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Biology

तुल्यकालन के लिए आवश्यकता के बिना फ्लो का प्रयोग कोशिका चक्र प्रगति के टेम्पोरल ट्रैकिंग

doi: 10.3791/52840 Published: August 16, 2015

Summary

इस प्रोटोकॉल के समय में एक विशिष्ट बिंदु पर एस चरण में थे कि कोशिकाओं के अस्थायी नज़र रखने की अनुमति देने के लिए bromodeoxyuridine (BrdU) तेज के उपयोग का वर्णन। डीएनए रंगों और एंटीबॉडी लेबलिंग के अलावा बाद में समय पर एस चरण कोशिकाओं के भाग्य का विस्तृत विश्लेषण की सुविधा।

Introduction

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कोशिका चक्र प्रगति के दौरान सेल चक्र सुविधाओं और कोशिकाओं में होने वाले परिवर्तनों का आकलन जीव विज्ञान, विशेष रूप से कैंसर जीव विज्ञान के कई पहलुओं को समझने के लिए मौलिक है। कैंसर के उपचार के लिए विकास में कई एजेंटों कोशिका चक्र प्रगति पर गहरा प्रभाव पड़ता है या सेल चक्र निर्भर-तंत्र के माध्यम से कोशिका मृत्यु प्रेरित। सेल चक्र के एक विशेष चरण में सेल चक्र गतिशीलता या कोशिकाओं का अध्ययन करने के क्रम में, यह कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने के लिए सामान्य है। हालांकि तुल्यकालन तरीकों के संभावित परिणामों को प्राप्त confounding, अध्ययन किया जा रहा कोशिकाओं पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है। 1 समय के साथ एकल कक्षों में कोशिका चक्र प्रगति की हाल ही में कोशिकाओं चक्र की विशेष चरणों में ही मौजूद हैं कि fluorescently टैग प्रोटीन के उपयोग की अनुमति दी है विश्लेषण 2, हालांकि कोशिकाओं आनुवंशिक रूप से इस पढ़ा जा सकता है, जहां सिस्टम के लिए उनके उपयोग को सीमित करने के लिए, निम्न टैग प्रोटीन व्यक्त करने के लिए चालाकी से किया जा करने की आवश्यकता के लिए अध्ययन किया जाily हासिल की।

संश्लेषण (एस) चरण, डीएनए दोहराया और पिंजरे का बँटवारा (एम) जहां कोशिका विभाजन जगह लेता कहां है: सेल चक्र दो सक्रिय चरणों के होते हैं। इन चरणों तीन अंतराल के चरणों, जी 0, जी 1 और 2 जी से अलग हो रहे हैं। कोशिकाओं के आकार में पूर्व सेल के विकास के डीएनए प्रतिकृति के पूरा होने के बीच है, लेकिन कोशिका विभाजन से पहले जारी है जहां डीएनए प्रतिकृति और जी 2 को बढ़ाने के लिए जहां जी 0 या निष्क्रियता है, कोशिका चक्र छोड़ दिया है, जहां एक आराम चरण है, जी 1 है। सेल चक्र के माध्यम से प्रगति चौकियों की संख्या से नियंत्रित किया जाता है। पर्यावरण की स्थिति डीएनए संश्लेषण का समर्थन नहीं कर रहे हैं और एस चरण में प्रवेश को रोकता है जब जी 1 चौकी सक्रिय है। इंट्रा-एस चरण चौकी या देरी ठप प्रतिकृति कांटे में हो सकता है कि डीएनए की क्षति से चालू किया जा सकता है। क्षति जी 2 तब पता चला है कि अगर जी 2 के दौरान दोहराया डीएनए की निष्ठा की पुष्टि की और है 3 एक्टिवेशन सामान्यतः सेल आबादी सिंक्रनाइज़ करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सेल चक्र चौकियों कारकों में से एक नंबर के द्वारा लेकिन सबसे आम डीएनए की क्षति का पता लगाने है कैंसर जीव विज्ञान में सक्रिय किया जा सकता है। डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया (एटीआर) से संबंधित PI3-kinase की तरह kinases गतिभंग telangiectasia और Rad3 द्वारा शुरू की और गतिभंग telangiectasia (एटीएम) क्रमश: नीचे की ओर प्रेरक kinases Chk1 और Chk2 को सक्रिय कि उत्परिवर्तित है। 3 घटनाओं की एक श्रृंखला ठप सहित Chk1 सक्रिय हो जाता है प्रतिकृति कांटे, डीएनए crosslinks, और पराबैंगनी विकिरण क्षति Chk2 मुख्य रूप से डबल कतरा टूटता द्वारा सक्रिय किया जाता है।

सेल चक्र मैं की लंबाई पर बदल स्थितियों के प्रभाव के अध्ययन के लिए सामान्य विधिसेल चक्र के एक विशेष चरण में कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने के लिए। 1 यह कई तरीके के माध्यम से हासिल किया जा सकता है। प्रकोष्ठों शारीरिक रूप से आकार, घनत्व, पक्ष तितर बितर (विघटन), और कोशिका की सतह अभिव्यक्ति मार्करों के आधार पर अलग किया जा सकता है। अधिक व्यावहारिक, कोशिकाओं रासायनिक तरीकों से सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है। ऐसे thymidine, hydroxyurea और साइटोसिन arabinoside के रूप में कई एजेंटों एजेंटों को हटा रहे हैं के बाद साइकिल चलाना जारी रखने के लिए जो एस चरण में कोशिकाओं का एक संग्रह में जिसके परिणामस्वरूप सेल चक्र के एस चरण में डीएनए संश्लेषण को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। या एम चरण डीएनए सामग्री - प्रकोष्ठों एक जी 2 के साथ mitotic धुरी के गठन, गिरफ्तारी को रोकता है जो nocodazole, के साथ इलाज किया। जी 0 चरण में कोशिकाओं के संचय में संस्कृति के माध्यम परिणामों से सीरम का उन्मूलन। संस्कृति सीरम भीतर पोषक तत्वों की पुन: इसके अलावा कोशिकाओं के सामान्य साइकिल चलाना फिर से शुरू होता है। हालांकि, इन तुल्यकालन तरीकों के सभी कोशिकाओं के सामान्य साइकिल चलाना और विकास के साथ हस्तक्षेप और resul कर सकते हैंमहत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु में टी।

तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं के तुल्यकालन विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है और इन कोशिकाओं आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। यहाँ वर्णित विधि सेल चक्र की गतिशीलता के आकलन और पारंपरिक तुल्यकालन या आनुवंशिक संशोधन के बिना सेल चक्र की विशेष चरणों में कोशिकाओं के अध्ययन परमिट। इस पद्धति का भी आनुवंशिक संशोधन और पारंपरिक तुल्यकालन प्रक्रियाओं को आसानी से हासिल नहीं कर रहे हैं, जहां अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए उपयोगी हो सकता है। विधि कोशिकाओं की छोटी अवधि के विकास और प्रसार पर बहुत कम प्रभाव पड़ता है जो bromodeoxyuridine (BrdU) निगमन, की लंबे समय की स्थापना के उपयोग पर आधारित है। 4 स्थापित BrdU के प्रोटोकॉल एस चरण के दौरान नए संश्लेषित डीएनए में BrdU के समावेश का लाभ उठा । यह स्थायी रूप से BrdU के प्रदर्शन के दौरान एस चरण में होने के रूप में कोशिकाओं के निशान। इस आबादी BrdU के incorpor के लिए धुंधला द्वारा बाद में समय बिंदुओं पर पहचाना जा सकता हैसमझना और इस तरह पालन किया है और कोशिका चक्र पारगमन पर दवा प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देने के समय के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है कि एक सिंक्रनाइज़ जनसंख्या के रूप में काम करते हैं। BrdU आमतौर पर DNase या एसिड इलाज के बाद हासिल की है, पूर्व एंटीबॉडी धुंधला को उजागर करने की जरूरत है। 6,7 शामिल किया BrdU के अतिरिक्त मार्करों के शामिल किए जाने के लिए सक्षम बनाता है पता लगाने के लिए प्रवाह cytometry का उपयोग। सबसे महत्वपूर्ण अध्ययन के शुरू में एस चरण में थे कि कोशिकाओं के कोशिका चक्र चरण वितरण के आकलन को सक्षम करने, डीएनए सामग्री को मापने के लिए रंगों का इस्तेमाल होता है। 8 इसके अलावा अतिरिक्त सतह या intracellular एंटीजन का भी अध्ययन किया जा सकता है। 9 इन ऐसे Ki67 के रूप में सेल चक्र की घटनाओं से संबंधित हैं या इस तरह के cleaved कस्पासे 3 की तरह एपोप्टोसिस मार्कर के रूप में करने के लिए असंबंधित प्रतीत होता है सेल सुविधाओं हो सकता है। संभावित अनुप्रयोगों अन्वेषक की कल्पना द्वारा सीमित हैं।

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Protocol

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यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया सेल लाइन NALM6 का उपयोग करता है, लेकिन अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है।

1. समाधान और अभिकर्मकों

  1. पूरा RPMI
    1. 56 मिलीलीटर भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) और RPMI-1640 के माध्यम से एक 500 मिलीलीटर की बोतल के लिए 5.5 मिलीलीटर 200 मिमी के एल glutamine जोड़ें।
  2. BrdU के स्टॉक समाधान
    1. है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) में 32.5 मिमी BrdU (10 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें।
  3. BrdU के पूरा RPMI
    1. पूरा RPMI के 10 मिलीलीटर BrdU के शेयर समाधान के 6.2 μl जोड़ें।
  4. DNase समाधान
    1. 1 मिलीग्राम DNase / DPBS में मिलीलीटर तैयार करें।
  5. धुंधला बफर
    1. DPBS में 3% गर्मी निष्क्रिय एफसीएस और 0.09% सोडियम azide तैयार करें।
  6. निर्धारण बफर, Permeabilization बफर और धो बफर की परिभाषा के लिए सामग्री की सूची को देखें।

2. प्रकोष्ठों

नहींते: प्रकोष्ठों 6 महीने की तुलना में अधिक के लिए सभ्य नहीं थे। इस विधि सेल घनत्व और संस्कृति मीडिया के लिए समायोजन के साथ किसी भी गैर-पक्षपाती सेल लाइन के लिए सीधे अनुकूलनीय है। प्रयोग की दीक्षा में तेजी से बढ़ रहे हैं कि कोशिकाओं का उपयोग करें।

  1. पूरा RPMI में टी -75 संस्कृति बोतल में NALM6 कोशिकाओं को बनाए रखने। एक द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग कर बाँझ शर्तों के तहत सभी चरणों को पूरा करें।
    1. तीन बार साप्ताहिक संस्कृति बंटवारे से मिलीलीटर प्रति 6 से 10 एक्स 1-2 के बीच कोशिकाओं NALM6 कोशिकाओं को बनाए रखने।
    2. हवा में सीओ 2 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

BrdU के साथ कोशिकाओं के 3. पल्स लेबलिंग

चेतावनी: यह एक संभावित उत्परिवर्तजन और अपरूपजनन ही सावधानी के साथ BrdU संभाल लेना।

