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Biology

同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡

doi: 10.3791/52840 Published: August 16, 2015

Summary

このプロトコルは、特定の時点でS期にあった細胞の時間的な追跡を可能にするために、ブロモデオキシウリジン(BrdUの)取り込みの使用が記載されています。 DNA色素と抗体標識の添加は、後の時点でS期細胞の運命の詳細な分析を容易にします。

Introduction

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細胞周期の進行の間に細胞内で起こる細胞周期の機能と変更点の評価は、生物学の多くの側面、特に癌の生物学を理解するための基本です。悪性腫瘍の治療のために開発中の多​​くの薬剤は、細胞周期の進行に大きな影響を持っているか、細胞周期依存性の機構を介して、細胞死を誘導します。細胞周期の特定の期における細胞周期動態または細胞を研究するためには、細胞を同期させることが一般的です。しかし、同期化方法は、潜在的に得られた結果を混乱させる、研究された細胞に有害な影響を有し得る。1近年、細胞周期の特定の段階でのみ存在する蛍光タグ付きタンパク質の使用は、時間をかけて、単一細胞における細胞周期進行の分析を可能にしました2、ただし細胞は遺伝的にこれを読み取ることができるシステムへの使用を制限する、これらの標識タンパク質を発現するように操作する必要性を検討しますILY達成。

細胞周期は、2つのアクティブフェーズで構成されています細胞分裂が起こる合成DNAが複製される(S)相、有糸分裂(M)を。これらの相は3ギャップ相、G 0、G 1及びG 2で分離されています。 G 0または休止は、細胞は、細胞が前のDNA複製および細胞増殖は、DNA複製の完了との間が、細胞分裂の前に続けてG 2のサイズの増加ここで、G 1は 、周期を離れた休止期です。細胞周期の進行は、チェックポイントの数によって制御されます。環境条件がDNA合成の支援ではなく、S期への進入を防止するときG 1チェックポイントが活性化されます。イントラS期チェックポイントまたは遅延は、停止した複製フォークで生じ得るDNA損傷によって誘発することができます。 G 2の間、複製されたDNAの忠実性が確認され、損傷をG 2、検出された場合3活性化は、一般的に細胞集団を同期するために使用されます。細胞周期チェックポイントは、多くの要因によって活性化することができるが、癌生物学において最も一般的には、DNA損傷の検出です。 DNA損傷応答はPI3キナーゼ様キナーゼ毛細血管拡張性運動失調およびRAD3関連(ATR)は、それぞれ、下流のエフェクターキナーゼのChk1およびChk2での活性化血管拡張性失調症変異した(ATM)によって開始される。3イベントの範囲は、ストールを含めたChk1を活性化させます複製フォーク、DNAの架橋、および紫外線損傷はChk2では、主に二本鎖切断によって活性化されます。

細胞周期iの長さに変更された条件の影響を研究するための通常の方法細胞周期の特定の段階において細胞を同期させるための1本は、いくつかの方法を介して達成することができます。細胞は、物理的サイズ、密度、側方散乱(粒度)、および細胞表面マーカーの発現に基づいて分離することができます。具体的には、細胞は、化学的手段によって同期させることができます。チミジン、ヒドロキシ尿素及びシトシンアラビノシドのようないくつかの薬剤は、薬剤が除去された後に循環を続けるS期における細胞の蓄積を生じ、細胞周期のS期におけるDNA合成を阻害するために使用することができます。またはM期のDNA含量-有糸分裂紡錘体、G 2と逮捕の形成を防止するノコダゾール、で処理した細胞。 G 0期の細胞の蓄積培地結果から血清の排除。培養血清中の栄養素の再添加は、細胞の正常な循環を再起動します。しかし、これらの同期方法の全ては、細胞の正常な循環と成長を妨害することが可能とresul有意な細胞死でT。

