføje 56 ml føtalt kalveserum (FCS) og 5,5 ml 200 mM L-glutamin til en 500 ml flaske RPMI-1640 medium.
- BrdU Stock Solution
- Forbered 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) i Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS).
- BrdU komplet RPMI
- Tilføj 6.2 pi BrdU stamopløsning til 10 ml komplet RPMI.
- DNase Solution
- Forbered 1 mg DNase / ml i DPBS.
- Farvning Buffer
- Forbered 3% varmeinaktiveret FCS og 0,09% natriumazid i DPBS.
- Se Materials List for definitioner af Fiksering Buffer, Permeabilisering Buffer og vaskebuffer.
2. Celler
Ingente: Celler ikke blev dyrket i mere end 6 måneder. Denne metode er direkte tilpasses til alle ikke-adhærerende cellelinje med tilpasninger celledensitet og dyrkningsmedier. Anvende celler, der vokser eksponentielt ved indledningen af forsøget.
- Bevar NALM6 celler i T-75 dyrkningskolber i Complete RPMI. Udfør alle trin under sterile betingelser ved anvendelse af en klasse II biosikkerhed kabinet.
- Opretholde NALM6 celler mellem 1-2 x 10 6 celler pr ml ved at opdele kulturen tre gange ugentligt.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 i luft.
3. Puls Mærkning af celler med BrdU
FORSIGTIG: Håndter BrdU med forsigtighed, da det er en potentiel mutagen og teratogent.
- Centrifuger cellerne ved 150 x g i 5 min. Bemærk: Overførsel af celler i frisk medier forbedrer reproducerbarheden af resultaterne.
- Udfør en celletælling og resuspender cellerne i Complete RPMI på 2 x 10 6 calen / ml.
- Fortynd celler i 1 2 med BrdU komplet RPMI fremstilling af en endelig cellekoncentration på 1 x 10 6 celler / ml.
- Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 i 45 minutter, derefter fortyndes cellerne 1 i 10 med komplet RPMI. Centrifuger cellerne ved 150 xg i 5 minutter og omhyggeligt kasseres alt af supernatanten.
- Resuspender celler i et lille volumen (~ 100 pi) af komplet RPMI, udføre en celletælling og justere til 1 x 10 6 celler / ml.
- Der afpipetteres 1 ml celler i brøndene på en 48 brønds plade. 1 ml af DPBS i enhver ubesatte brønde for at opnå mere reproducerbare resultater.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 i luft i de ønskede tidspunkter, her 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, og 24 timer. Bemærk: Den tid, vil afhænge af, hvad den eksperimentelle design har til formål at måle.
- Overfør alle cellerne i FACS-rør ved hjælp af en pipette. Skyl godt sekventielt med 1 ml volumes PBS til et endeligt samlet volumen på 5 ml.
- Centrifuger ved 150 xg i 5 minutter og forsigtigt fjerne al supernatanten. Celler er klar til farvning, udføre denne (afsnit 4) med det samme.
4. cellefarvning
Bemærk: hvis overflade farvning af celler er påkrævet udfører det før fiksering, der sikrer, at cellerne holdt ved 4 ° C hele vejen igennem.
- Resuspender celler i 100 pi farvning puffer (til valgfri overflade farvning, tilsæt den anbefalede mængde antistof til overflade-antigener og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C).
- Tilsæt 1 ml farvning buffer, centrifuge i 5 minutter ved 150 xg og kasser supernatanten.
Bemærk: Specifik antistof, koncentration, inkubationstid etc. vil variere afhængigt af specifikke eksperimentelle mål. - Fiksering og Permeabilisering
- Resuspender celler i 100 pi fiksering buffer og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 1 ml of vaskebuffer, centrifugeres i 5 minutter ved 150 xg og kasser supernatanten.
- Resuspender celler i 100 pi permeabilisering puffer og inkuberes cellerne i 10 minutter på is.
- Tilsæt 1 ml vaskebuffer, centrifuge i 5 minutter ved 150 xg, og kassér supernatanten.
- Resuspender celler i 100 pi fiksering buffer pr rør og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 1 ml vaskebuffer, centrifuge i 5 minutter ved 150 xg, og kassér supernatanten.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her, hvis det kræves. De fikserede celler er stabile i adskillige dage ved 4 ° C, hvis resuspenderet i farvningsbuffer. Fjern farvning buffer efter centrifugering før du fortsætter.