  1. 5 मिनट के लिए 150 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। नोट: ताजा मीडिया में कोशिकाओं स्थानांतरण परिणामों के reproducibility में सुधार।
  2. 2 एक्स 10 6 सेल्सियस पर पूरा RPMI में एक कोशिका गिनती और resuspend कोशिकाओं को पूरा करेंएल / मिली।
  3. BrdU के पूरा RPMI 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम सेल एकाग्रता के उत्पादन के साथ 2 में 1 कोशिकाओं पतला।
  4. तो पूरा RPMI के साथ 10 में कोशिकाओं 1 पतला, 45 मिनट के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। ध्यान से 150 5 मिनट के लिए XG और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं सतह पर तैरनेवाला के सभी त्यागें।
  5. पूरा RPMI की एक छोटी मात्रा (~ 100 μl) में Resuspend कोशिकाओं, एक कोशिका गिनती प्रदर्शन और 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के लिए समायोजित करें।
  6. पिपेट एक 48 अच्छी तरह से थाली के कुओं में कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर। किसी भी खाली कुओं में DPBS के पिपेट 1 मिलीलीटर अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए।
  7. 17 यहां वांछित timepoints, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 के लिए हवा में 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2 सेते , 18, 19, 20, 21, 22, 23, और 24 घंटा। नोट: समय की लंबाई प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए उपाय करना है पर निर्भर करेगा।
  8. एक विंदुक का उपयोग FACS ट्यूबों में सभी कोशिकाओं स्थानांतरण। 1 मिलीलीटर volu के साथ अच्छी तरह से क्रमिक रूप से कुल्ला5 मिलीलीटर की एक अंतिम कुल मात्रा के लिए पीबीएस के एमईएस।
  9. 5 मिनट के लिए 150 XG पर अपकेंद्रित्र और ध्यान से सभी सतह पर तैरनेवाला हटा दें। सेल, धुंधला के लिए तैयार कर रहे हैं इस तुरंत (धारा 4) प्रदर्शन करते हैं।

4. सेल धुंधला

नोट: कोशिकाओं की सतह धुंधला आवश्यक है, तो कोशिकाओं भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है, यह सुनिश्चित करना निर्धारण करने से पहले यह प्रदर्शन करते हैं।

  1. धुंधला बफर के 100 μl में Resuspend कोशिकाओं (वैकल्पिक सतह धुंधला के लिए, एंटीजन सतह और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं एंटीबॉडी की सिफारिश की मात्रा जोड़ने)।
  2. 150 XG पर 5 मिनट के लिए धुंधला बफर के 1 मिलीलीटर, अपकेंद्रित्र जोड़ें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    नोट: आदि विशिष्ट एंटीबॉडी, एकाग्रता, ऊष्मायन समय विशिष्ट प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर अलग अलग होंगे।
  3. फिक्सेशन और Permeabilization
    1. निर्धारण बफर के 100 μl में कोशिकाओं Resuspend और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. 1 मिलीलीटर ओ जोड़ेंएफ धोने बफर, 150 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    3. Permeabilization के बफर के 100 μl में कोशिकाओं Resuspend और बर्फ पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    4. 150 XG पर 5 मिनट के लिए धोने बफर के 1 मिलीलीटर, अपकेंद्रित्र जोड़ें, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    5. ट्यूब प्रति निर्धारण बफर के 100 μl में कोशिकाओं Resuspend और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    6. 150 XG पर 5 मिनट के लिए धोने बफर के 1 मिलीलीटर, अपकेंद्रित्र जोड़ें, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      नोट: यदि जरूरी हुआ तो प्रोटोकॉल यहां रुका हुआ जा सकता है। धुंधला बफर में resuspended अगर तय कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर कई दिनों के लिए स्थिर रहे हैं। आगे बढ़ने से पहले Centrifugation के बाद धुंधला बफर निकालें।
  4. DNase उपचार
    1. DNase समाधान के 100 μl (30 DNase / 10 6 कोशिकाओं की माइक्रोग्राम) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते में Resuspend कोशिकाओं।
    2. 5 मिनट के लिए 150 XG पर धो बफर, सेंट्रीफ्यूज के 1 मिलीलीटर जोड़ें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    3. एंटीबॉडी धुंधला
      नोट: BrdU के अलावा अन्य इंट्रासेल्युलर मार्करों के लिए धुंधला BrdU धुंधला के साथ एक साथ किया जा सकता है।
      1. महत्वपूर्ण: प्रत्येक एकल fluorochrome के साथ लेबल बेदाग कोशिकाओं और कोशिकाओं से मिलकर मुआवजा नियंत्रण तैयार करें। आदर्श रूप में, प्रयोगात्मक ट्यूबों में इस्तेमाल उन लोगों के रूप में मुआवजा नियंत्रण के लिए एक ही एंटीबॉडी का उपयोग करें। यह संभव नहीं है, तो हालांकि, अत्यधिक व्यक्त एंटीजन को स्थानापन्न एंटीबॉडी वही fluorochrome संयुग्मित।
      2. धोने बफर के 50 μl में कोशिकाओं Resuspend और 1 μl / BrdU के एंटीबॉडी के 10 6 कोशिकाओं जोड़ें। नोट: अन्य विशिष्ट इंट्रासेल्युलर एंटीजन को सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी भी जोड़ा जा सकता है।
        नोट:। Cdc2 को Ser10 पर phosphorylated हिस्टोन H3 के लिए एंटीबॉडी G2 और एम में कोशिकाओं के बीच विभेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हिस्टोन H3 के पिंजरे का बँटवारा दौरान Ser10 पर phosphorylated है 10 एंटीबॉडी हवलदार कि कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है Tyr15 पर phosphorylatedई पिंजरे का बँटवारा करने के लिए प्रतिबद्ध है। 11
      3. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
      4. 5 मिनट के लिए 150 XG पर 1 धो बफर के मिलीलीटर, अपकेंद्रित्र कोशिकाओं जोड़ें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    1. कोशिका चक्र विश्लेषण के लिए दाग डीएनए
      1. गोली ढीला और 7 AAD समाधान (0.25 माइक्रोग्राम) के 20 μl जोड़ें। नोट: यह 7 AAD / सेल की एक निरंतर राशि का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है।
      2. धुंधला बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend।

    फ्लो डाटा 5. संग्रह

    नोट: इस्तेमाल किया fluorochromes की संख्या और प्रकृति पर निर्भर करेगा आवश्यक मशीन।