急性リンパ芽球性白血病細胞の同期は特に困難であり、これらの細胞は、遺伝子操作に適していません。ここで説明する方法は、細胞周期動態の評価と、従来の同期または遺伝子改変することなく、細胞周期の特定の段階にある細胞の研究を可能にします。この方法は、遺伝子改変し、従来の同期手順は容易に達成されていない他の細胞型のために有用であり得ます。この方法は、細胞の短期の成長および増殖にはほとんど影響を与えブロモデオキシウリジン(BrdUの)取り込み、長い確立使用に基づいている。4設立のBrdUプロトコルはS期の間に新たに合成されたDNAへのBrdUの取り込みを利用します。これは恒久的にBrdU露光中、S期にあったように、細胞をマークします。この集団は、BrdUのincorporために染色することにより、後の時点で識別することができエーション、それにより追跡し、細胞周期の通過に対する薬物効果の研究を可能にする時間をかけて評価することができる同期集団として機能します。 BrdUを通常DNアーゼまたは酸処理した後の達成、前抗体染色にさらされる必要がある。6,7取り込まれたBrdUは、追加のマーカーを含めることができ検出するために、フローサイトメトリーを使用しました。最も重要なのは、試験の開始時にS期にあった細胞の細胞周期分布の評価を可能にする、DNA含有量を測定するための色素の使用である。8さらに、追加の表面または細胞内抗原はまた、研究することができる。9、これらなどのKi67として、またはそのような切断されたカスパーゼ3のようなアポトーシスマーカーとしての一見無関係な細胞機能への細胞周期のイベントに関連してもよいです。潜在的な用途は、研究者の想像力によって制限されています。

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Protocol

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ここで説明するプロトコルは、急性リンパ芽球性白血病細胞株NALM6を使用するが、他の細胞型に適用することができます。

1.ソリューションおよび試薬

  1. 完全RPMI
    1. 56ミリリットルのウシ胎児血清(FCS)およびRPMI-1640培地500mlボトルに5.5ミリリットルの200mMのL-グルタミンを追加します。
  2. BrdUの原液
    1. ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で32.5 mMのBrdUを(10mg / ml)を準備します。
  3. BrdUを完全RPMI
    1. 完全RPMIの10mlまでのBrdUストック溶液6.2μlを添加します。
  4. DNase溶液
    1. 1mgのDNアーゼ/​​ DPBSでミリリットルを準備します。
  5. 染色緩衝液
    1. DPBSで3%の熱不活性化FCSおよび0.09%アジ化ナトリウムを準備します。
  6. 固定バッファ、透過処理用緩衝液および洗浄用緩衝液の定義については、物質一覧を参照してください。

2.細胞

いいえTE:細胞はより大きい6ヶ月間培養しませんでした。この方法は、細胞密度および培養培地の調整と非付着性細胞株に直接適用可能です。実験の開始時に指数関数的に増殖している細胞を使用してください。

  1. 完全RPMI中のT-75培養フラスコ中NALM6細胞を維持します。クラスII安全キャビネットを使用して、無菌条件下で、すべての手順を実行します。
    1. 週に3回文化を分割して、1ml当たり1〜2×10 6個の細胞間NALM6細胞を維持します。
    2. 大気中のCO 2、5%、37℃でインキュベートします。

BrdUで細胞の3パルス標識

注意:それは潜在的な変異原と催奇形物質であるように注意したBrdUを処理します。

  1. 5分間、150×gで遠心分離した細胞。注:新鮮な培地に細胞を転送すると、結果の再現性を向上させます。
  2. 2×10 6℃での完全RPMI中の細胞数および再懸濁細胞を行いますells / mlの。
  3. BrdUの完全RPMIに1×10 6細胞/ mlの最終細胞濃度を産生して細胞を2 1に希釈します。
  4. その後、完全RPMIで10のセル1を希釈し、45分間、5%CO 2で37℃でインキュベートします。遠心セル5分間150×gで、慎重に上清をすべて廃棄します。
  5. 完全RPMIの少量(〜100μL)中で再懸濁した細胞は、細胞計数を行い、1×10 6細胞/ mlに調整します。
  6. ピペット48ウェルプレートのウェルへの細胞の1ミリリットル。ピペットより再現性のある結果を得るために、未使用のウェルにDPBSの1ミリリットル。
  7. 所望ここ時点、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、空気中5%CO 2中で37℃でインキュベートします、18、19、20、21、22、23、及び24時間。注意:時間の長さは、実験計画を測定することを目的とするものに依存します。
  8. ピペットを用いてFACSチューブにすべてのセルを転送します。 1ミリリットルvoluとよく順次をすすぎます5ミリリットルの最終全容量のPBS MES。
  9. 5分間150×gで遠心分離し、慎重にすべての上清を除去します。細胞は、染色のための準備ができているすぐにこの(セクション4)を行います。