- DNase Behandling
- Resuspender celler i 100 pi DNase-opløsning (30 ug DNase / 10 6 celler) og inkuber cellerne i 1 time ved 37 ° C.
- Der tilsættes 1 ml vaskebuffer, centrifugeres ved 150 xg i 5 min og kassér supernatanten.
- Antistoffarvning
Bemærk: Farvning for andre end BrdU intracellulære markører kan udføres samtidigt med BrdU farvning.- VIGTIGT: Forbered kontrol bestående af ufarvede celler og celler mærket med hver enkelt fluorokrom kompensation. Ideelt set bruge de samme antistoffer til kontroller som dem, der anvendes i de eksperimentelle rør kompensation. Men hvis dette ikke er muligt, erstatte antistoffer mod højt udtrykte antigener konjugeret til det samme fluorochrom.
- Cellerne resuspenderes i 50 pi vaskepuffer, og der tilsættes 1 ul / 10 6 celler af BrdU-antistof. Bemærk: Direkte konjugerede antistoffer mod andre specifikke intracellulære antigener kan også tilsættes.
BEMÆRK:. Antistoffer mod histon H3 phosphoryleret på Ser10 kan bruges til at skelne mellem celler i G2 og M, histon H3 phosphoryleres på Ser10 under mitose 10 Antistoffer mod Cdc2 phosphoryleret på Tyr15 kan anvendes til at detektere celler, som HAVe forpligtet til mitose. 11 - Inkubér cellerne i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 1 ml vaskebuffer, centrifugeres celler ved 150 xg i 5 min og kassér supernatanten.
- Stain DNA til Cell Cycle Analysis
- Løsne pellet og tilsæt 20 ul af 7-AAD-opløsning (0,25 ug). Bemærk: Det er vigtigt at anvende en konstant mængde af 7-AAD / celle.
- Cellerne resuspenderes i 1 ml Farvning puffer.
5. Indsamling af flowcytometri data
Bemærk: Maskinen kræves vil afhænge af antallet og arten af de fluorokromer brugt.
- Saml de følgende parametre: FSC-A, SSC-A, FSC-H (FSC-W kan bruges i stedet for FSC-H) og 7-AAD fluorescens på en lineær skala. Saml APC-kanalen på en logaritmisk skala. Saml alle yderligere kanaler, der er nødvendige for vurderingen af overfladevand eller interne etiketter ved hjælp af en logaritmisk skala.
- Udfør comerstatning af overlappende signaler i emissionsspektrene observeret mellem forskellige fluorokromer før analysere prøverne. Bemærk: De fleste flowcytometre vil udføre dette automatisk.
- Saml mindst 10.000 begivenheder for hver prøve.
6. Analyse af flowcytometri data
Bemærk: FlowJo blev anvendt i denne undersøgelse til flowcytometri kan også anvendes dataanalyse men andre softwarepakker. Gating strategi er illustreret i figur 1.
- Identificere den levedygtige cellepopulation hjælp FSC-A og SSC-A parametre.
- Inden for denne population udelukke dubletter og aggregater anvender FSC-A og FSC-H (FSC-W kan også bruges her).
- Inden for denne population angive en dot-plot under anvendelse af 7-AAD på x-aksen og BrdU-APC på y-aksen.
Figur 1: Gating Strategy Venstre pa.nel: ubevogtede celler er vist på en FCS-A versus SSC-A dot plot. Den levedygtige cellepopulation identificeres ved porten vist. Center panel: celler gated fra venstre panel vises på en FSC-A vs. FSC-H dot plot (FSC-W kan bruges i stedet for højden). Dubletter og aggregater er identificeret, og udelukket af porten vist. Højre panel: celler gated fra dublet udelukkelse dato i midten panelet vises på en 7-AAD vs. APC-A dot plot. BrdU antistof er mærket med APC tillader identifikation af celler, der har inkorporeret BrdU under pulsen mærkning. 7-AAD indeholder oplysninger om DNA-indhold. Den øverste port definerer celler er positive for BrdU og derfor S-fasen ved tidspunktet for BrdU puls, den nederste venstre låge, celler i G 0/1 og det nederste højre låge dem i G2 / M. Klik her for at se en større udgave af dette tal.- Cellecyklus A NALYSE
- Åbne den første datafil og gate på cellerne i dublet udelukkelse gate.