    1. निम्नलिखित मानकों लीजिए: एफएससी-ए, एसएससी-ए, एफएससी-एच एक रैखिक पैमाने पर और 7 AAD प्रतिदीप्ति (एफएससी-W के बजाय एफएससी-एच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है)। एक प्रवेश पैमाने पर एपीसी चैनल लीजिए। एक प्रवेश पैमाने का उपयोग कर सतह या आंतरिक लेबल के मूल्यांकन के लिए आवश्यक कोई अतिरिक्त चैनलों के लिए ले लीजिए।
    2. कॉम सम्पन्ननमूनों का विश्लेषण करने से पहले विभिन्न fluorochromes के बीच मनाया उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में संकेतों ओवरलैपिंग की घटनाएं। नोट: अधिकांश प्रवाह cytometers स्वचालित रूप से इस प्रदर्शन करेंगे।
    3. प्रत्येक नमूने के लिए कम से कम 10,000 घटनाओं लीजिए।

    फ्लो डाटा 6. विश्लेषण

    नोट: डेटा विश्लेषण लेकिन अन्य सॉफ्टवेयर संकुल का भी इस्तेमाल किया जा सकता है cytometry के FlowJo प्रवाह के लिए इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था। gating रणनीति चित्रा 1 में सचित्र है।

    1. एफएससी-ए और एसएससी-ए मापदंडों का उपयोग व्यवहार्य सेल की आबादी को पहचानें।
    2. इस आबादी के भीतर दोहरी और (यहां इस्तेमाल किया जा सकता है एफएससी-डब्ल्यू) एफएससी-ए और FSC-एच का उपयोग कर समुच्चय को छोड़ दें।
    3. इस आबादी के भीतर Y अक्ष पर एक्स-अक्ष और BrdU-एपीसी पर 7 AAD का उपयोग कर एक डॉट साजिश निर्धारित किया है।

    चित्र 1
    चित्रा 1: Gating रणनीति वाम देहात।नेल: ungated कोशिकाओं एसएससी-ए डॉट साजिश बनाम एक एफसीएस-ए पर दिखाए जाते हैं। व्यवहार्य सेल की आबादी दिखाया गेट से पहचाना जाता है। केंद्र पैनल: वाम पैनल से gated कोशिकाओं एफएससी-एच डॉट साजिश (बजाय ऊंचाई का इस्तेमाल किया जा सकता है FSC डब्ल्यू) बनाम एक एफएससी-ए पर दिखाए जाते हैं। दोहरी और समुच्चय पहचान और दिखाया गेट से बाहर रखा गया है। राइट पैनल: केंद्र पैनल में नक़ल बहिष्कार तारीख से gated कोशिकाओं एपीसी-ए डॉट साजिश बनाम एक 7 एएडी पर दिखाए जाते हैं। BrdU एंटीबॉडी एपीसी पल्स लेबलिंग के दौरान BrdU शामिल किया है कि कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देने के साथ लेबल है। 7 AAD डीएनए सामग्री के बारे में जानकारी प्रदान करता है। ऊपरी फाटक BrdU के नाड़ी, निचले बाएँ गेट, कोशिकाओं जी 0/1 में और जी में उन लोगों के निचले सही फाटक के समय एस चरण में इसलिए BrdU के लिए सकारात्मक और कोशिकाओं को परिभाषित करता है / एम 2। एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण।

    1. सेल चक्र एक nalysis
      1. नक़ल बहिष्कार गेट में कोशिकाओं पर पहली डेटा फ़ाइल और फाटक खुला।
      2. (FloJo सॉफ्टवेयर में प्लेटफार्मों के अंतर्गत स्थित) कोशिका चक्र वितरण के लिए इस आबादी का विश्लेषण करें और डीन-जेट-फॉक्स मॉडल का उपयोग करें।
      3. जी 0/1 और जी फाटक बनाने का उपयोग कर 2 / एम चोटियों का पद प्राप्त करते हैं।
      4. BrdU सकारात्मक कोशिकाओं और इस विषय पर गेट एक ही सेल चक्र विश्लेषण करने के लिए इस आबादी।
      5. बनाने के द्वार से एक ही फाटकों को लागू करने और जी 0/1 और जी 2 / एम चोटियों के पदों के लिए (बनाया फाटकों का उपयोग) की कमी की स्थापना करके जी 0/1 और जी 2 / एम चोटियों के लिए पदों प्रदान करें। यह आंकड़ा 2 के पहले 2 पैनल में सचित्र है।
        नोट: अन्य सॉफ्टवेयर भी डेटा का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और निर्देश तदनुसार अलग अलग होता है।

    840 / 52840fig2highres.jpg "चौड़ाई =" 700 "/>
    चित्रा 2:। कोशिका चक्र प्रगति पहली पैनल (सभी प्रकोष्ठों) नक़ल बहिष्कार गेट से परिभाषित सेल की आबादी पर gated है। इस आबादी X- अक्ष पर 7 AAD के साथ एक हिस्टोग्राम में प्रदर्शित किया गया था। जी 0/1 चोटी के शिखर अक्ष नीचे तीर द्वारा संकेत दिया है। चित्र 1 में दिखाया के रूप में बाद के पैनल में BrdU सकारात्मक कोशिकाओं पर gated किया गया है। नक़ल बहिष्कार फाटक के gating प्राप्त जब जी 0/1 स्थिति के लिए मूल्य FlowJo सेल चक्र सॉफ्टवेयर के भीतर BrdU के सकारात्मक gated कोशिकाओं को लागू किया जाता है। चित्रा 1 और पहले दो पैनलों में दिखाया गया के रूप में पूरी आबादी का विश्लेषण करते समय प्राप्त मूल्य के आधार पर जी 0/1 चोटी की स्थिति में दिखाया गया के रूप में प्रत्येक बाद पैनल BrdU के सकारात्मक जनसंख्या पर gated किया गया था। एक ही samp में BrdU सकारात्मक कोशिकाओं के लिए जी 0/1 आबादी के स्थान की पहचान करने के लिए BrdU के नकारात्मक अंश का प्रयोगLe नमूनों के बीच डीएनए दाग की तीव्रता में कोई मामूली अंतर के लिए नियंत्रित करता है। प्रत्येक पैनल पर दिखाया संख्या BrdU पल्स समाप्त हो गया क्योंकि समय का प्रतिनिधित्व करता है। गणना सेल चक्र चरणों छायांकित हरे रंग में दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