4.細胞染色

注:細胞表面染色が必要な場合は、細胞が全体に4℃に保たれることを確実に定着する前にそれを行います。

  1. 染色緩衝液100μl中に再懸濁細胞(任意の表面染色のためには、表面抗原と4℃で30分間インキュベートし、抗体の推奨量を追加します)。
  2. 、染色緩衝液1mlを加え150×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
    注記:特定の抗体濃度、インキュベーション時間等は、特定の実験の目的に応じて変化します。
  3. 固定および透過処理
    1. 固定緩衝液100μl中に細胞を再懸濁し、室温で15分間インキュベートします。
    2. 1ミリリットルOを追加F洗浄バッファー、150×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
    3. 透過化緩衝液100μlで細胞を再懸濁し、氷上で10分間細胞をインキュベートします。
    4. 、洗浄緩衝液1mlを加え150×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
    5. チューブあたり固定緩衝液100μl中に細胞を再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。
    6. 、洗浄緩衝液1mlを加え150×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
      注:必要に応じてプロトコルは、ここで一時停止することができます。染色緩衝液中に再懸濁させた場合に固定された細胞は、4℃で数日間安定です。先に進む前に、遠心分離後染色バッファーを削除します。
  4. DNase処理
    1. DNase溶液100μl中に再懸濁細胞(30μgの6 DNアーゼ/ 10の細胞)および37℃で1時間、細胞を培養します。
    2. 、洗浄緩衝液1mlを加え5分間、150×gで遠心分離し、上清を捨てます。
    3. 抗体染色
      注:BrdUの以外の細胞内マーカーについて染色BrdU染色と同時に行うことができます。
      1. 重要:それぞれの単一の蛍光色素で標識された未染色の細胞と細胞か​​らなる補償コントロールを準備します。理想的には、実験チューブに使用されるもののような補償のコントロールに同じ抗体を使用しています。これが不可能な場合には、高度に発現される抗原に対する代替抗体は、同一の蛍光色素にコンジュゲート。
      2. 洗浄緩衝液50μl中に細胞を再懸濁し、1μL/ BrdU抗体の10 6個の細胞を追加します。注:他の特定の細胞内抗原に直接結合した抗体を添加することもできます。
        注:セリン10上でリン酸化ヒストンH3に対する抗体は、G2中の細胞を区別するために使用することができ、M、ヒストンH3のセリン10、有糸分裂の間にリン酸化されるTyr15がリン酸化CDC2に対する10抗体は、HAV細胞を検出するために使用することができます。E有糸分裂にコミット。11
      3. 室温で20分間細胞をインキュベートします。
      4. 、洗浄緩衝液1mlを加え5分間、150×gで遠心分離細胞と上清を捨てます。
    1. 細胞周期分析のための染色DNA
      1. ペレットを緩め、7-AAD溶液(0.25μgの)の20μlを添加します。注:これは、7-AAD /セルの一定量を使用することが重要です。
      2. 染色緩衝液1mlで細胞を再懸濁します。

    フローサイトメトリーデータの5集

    注:必要なマシンが使用する蛍光色素の数と性質に依存します。

    1. リニアスケールのFSC-A、SSC-A、FSC-H(FSC-Wの代わりにFSC-Hを用いることができる)と7-AAD蛍光:次のパラメータを収集します。対数スケール上のAPCチャネルを収集します。対数スケールを用いて表面や内部のラベルの評価のために必要な追加のチャネルを収集します。
    2. COMを行いますサンプルを分析する前に、異なる蛍光色素との間で観察された発光スペクトルの信号の重複pensation。注:ほとんどのフローサイトメーターは、これを自動的に実行します。
    3. 各サンプルの少なくとも10,000個のイベントを収集します。

    フローサイトメトリーデータの分析6.

    注:FlowJoソフトは、フローサイトメトリーデータ分析のために、本研究で使用したが、他のソフトウェアパッケージを使用することもできます。ゲーティング戦略は、図1に示されています。

    1. FSC-AおよびSSC-Aのパラメータを使用して、生細胞集団を特定します。
    2. この集団内ダブレットと(もここで用いることができるFSC-W)FSC-AおよびFSC-Hを用いて凝集体を除外します。
    3. この集団内でのy軸上のx軸とのBrdU-APCに7-AADを用いたドットプロットを設定します。