- Analysere denne population for cellecyklus distribution (placeret under platforme i Flojo software) og bruge Dean-Jett-Fox model.
- Indhente holdninger G 0/1 og G 2 / M toppe ved hjælp skabe porte.
- Gate på BrdU positive celler og med forbehold denne population til samme celle cyklus analyse.
- Giv positionerne for G 0/1 og G 2 / M toppe ved at anvende de samme porte fra skaber porte og indstilling begrænsninger (ved hjælp af de oprettede gates) for holdninger G 0/1 og G 2 / M toppe. Dette er illustreret i de første 2 paneler af figur 2.
Bemærk: Andet software kan også anvendes til at analysere data og vejledningen vil variere i overensstemmelse hermed.
840 / 52840fig2highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 2:. Cellecyklusprogression Det første panel (alle celler) er gated på cellepopulationen defineret af dublet udelukkelse gate. Denne population blev vist i et histogram med 7-AAD på X-aksen. Toppen af G 0/1 top er angivet med pilen under aksen. I efterfølgende paneler BrdU-positive celler er blevet gated på som vist i figur 1. Værdien for G 0/1 position opnås, når gating af dubletten udelukkelse gate påføres BrdU-positive celler i gated FlowJo cellecyklus software. Hver efterfølgende panel blev gated på BrdU positive population som vist i figur 1 og positionen af G 0/1 peak baseret på den opnåede forbindelse med analysen af hele befolkningen, som vist i de første to paneler værdi. Brug af BrdU negative fraktion for at identificere placeringen af G 0/1 befolkning for BrdU positive celler i samme Sample kontrollerer for eventuelle små forskelle i intensiteten af DNA-farve mellem prøver. Den vises på hvert panel nummer repræsenterer tiden siden BrdU puls sluttede. De beregnede cellecyklus faser er vist i skyggefulde grønne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kan bruges denne metode til at opnå en række oplysninger. Enkelte programmer er skitseret her.
Bedømmelse af varigheden af cellecyklussen
At bestemme den tid, der kræves for celler til transit gennem cellecyklussen høstes celler til forskellige tidspunkter efter BrdU puls. Intervallerne mellem vurderingerne kan tilpasses de særlige celler, der analyseres. Hæmatopoietiske cellelinier blev vurderet hver time over en 24 timers periode i fravær af nogen lægemiddelbehandling at bestemme længden af cellecyklus faser under standard dyrkningsbetingelser. Figur 2 viser et udvalg af snapshot analyse af NALM6 celler over en 24 timers periode. Cellerne i S-fasen ved tidspunktet for BrdU puls (dvs. inden for BrdU positive gate i figur 1) skred gennem G2 / M, med en top af celler i denne fase af cellecyklussen bliver detekteret 10 timer efter BrdU pUlse. Andelen af BrdU-mærkede celler i S-fase nåede sit nadir 14 timer efter impulsen og næsten alle celler var vendt tilbage til G 1 efter 17 timer. Med 24 timers en andel af BrdU mærkede celler var reentered S fase som en del af deres næste cellecyklus indikerer, at celler kan fuldføre en cellecyklus inden 24 timer, dog mest endnu ikke trådt en anden runde af replikation, overensstemmelse med den kendte 36 hr fordoblingstid for disse celler.
Cellecyklusfordeling kan yderligere raffineres ved inddragelse af yderligere markører. Eksempelvis tilsætningen af et antistof mod histon H3 phosphoryleret på Ser10 (en markør for celler i mitose) tillader diskrimination af celler i mitose fra dem i G2 (venstre paneler af figur 3).
Figur 3: BekræftelseCell Cycle Stage Brug yderligere markører. De øvre paneler viser cellecyklus-analyse af celler fra BrdU positive gate som vist i figur 1. Cellerne blev inkuberet i nærvær eller fravær af 3 nM vincristin i 18 timer efter BrdU puls . Analysen cellecyklus blev udført som beskrevet i figur 2. De nederste paneler viser de samme celler på 7-AAD vs. Histone H3 phosphoryleres på Ser10 dot plot. Klik her for at se en større version af dette tal.