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इस पद्धति के बारे में जानकारी की एक सीमा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कुछ अनुप्रयोगों यहाँ रेखांकित कर रहे हैं।

सेल चक्र की अवधि का आकलन

सेल चक्र के माध्यम से पारगमन के लिए कोशिकाओं के लिए आवश्यक समय को निर्धारित करने के लिए, कोशिकाओं BrdU के नाड़ी निम्नलिखित विभिन्न समय बिंदुओं पर खेती कर रहे हैं। आकलन के बीच अंतराल विश्लेषण किया जा रहा विशेष कोशिकाओं को रूपांतरित किया जा सकता है। Hematopoietic सेल लाइनों मानक संस्कृति की शर्तों के तहत सेल चक्र चरणों की लंबाई निर्धारित करने के लिए किसी भी दवा इलाज के अभाव में एक 24 घंटा अवधि में हर घंटे का मूल्यांकन किया गया। 2 एक 24 घंटा अवधि में NALM6 कोशिकाओं का स्नैपशॉट विश्लेषण की एक चयन से पता चलता है। BrdU के पी के बाद 10 घंटे का पता चला है (यानी चित्र 1 में BrdU के सकारात्मक फाटक के भीतर) BrdU के नाड़ी के समय एस चरण में कोशिकाओं की जा रही कोशिका चक्र के उस दौर में कोशिकाओं के एक चोटी के साथ, जी 2 / एम के माध्यम से प्रगतिulse। एस चरण में BrdU के लेबल की कोशिकाओं के अनुपात नाड़ी के बाद अपनी नादिर 14 घंटा पहुंच गया और लगभग सभी कोशिकाओं को 17 घंटे के बाद जी 1 से लौटा था। 24 घंटा तक BrdU के लेबल की कोशिकाओं के अनुपात लेकिन अधिकांश अभी तक 36 से जाना जाता है के साथ संगत प्रतिकृति के दूसरे दौर में प्रवेश किया, नहीं था कोशिकाओं, 24 घंटा के भीतर एक कोशिका चक्र पूरा कर सकते हैं यह दर्शाता है कि उनके अगले सेल चक्र के हिस्से के रूप में एस चरण reentered था इन कोशिकाओं के लिए समय दोहरीकरण घंटा।

कोशिका चक्र वितरण आगे अतिरिक्त मार्करों के शामिल किए जाने से परिष्कृत किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, Ser10 पर phosphorylated हिस्टोन H3 (पिंजरे का बँटवारा में कोशिकाओं के एक मार्कर) के लिए एक एंटीबॉडी के अलावा जी 2 में उन लोगों से पिंजरे का बँटवारा में कोशिकाओं के भेदभाव परमिट (चित्रा 3 के पैनल छोड़ दिया)।

चित्र तीन
चित्रा 3: की पुष्टिसेल चक्र स्टेज के अतिरिक्त मार्कर का उपयोग। चित्रा 1 में दिखाया गया के रूप में ऊपरी पैनल BrdU के सकारात्मक गेट से कोशिकाओं की कोशिका चक्र विश्लेषण दिखाते हैं। कोशिकाओं BrdU के नाड़ी के बाद 18 घंटे के लिए 3 एनएम विन्क्रिस्टाईन की उपस्थिति या अनुपस्थिति में incubated किया गया था । चित्रा 2 में वर्णित के रूप में सेल चक्र विश्लेषण का आयोजन किया गया था। कम पैनल Ser10 डॉट भूखंड पर phosphorylated हिस्टोन H3 बनाम 7 AAD पर एक ही कोशिकाओं को दिखाते हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कोशिका चक्र पर दवा प्रभाव का आकलन

साइटोटोक्सिक एजेंटों कोशिका चक्र प्रगति पर गहरा प्रभाव हो सकता है और कोशिका मृत्यु के लिए प्रेरित कर सकते हैं। कोशिका चक्र प्रगति पर दवाओं के प्रभाव BrdU के नाड़ी निम्न ब्याज की दवाओं को जोड़ने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। दो उदाहरण दिखाए जाते हैं। पहले एक स्थिति ऐसी थी जहां प्रेरण ओएफ कोशिका मृत्यु सेल चक्र आंकड़ों के विश्लेषण (चित्रा 3 की सही पैनल) चकित। NALM6 कोशिकाओं BrdU के नाड़ी के बाद 18 घंटे के लिए 3 एनएम विन्क्रिस्टाईन को उजागर किया गया था। प्रकोष्ठों विन्क्रिस्टाईन लक्ष्य सूक्ष्मनलिकाएं के रूप में पिंजरे का बँटवारा में गिरफ्तार करने के लिए उम्मीद की गई थी। हालांकि सेल चक्र विश्लेषण कोशिकाओं को गिरफ्तार कर लिया है, लेकिन जी 0/1 (चित्रा 3 ऊपरी सही पैनल) के माध्यम से transited नहीं था कि सुझाव दिया। Ser10 पर phosphorylated हिस्टोन H3 के लिए एक एंटीबॉडी के अलावा कोशिकाओं को एक कम डीएनए सामग्री होने के बावजूद, पिंजरे का बँटवारा (चित्रा 3 निचले सही पैनल) के बाहर हुआ नहीं था कि पता चला है। यह डीएनए सामग्री कोशिकाओं apoptosis के दौर से गुजर रहे थे और उनके डीएनए को नीचा दिखाना शुरू कर दिया था, क्योंकि कम था कि संभावना है। पिंजरे का बँटवारा (यानी 4N डीएनए के साथ) में, वे एस चरण या बजाय ठेठ apoptotic उप-जी 1 शिखर जी 0/1 कोशिकाओं के रूप में दिखाई देते हैं, जबकि कोशिकाओं एपोप्टोसिस की पहल की है।