    図1
    図1:ゲーティング戦略PA。ネル:非ゲートの細胞は、SSCドットプロット対FCS-Aに示されています。生存可能な細胞集団を示したゲートによって識別されます。センターパネル:左パネルからゲート細胞は、FSC-Hドットプロット対FSC-A(FSC-Wの代わりに高さを使用することができます)に表示されます。ダブレットと凝集体が同定され、示されたゲートで除外されています。右パネル:中央のパネルで二重排除日からゲート細胞は、APC-ドットプロット対7-AADに表示されます。 BrdU抗体は、APCをパルス標識中のBrdUを取り込んだ細胞の同定を可能に標識されています。 7-AADは、DNA含有量についての情報を提供します。上部ゲートは、BrdUのための陽性細胞を定義するため、S期でのBrdUパルスの時に、左下のゲート、G 0/1のセルと右下のゲートGのもの2 / M。 表示するにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。

    1. 細胞周期A nalysis
      1. ダブレット排除ゲート内の細胞の最初のデータ·ファイルとゲートを開きます。
      2. (FloJoソフトウェアのプラットフォームの下に位置する)は、細胞周期分布のために、この集団を分析し、ディーン·ジェット·フォックスモデルを使用します。
      3. ゲートを作成し使用してG 0/1およびG 2 / Mピークの位置を取得します。
      4. BrdU陽性細胞と被写体上のゲートと同じ細胞周期分析にこの集団。
      5. 作成ゲートから同じゲートを適用し、G 0/1およびG 2 / Mピークの位置について(作成したゲートを使用)制約を設定することにより、G 0/1およびG 2 / Mピークの位置を提供します。これは、 図2の第2のパネルに示されています。
        注:他のソフトウェアは、データを分析するために使用されてもよく、命令は、それに応じて変化するであろう。

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    図2:細胞周期の進行最初のパネル(全細胞)を二重排除ゲートによって定義された細胞集団にゲートされます。この集団は、X軸上の7-AADとヒストグラムで表示しました。 G 0/1ピークのピークが軸の下の矢印で示されています。 図1に示すように、後続のパネルでのBrdU陽性細胞にゲートされている。得られたG 0/1位置の値を二重排除ゲートのゲートは、FlowJoソフト細胞周期ソフトウェア内のBrdU陽性のゲート細胞に適用した場合。 図1および第2のパネルに示すように、全体の人口を分析したときに得られる値に基づいて、G 0/1ピークの位置に示すように後続の各パネルには、BrdU陽性集団にゲートをしました。同じSAMPでのBrdU陽性細胞のためのG 0/1集団の位置を特定するためのBrdU陰性画分を使用しましたルは、サンプル間のDNA染色の強度のわずかな違いを制御します。各パネルに表示される数は、BrdUのパルスが終了してからの時間を表しています。計算された細胞周期相は日陰緑色で示されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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Representative Results

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この方法は、情報の範囲を得るために使用することができます。いくつかのアプリケーションは、ここで概説されています。

細胞周期の継続時間の評価

細胞周期を介して通過する細胞のために必要な時間を決定するために、細胞を、BrdUのパルス後の種々の時点で採取します。評価の間隔は、分析される特定の細胞に適応させることができます。造血細胞株は、標準的な培養条件下での細胞周期相の長さを決定するために、任意の薬物治療の非存在下で24時間にわたり毎時間を評価した。 図2は、24時間の期間にわたってNALM6細胞のスナップショット分析の選択を示します。 ( 図1中のBrdU陽性ゲート内のIE)のBrdUパルス時のS期の細胞がBrdUをP後の10時間に検出され、細胞周期の期における細胞のピークとG 2 / Mを介して進行しますulse。 S期ののBrdU標識細胞の割合は、パルスの後、その天底14時間に達し、ほぼすべての細胞が17時間後にG 1に戻っていました。 24時間までのBrdU標識細胞の割合は、しかし、ほとんどはまだ知られて36と一致して、複製の第二ラウンドに入っていなかった、細胞を24時間以内に細胞周期を完了できることを示すS、その次のセルサイクルの一部として、位相を再入力していましたこれらの細胞のための時間を倍増時間。

細胞周期分布は、さらに、追加のマーカーを含めることによって改良することができます。例えば、セリン10上でリン酸化ヒストンH3(有糸分裂中の細胞のマーカー)に対する抗体の添加は、G 2( 図3のパネルを左)のものとは、有糸分裂中の細胞の識別を可能にします。