Vurdering af Drug Effects på Cell Cycle
Cytostatika kan have dybtgående virkninger på cellecyklus fremskridt og kan fremkalde celledød. Virkningen af lægemidler på cellecyklusprogression kan vurderes ved at tilsætte lægemidlerne af interesse efter BrdU puls. To eksempler er vist. Den første var en situation, hvor induktionen of celledød forvirrede analysen af cellecyklus data (højre paneler af figur 3). NALM6 cellerne var blevet eksponeret for 3 nM vincristin i 18 timer efter BrdU puls. Celler forventedes at arrestere i mitose som vincristin mål mikrotubuli. Analysen cellecyklus foreslog dog, at cellerne ikke havde anholdt, men i transit til G 0/1 (Figur 3 øverste højre panel). Tilsætningen af et antistof mod histon H3 phosphoryleret på Ser10 viste, at cellerne ikke havde forladt mitose (figur 3 nederste højre panel), trods en reduceret DNA-indhold. Det er sandsynligt, at DNA-indholdet blev reduceret, fordi cellerne undergår apoptose og var begyndt at nedbryde deres DNA. Da cellerne initieret apoptose under mitose (dvs. med 4N DNA), vises de som S-fasen eller G 0/1 celler i stedet for den typiske apoptotiske sub-G 1 top.
Figur 4:. Påvisning af Cell Cycle Stage specifikt drab Dot plots viser procentdelen af BrdU-positive celler er tilbage i kultur 24 timer efter BrdU puls. Cellerne var blevet dyrket i nærvær eller fravær af vehikel alene (kontrol), 1,5 eller 16 uM RAD001 siden slutningen af BrdU puls. Det nederste panel viser procentdelen af celler, som var BrdU positive over 24 timers inkubation. Klik her for at se en større version af dette tal.
I et andet eksempel, figur 4 viser, hvordan i nærvær af en lav koncentration af RAD001 (an mTOR inhibitor) celler var i stand til at fuldføre cellecyklussen, men derefter gennemgik en forsinkelse eller standsning i G 0/1. En højere koncentration af RAD001 stort set forhindret celler fra transiting igennem til G 0/1. Vigtigst celler i S-fase (dvs. BrdU positive) blev vist til fortrinsvis at forsvinde fra kultur, når RAD001 blev tilsat. Dette antyder, at celler passerer gennem G2 / M var mere modtagelige for celledød ved dette middel. 12
Det er også muligt at undersøge responser af celler i bestemte faser af cellecyklussen anvendelse af antistoffer mod specifikke antigener. I figur 5 aktiveringen af cellecyklus checkpoint kontrollerende proteiner Chk1 og Chk2 som respons på vincristin behandling er vist. Chk1 og Chk2 aktiveres ved phosphorylering på Ser345 og Thr68 hhv. Aktivering af Chk1 og Chk2 kan ses i celler, der synes at have en 2N DNA-indhold, men som vist i figur 5 vil sandsynligvis være celler i mitose, der har påbegyndt DNA-nedbrydning som følge af apoptose.
Det er muligt at tilsætte stoffer på forskellige tidspunkter efterBrdU puls at undersøge effekten af midlet på celler i forskellige faser af cellecyklussen.
Figur 5:. Detektion af ændringer til celler især cellecyklusfaser Den øverste panel viser celler gated på BrdU positive celler som i figur 1 i 7-AAD vs. phosphoryleret Chk1 (venstre) eller Chk2 (højre) dot plots. Cellerne havde været kultur i 18 timer efter BrdU impuls i nærvær eller fravær af 3 nM vincristin som for figur 3. De nederste paneler viser overlay histogrammer for de samme celler gatet på enten 2N eller 4N fraktion som angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til at analysere cellecyklussen er vigtig for forståelsen af cancer biologi og virkningsmekanismen af begge lægemidler og gener, der påvirker celleproliferation og vækst. Mens der er et væld af assays, der angiveligt måler celleproliferation, kun flertallet tilvejebringer et mål, der angiver antallet celler til stede. Disse omfatter assays, der måler celletal ved direkte visualisering og tælling, metabolisk aktivitet eller ATP-koncentration. Den største fordel ved mange af disse metoder er, at de er relativt let at udføre og modtagelig for mikropladeformater og automatisering, hvilket gør dem anvendelige til screening af store antal af tilstande eller forbindelser. En ulempe ved mange af disse metoder er, at celletab grund til døden ikke tages i betragtning, der kan føre til en undervurdering af celleproliferation. Også disse metoder måler hovedparten befolkning og ikke tillader studiet af enkelte celler eller transit af celler gennemcellecyklussen.