चित्रा 4
चित्रा 4:। कोशिका चक्र स्टेज विशिष्ट हत्या की जांच डॉट भूखंडों BrdU के नाड़ी के बाद संस्कृति 24 घंटा में शेष BrdU सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाते हैं। प्रकोष्ठों 1.5 या 16 माइक्रोन RAD001 BrdU के नाड़ी के अंत के बाद से उपस्थिति या अकेले वाहन के अभाव (नियंत्रण), में संवर्धित किया गया था। कम पैनल 24 घंटा ऊष्मायन से अधिक BrdU के सकारात्मक थे कि कोशिकाओं के प्रतिशत को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक अन्य उदाहरण में, चित्रा 4 RAD001 (एक mTOR अवरोध करनेवाला) कोशिकाओं की एक कम एकाग्रता की उपस्थिति में सेल चक्र पूरा करने में सक्षम थे, लेकिन फिर जी 0/1 में देरी या गिरफ्तारी कराना पड़ा कैसे पता चलता है। RAD001 के एक उच्च एकाग्रता काफी हद तक टीआरए से कोशिकाओं को रोकाजी 0/1 के माध्यम से nsiting। एस चरण में महत्वपूर्ण बात कोशिकाओं (यानी BrdU के सकारात्मक) RAD001 जोड़ा गया है जब अधिमान्यतया संस्कृति से गायब करने के लिए दिखाया गया है। इस जी 2 / एम के माध्यम से गुजर कोशिकाओं को इस एजेंट द्वारा कोशिका मृत्यु के लिए अतिसंवेदनशील थे कि पता चलता है। 12

यह विशिष्ट एंटीजन को एंटीबॉडी का उपयोग सेल चक्र की विशेष चरणों में कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए भी संभव है। चित्रा 5 विन्क्रिस्टाईन उपचार के जवाब में प्रोटीन Chk1 और Chk2 को नियंत्रित सेल चक्र चौकी की सक्रियता में दिखाया गया है। Chk1 और Chk2 क्रमशः Ser345 और Thr68 पर फास्फारिलीकरण द्वारा सक्रिय कर रहे हैं। Chk1 और Chk2 के सक्रियण एक 2N डीएनए सामग्री लग गए हैं कि कोशिकाओं में देखा जा सकता है लेकिन चित्र में दिखाया के रूप में 5 एपोप्टोसिस का एक परिणाम के रूप में डीएनए गिरावट शुरू किया है कि पिंजरे का बँटवारा में कोशिकाओं को होने की संभावना है।

यह करने के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर दवाओं जोड़ने के लिए संभव हैBrdU के नाड़ी कोशिका चक्र के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं पर एजेंट के प्रभाव की जांच करने के लिए।

चित्रा 5
चित्रा 5:। विशेष सेल साइकिल चरण में कोशिकाओं को परिवर्तन का पता लगाने ऊपरी पैनल बनाम phosphorylated Chk1 (बाएं) या Chk2 (दाएं) डॉट भूखंडों 7 AAD में चित्रा 1 के रूप में BrdU सकारात्मक कोशिकाओं पर gated कोशिकाओं से पता चलता है। कोशिकाओं चित्रा 3 के लिए के रूप में 3 एनएम विन्क्रिस्टाईन की उपस्थिति या अनुपस्थिति में BrdU के नाड़ी निम्नलिखित 18 घंटे के लिए संस्कृति गया था। कम पैनल के रूप में संकेत 2N या 4N अंश या तो पर gated एक ही कोशिकाओं की ओवरले histograms दिखाते हैं। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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Discussion

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कोशिका चक्र विश्लेषण करने की क्षमता कैंसर जीव विज्ञान की समझ और सेल प्रसार और विकास को प्रभावित है कि दोनों दवाओं और जीन की कार्रवाई की व्यवस्था के लिए महत्वपूर्ण है। कथित तौर पर सेल प्रसार उपाय है कि assays के एक भीड़ कर रहे हैं, बहुमत केवल वर्तमान संख्या कोशिकाओं को इंगित करता है कि एक उपाय प्रदान करते हैं। ये प्रत्यक्ष दृश्य और गिनती, चयापचय क्रिया या एटीपी एकाग्रता से सेल नंबर उपाय है कि assays के शामिल हैं। इन तरीकों में से कई का मुख्य लाभ यह है कि वे स्थितियों या यौगिकों की बड़ी संख्या के प्रदर्शन के लिए उन्हें उपयोगी बनाने, microplate स्वरूपों और स्वचालन के लिए अपेक्षाकृत प्रदर्शन करने के लिए आसान और उत्तरदायी हैं। इन तरीकों में से कई की कमी मौत की वजह से सेल हानि संभावित सेल प्रसार का एक कम करने के लिए अग्रणी ध्यान में नहीं रखा जाता है। इसके अलावा इन तरीकों थोक आबादी मापने के लिए और एकल कक्षों का अध्ययन या कोशिकाओं के पारगमन के माध्यम से की अनुमति नहीं देतेकोशिका चक्र।