Af de almindeligt anvendte proliferationsassays, måske den mest pålidelige og nøjagtige er dem, der måler DNA-syntese. Traditionelle celleproliferationsassays inkuber cellerne for et par timer til natten over med 3H-thymidin, der er inkorporeret i nyligt syntetiseret DNA. 13 Det indlysende problem med denne fremgangsmåde er anvendelsen af radioaktive materialer, men en anden begrænsning er, at resultatet måler gennemsnittet proliferation af en population af celler. BrdU kan tilsvarende anvendes uden stråling spørgsmål, selv om der er behov for yderligere skridt, og BrdU er en potentiel mutagen. Imidlertid BrdU har den fordel at den er kompatibel med flowcytometri, hvilket tillader analyse af enkeltceller. 14 Andre flowcytometri kompatible metoder til vurdering celleproliferation på enkelt celle niveau indbefatter et stigende antal farvestoffer, som mærker cellemembranen eller cellulære proteiner ( f.eks CFSE), der deler mellem daughtER-celler, DNA-interkalerende farvestoffer og cellecyklus antigen påvisning af antistoffer. De bedste af celle mærkning farvestoffer tillader celledeling sporing over et antal celledelinger. 15 De giver et direkte mål for spredning, selv om ingen oplysninger om cellecyklus fase eller distribution er opnået. Målingen af DNA-indhold under anvendelse af DNA-interkalerende farvestoffer, såsom propidiumiodid eller 7-AAD levere stærke cellecyklusfordeling 16, men ikke tidsmæssig, data. Selv med vurderingen af forskellige tidspunkter er det fortsat umuligt at vurdere længden af cellecyklussen eller specifikke cellecyklusfaser. Cellecyklus-specifikke antigener kan anvendes til at vurdere cellecyklus fase i en usynkroniseret cellepopulation. Almindeligt anvendte cellecyklus specifikke antigener indbefatter Ki-67, 17, som er udtryk under S, G2 og M-faser af cellecyklus men ikke under G 0/1, PCNA (prolifererende cellekerneantigen) 18, og phosphorylering af histone H3. 19 Mens disse giver gode data om cellecyklus fase, oplysninger om cellecyklus dynamik mangler.
Indhentning data om cellecyklus dynamik er traditionelt blevet undersøgt ved at synkronisere celler ved anvendelse agenter eller dyrkningsbetingelser, der blokerer cellecyklusprogression. Dette medfører en ophobning af celler bag blokken, der engang fjernet, resultere i bølge af celler forløber sammen gennem cellecyklussen. 1 Beregningen af varigheden af cellecyklussen og længden af de forskellige faser cellecyklus er derefter muligt. Celler kan induceres til at forlade aktive cellecyklus ind G 0 af serum deprivation. Efter re-tilsætning af serum cellerne kan derefter flytte sammen i de efterfølgende faser. 20 Mens dette er en pålidelig metode til visse celletyper, andre, herunder mange transformerede celletyper, undlader at forlade cellecyklen og ofte undergår celledød som et resultat. 21. Faktisk vores studør fundet dette at være tilfældet for akut lymfoblastær leukæmi celler. Endvidere vil celler ofte undlader at indtaste cellecyklus i en tilstrækkeligt synkroniseret måde. Kemiske metoder kan anvendes til at inducere cellecyklusstandsning ved specifikke faser af cellecyklussen. For eksempel midler, der forhindrer DNA-syntese (f.eks overskydende thymidin) eller forebygge den mitotiske spindel dannelse (f.eks nocodazol) standser celler i S og M-faser henholdsvis, men er giftige og kan resultere i vækstforstyrrelser og endda død i en betydelig del af den celler. 22 i alle celler disse metoder undlod at arrestere de fleste celler uden at dræbe en signifikant fraktion. Betragtning af, at målet var at vurdere virkningerne af en potentiel anti-leukæmiske agent på cellecyklus parametre cellen død som følge af synkronisering var uacceptabel. Til trods for beskrivelsen af en lang række metoder til at synkronisere celler, alle har mangler. De største problemer er: en utilstrækkeligberigelse for celler i den ønskede del af cellecyklussen, forstyrrelser af den normale fysiologi af cellecyklussen eller, som observeret, overskydende toksicitet.
Den her beskrevne metode er en simpel forlængelse af længe brugt puls-systemet, hvor cellerne inkuberes i en kort periode med BrdU at identificere celler i S-fase. Vi fandt en 45 min puls at være optimal i vores system, men kortere perioder kan anvendes, hvis der opnås tilstrækkelig mærkning. Ved fortsat at dyrke celler efter fjernelse af BrdU er det muligt at spore deres progression gennem den resterende del af S-fasen, G2, mitose, G 1 og adgang til den næste cellecyklus. Det kan være muligt at følge cellerne yderligere. Fordelen ved dette system er, at der ikke er nogen tegn på toksicitet til cellerne i tidsrammen for disse forsøg, og der er minimal forstyrrelse af cellernes vækst, som kun et par medieændringer er påkrævet. Cellerne ellers holdes i contigennemgå ende kultur. Den flowcytometri baseret natur af fremgangsmåden betyder, at det kan kombineres med identifikation af cellesubpopulationer med yderligere overflade eller intracellulær farvning. Vi brugte APC konjugerede BrdU antistoffer, men andre konjugater kan erstattes at fremme udviklingen af antistof paneler. Vi anvendte 7-AAD stedet propidiumiodid fordi 7-AAD fluorescerer i en enkelt kanal maksimere muligheder for flerfarvet farvning. Tilsvarende DAPI eller Hoechst kan anvendes som DNA-pletter, men kræver en UV-laser. Strammere CV for DNA-farvning kan opnås under anvendelse af ethanol fiksering men dette ofte kompromitterer antistof-farvning, hvilket begrænser mulighederne for yderligere overflade eller cytoplasmatiske pletter. Den største ulempe er, at S fase varer ca. 8 timer, så mærkede celler kan har netop indgået eller ved at forlade S fase under pulsen periode. Som følge heraf synkroniseringen ikke er så stramt som med visse andre systemer. Men ved at kombinere BrdU mærkning med farvestoffer angiver DNAindhold og antistoffer mod specifikke cellecyklus-afhængige proteiner, kan opnås stærke data.
For at opnå konsekvent data er det vigtigt at sikre, at cellerne er ved den korrekte koncentration og at cellekoncentrationen er konsekvent blandt alle de betingelser, der sammenlignes. Kritisk lysstyrken af 7-AAD farvningen er meget følsom over for cellekoncentration. Ved hjælp af et automatiseret celletælling systemet kan hjælpe med at sikre, at cellekoncentrationer er konsekvente i alle prøver på hvert trin i processen. Et andet vigtigt punkt er den tid cellerne udsættes for BrdU. Små variationer kan oversætte til betydelige forskelle, så det er vigtigt, at alle prøver inkuberes med BrdU for præcis samme tid. Endelig er det vigtigt at titrere antistoffer for at opnå optimal farvning og dette bør gentages, når en batch ændres. Hvis alle trinene følges konsekvent og cellekoncentrationer holdes konstant så dette method vil pålideligt muliggøre sporing af celler gennem cellecyklussen uden behov for synkronisering. Der er også store muligheder for at ændre denne metode, der passer til bestemte celletyper og behandle specifikke spørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150 cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200 µl | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1 ml | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
References
- Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Harper, J. W., Elledge, S. J. The DNA damage response: ten years after. Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).
- Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218, 474-475 (1982).
- Carayon, P., Bord, A. Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA. Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).
- Gonchoroff, N. J., et al. S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment. Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).
- Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells. Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).
- Hendzel, M. J., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106, 348-360 (1997).
- Draetta, G., Beach, D. Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement. Cell. 54, 17-26 (1988).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. , (2012).
- Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester. Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).
- Beck, H. P. Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine. Cytometry. 2, 170-174 (1981).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells. Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).
- Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67. Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).
- Danova, M., et al. Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors. Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).
- Juan, G., et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry. 32, 71-77 (1998).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).
- Kues, W. A., et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).
- Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization. Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).