शायद सबसे विश्वसनीय और सटीक आमतौर पर इस्तेमाल प्रसार assays के, के डीएनए संश्लेषण उन कि उपाय कर रहे हैं। पारंपरिक सेल प्रसार assays के कुछ ही घंटों में रात भर नए संश्लेषित डीएनए में शामिल किया है, जो 3 एच thymidine, के साथ। 13 इस विधि के साथ स्पष्ट समस्या रेडियोधर्मी सामग्री का इस्तेमाल होता है करने के लिए कोशिकाओं को सेते हैं, लेकिन एक सीमा है परिणाम उपायों औसत कि कोशिकाओं की आबादी के प्रसार। अतिरिक्त कदम आवश्यक हैं, हालांकि BrdU के इसी तरह, विकिरण मुद्दों के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है और BrdU एक संभावित उत्परिवर्तजन है। हालांकि, BrdU के एकल कक्षों के विश्लेषण की अनुमति प्रवाह cytometry के साथ संगत होने का लाभ है। एकल कोशिका के स्तर पर सेल प्रसार का आकलन करने के लिए संगत विधियों cytometry के 14 अन्य प्रवाह (कोशिका झिल्ली या सेलुलर प्रोटीन लेबल कि रंगों की बढ़ती संख्या में शामिल daught के बीच विभाजित है कि जैसे CFSE)एर कोशिकाओं, डीएनए intercalating रंगों और एंटीबॉडी द्वारा कोशिका चक्र विशिष्ट प्रतिजन का पता लगाने। सेल लेबलिंग रंगों का सबसे अच्छा सेल डिवीजनों में से एक संख्या से अधिक कोशिकाओं के विभाजन पर नज़र रखने की अनुमति है। 15 कोशिका चक्र मंच या वितरण के बारे में कोई जानकारी नहीं प्राप्त की है, हालांकि वे प्रसार का एक सीधा उपाय प्रदान करते हैं। ऐसे propidium आयोडाइड या 7 AAD मजबूत कोशिका चक्र वितरण 16 प्रदान करते हैं, लेकिन अस्थायी नहीं, डेटा के रूप में डीएनए intercalating रंगों का उपयोग डीएनए सामग्री की माप। यहां तक ​​कि कई बार अंक के आकलन के साथ यह कोशिका चक्र या विशेष सेल चक्र चरणों की लंबाई का आकलन करने के लिए असंभव बना हुआ है। सेल चक्र विशिष्ट एंटीजन एक अनसिंक्रनाइज़्ड सेल की आबादी में कोशिका चक्र चरण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। आमतौर पर इस्तेमाल किया कोशिका चक्र विशिष्ट एंटीजन के दौरान व्यक्त की है जो की-67, 17, जी 2 और कोशिका चक्र के एम चरणों लेकिन शामिल नहीं जी 0/1, PCNA (proliferating सेल परमाणु प्रतिजन) 18, और ज के फास्फारिलीकरण के दौरानistone H3। इन जबकि 19 की कमी है सेल चक्र की गतिशीलता से संबंधित अच्छा कोशिका चक्र चरण के बारे में डेटा, जानकारी प्रदान करते हैं।

सेल चक्र गतिशीलता पर प्राप्त डेटा को पारंपरिक रूप से एजेंटों या सेल चक्र प्रगति कि ब्लॉक संस्कृति शर्तों का उपयोग कोशिकाओं सिंक्रनाइज़ करके जांच की गई है। यह एक बार सेल चक्र के माध्यम से एक साथ प्रगति की कोशिकाओं की लहर में परिणाम निकाल दिया कि ब्लॉक, पीछे की कोशिकाओं का एक संग्रह का कारण बनता है। 1 कोशिका चक्र की अवधि और विभिन्न कोशिका चक्र के चरणों की लंबाई की गणना तो संभव है। प्रकोष्ठों सीरम अभाव से जी 0 में प्रवेश सक्रिय सेल साइकिल चालन के बाहर निकलने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। यह कई तब्दील प्रकार की कोशिकाओं सहित कुछ प्रकार की कोशिकाओं, दूसरों के लिए एक विश्वसनीय तरीका है सीरम का पुनः अलावा पर ​​कोशिकाओं तो सेल चक्र से बाहर निकलने के लिए असफल। बाद के चरणों में एक साथ 20 कदम हो सकता है और अक्सर एक के रूप में कोशिका मृत्यु से गुजरना दरअसल नतीजा है। 21 हमारी स्टूयह पाया मर जाता है तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं के लिए स्थिति हो। इसके अलावा, कोशिकाओं को अक्सर एक पर्याप्त सिंक्रनाइज़ ढंग से कोशिका चक्र फिर से दर्ज करने के लिए असफल हो जायेगी। रासायनिक विधियों सेल चक्र के विशिष्ट चरणों में सेल चक्र गिरफ्तारी के लिए प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एजेंटों डीएनए संश्लेषण (जैसे अतिरिक्त thymidine) को रोकने कि या क्रमशः (जैसे nocodazole) एस और एम चरणों में गिरफ्तारी कोशिकाओं mitotic धुरी बनने से रोकने, लेकिन विषाक्त कर रहे हैं और का एक महत्वपूर्ण अनुपात में मौत भी वृद्धि गड़बड़ी में और परिणाम कर सकते हैं कोशिकाओं। सभी कोशिकाओं में 22 इन तरीकों एक महत्वपूर्ण अंश की हत्या के बिना कोशिकाओं के बहुमत को गिरफ्तार करने में विफल रहा है। उद्देश्य सेल चक्र मानकों के आधार पर एक संभावित विरोधी ल्यूकेमिक एजेंट के प्रभाव का आकलन करने के लिए किया गया था कि ध्यान में रखते हुए, तुल्यकालन से उत्पन्न कोशिका मृत्यु अस्वीकार्य था। विधियों की एक बड़ी संख्या का विवरण कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ करने के बावजूद, सभी कमियों है। मुख्य समस्याएं हैं: एक अपर्याप्तसेल चक्र के वांछित हिस्से में कोशिकाओं के लिए संवर्धन, मनाया, अतिरिक्त विषाक्तता के रूप में सामान्य कोशिका चक्र के शरीर क्रिया विज्ञान या, के लिए गड़बड़ी।

यहाँ वर्णित विधि कोशिकाओं एस चरण में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए BrdU के साथ एक संक्षिप्त अवधि के लिए incubated रहे हैं, जहां लंबे समय तक इस्तेमाल किया नाड़ी प्रणाली का एक सरल विस्तार है। हम अपने सिस्टम में इष्टतम लेकिन पर्याप्त लेबलिंग प्राप्त किया जाता है तो कम समय अवधि में इस्तेमाल किया जा सकता है होना करने के लिए एक 45 मिनट पल्स पाया। BrdU को हटाने के बाद संस्कृति कोशिकाओं को जारी रखकर यह अगले सेल चक्र में एस चरण, जी 2, पिंजरे का बँटवारा, जी 1 और प्रवेश के शेष के माध्यम से अपनी प्रगति को ट्रैक करने के लिए संभव है। यह आगे की कोशिकाओं का पालन करने के लिए संभव हो सकता है। इस प्रणाली का लाभ इन प्रयोगों की समय सीमा में कोशिकाओं को विषाक्तता का कोई सबूत नहीं है और मीडिया में परिवर्तन का केवल एक जोड़े के लिए आवश्यक हैं के रूप में कोशिकाओं के विकास के लिए न्यूनतम विघटन, यह है कि वहाँ है। कोशिकाओं अन्यथा कोंटी में रखा जाता हैnuous संस्कृति। विधि के आधार पर प्रकृति प्रवाह cytometry यह अतिरिक्त सतह या intracellular धुंधला द्वारा सेल उप-जनसंख्या की पहचान के साथ जोड़ा जा सकता है कि इसका मतलब है। हम एपीसी संयुग्मित BrdU के एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया है, लेकिन अन्य conjugates के एंटीबॉडी पैनल के विकास की सुविधा के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है। 7 AAD बहुरंगा धुंधला के लिए विकल्पों को अधिकतम एक चैनल में fluoresces क्योंकि हम propidium आयोडाइड के बजाय 7 AAD इस्तेमाल किया। इसी प्रकार DAPI या Hoechst के डीएनए के धब्बे के रूप में प्रयोग किया जाता है, लेकिन एक यूवी लेजर की आवश्यकता होती जा सकता है। डीएनए धुंधला के लिए तंग सीवी इथेनॉल निर्धारण का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन इस बार अतिरिक्त सतह या cytoplasmic दाग के लिए विकल्पों को सीमित करने, एंटीबॉडी धुंधला समझौता। सबसे बड़ा नुकसान यह है कि चरण के बारे में 8 घंटा, तो लेबल कोशिकाओं बस में प्रवेश या नाड़ी की अवधि के दौरान एस चरण से बाहर निकलने के बारे में हो सकता रहता है S है। नतीजतन, तुल्यकालन कुछ अन्य प्रणालियों के साथ के रूप में के रूप में तंग नहीं है। हालांकि, डीएनए का संकेत रंगों के साथ BrdU लेबलिंग के संयोजन सेविशेष सेल चक्र निर्भर प्रोटीन के लिए सामग्री और एंटीबॉडी, मजबूत डेटा प्राप्त किया जा सकता है।

संगत डेटा प्राप्त करने के लिए आदेश में यह कोशिकाओं को सही एकाग्रता में और सभी परिस्थितियों की तुलना में किया जा रहा भर में सेल एकाग्रता संगत है कि कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। गंभीर रूप से 7 AAD धुंधला की चमक सेल एकाग्रता के लिए बहुत ही संवेदनशील है। एक स्वचालित सेल गिनती प्रणाली का उपयोग करते हुए कि सेल सांद्रता प्रक्रिया में हर कदम पर सभी नमूनों में संगत कर रहे हैं सुनिश्चित करने में मदद कर सकते हैं। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु कोशिकाओं BrdU के सामने आ रहे हैं समय की लंबाई है। छोटे बदलाव काफी मतभेद में अनुवाद कर सकते हैं, तो यह सभी के नमूने ठीक उसी समय के लिए BrdU के साथ incubated रहे हैं कि महत्वपूर्ण है। अंत में, यह इष्टतम धुंधला प्राप्त करने के लिए एंटीबॉडी टाइट्रेट करने के लिए महत्वपूर्ण है और एक बैच बदल जाता है जब भी इस दोहराया जाना चाहिए। सभी चरणों का लगातार पीछा कर रहे हैं और सेल सांद्रता इस metho तो स्थिर रखा हैडी मज़बूती से तुल्यकालन के लिए आवश्यकता के बिना सेल चक्र के माध्यम से कोशिकाओं की नज़र रखने के लिए सक्षम हो जाएगा। विशेष सेल प्रकार के सूट और विशिष्ट सवालों का पता करने के लिए इस विधि को संशोधित करने के लिए काफी गुंजाइश भी है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC BrdU Flow Kit BD Biosciences 552598 Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm
Buffer (referred to as Fixation Buffer)
BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus BD Biosciences 561651 Referred to as Permeabilization buffer
BD Perm/Wash Buffer BD Biosciences 554723 Referred to as Wash buffer
DNase Sigma D-4513
BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes BD Biosciences 352008
BD Pharmingen Stain Buffer BD Biosciences 554656
BD LSR FORTESSA flow cytometer BD Biosciences FORTESSA
Pipetman Gilson P2, P20, P100, P1000
RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml Lonza 12-167F
DPBS Lonza 17-512F
Fetal Bovine Serum FisherBiotec FBS-7100113
L-Glutamine Sigma G7513-100ML
5-Bromo-2′-deoxyuridine Sigma B5002-1G
Falcon TC 150 cm2 vented Flasks BD Biosciences 355001
Pipettes 25 ml Greiner 760180
Aersol Pipettes 200 µl Interpath 24700
Aersol Pipettes 1 ml Interpath 24800
Centrifuge Spintron GT-175R
CO2 incubator Binder C 150
AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody Cell Signalling 9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb Cell Signalling 2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb Cell Signalling 2348S
NALM6  DSMZ ACC-128

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References

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तुल्यकालन के लिए आवश्यकता के बिना फ्लो का प्रयोग कोशिका चक्र प्रगति के टेम्पोरल ट्रैकिंग
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Welschinger, R., Bendall, L. J. Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization. J. Vis. Exp. (102), e52840, doi:10.3791/52840 (2015).More

Welschinger, R., Bendall, L. J. Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization. J. Vis. Exp. (102), e52840, doi:10.3791/52840 (2015).

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