図3
図3:確認細胞周期段階の追加のマーカーを使用した。 図1に示すように、上部パネルはBrdU陽性ゲートからの細胞の細胞周期分析を示す。細胞はBrdUのパルス後18時間3nMのビンクリスチンの存在下または非存在下でインキュベートしました。 図2で説明したように細胞周期分析を行った。下のパネルは、セリン10ドットプロット上でリン酸化ヒストンH3対7-AADで同じ細胞を示す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

細胞周期に対する薬剤の影響の評価

細胞毒性剤は、細胞周期の進行に大きな影響を有することができ、細胞死を誘導することができます。細胞周期進行に対する薬物の効果は、BrdUのパルスに続く目的の薬剤を添加することによって評価することができます。 2つの例を示しています。最初は、誘導O状況でしたF細胞死は、細胞周期のデータの分析( 図3の右のパネル)を混同しました。 NALM6細胞は、BrdUのパルス後18時間3 nmのビンクリスチンに暴露されました。細胞をビンクリスチン対象の微小管のように、有糸分裂で逮捕することが予想されました。しかし、細胞周期分析は、細胞が逮捕されたが、G 0/1( 図3右上のパネル)まで遷移していないことを示唆しました。セリン10上でリン酸化ヒストンH3に対する抗体の添加は、細胞が減少DNA含有量を有するにもかかわらず、( 図3右下パネル)有糸分裂を終了していないことを示しました。細胞がアポトーシスを受けた後、そのDNAを分解し始めたので、DNA含有量が減少した可能性があります。有糸分裂( すなわち、4N DNAを含む)しながら、細胞がアポトーシスを開始したので、S期またはG 0/1細胞の代わりに、典型的なアポトーシスサブG 1ピークとして表示されます。

図4
図4:細胞周期段階の検出の特異的死滅ドットプロットは、BrdUのパルスの後、培養24時間で残りのBrdU陽性細胞の割合を示します。細胞は、BrdUのパルスの終わりから、(コントロール)ビヒクル単独の存在下または非存在下で1.5または16μMRAD001培養しました。下のパネルは、24時間のインキュベーションの上のBrdU陽性であった細胞の割合を示している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

別の例では、 図4は、RAD001(mTOR阻害剤)は、細胞の低濃度の存在下で細胞周期を完了することができましたが、その後、G 0/1の遅延や停止を受けた方法を示しています。 RAD001のより高い濃度は、主に、TRAからセルを防ぎますG 0/1までnsiting。 S期の重要な細胞( すなわち、BrdU陽性)RAD001を添加した場合に優先的に培養物から消えることが示されました。これは、G 2 / Mを通過した細胞は、このエージェントによって、細胞死をより感受性であったことを示唆している。12

これは、特定の抗原に対する抗体を用いた細胞周期の特定の期の細胞の応答を調べることも可能です。 図5ビンクリスチン治療に応答してタンパク質のChk1およびChk2での制御、細胞周期チェックポイントの活性化が示されています。 CHK1およびChk2では、それぞれSer345とThr68のリン酸化によって活性化されます。のChk1及びChk2での活性化は、2N DNA含量を有するように見えるが、 図5に示すように、アポトーシスの結果として、DNA分解を開始している有糸分裂中の細胞である可能性がある細胞に見られます。

これは、後の様々な時点で薬物を添加することができますBrdUのパルスは、細胞周期の様々な段階の細胞に対する薬剤の影響を調べました。

図5
図5:特定の細胞周期期の細胞への変化の検出上のパネルは対リン酸化のChk1(左)またはChk2で(右)ドットプロット7-AADで、図1のようにBrdU陽性細胞にゲート細胞を示しています。細胞は、図3のような3 nmのビンクリスチンの存在下または非存在下でのBrdUパルス以下18時間培養していた。下のパネルが示されているように、2Nまたは4N画分のいずれかにゲートを同じ細胞のオーバーレイヒストグラムを表示しています。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。

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Discussion

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細胞周期を分析する能力は、癌生物学および細胞増殖と成長に影響を与える両薬物および遺伝子の作用機序を理解するために重要です。報告によると、細胞増殖を測定するアッセイの多数がありますが、大半は単に本数細胞を示す尺度を提供します。これらは、直接可視化、カウント、代謝活性またはATP濃度によって細胞数を測定するアッセイが含まれます。これらの方法の多くの主な利点は、それらが条件もしくは化合物の多数をスクリーニングするためにそれらを有用にする、マイクロプレートフォーマットおよび自動化に比較的実行が容易で、適していることです。これらの方法の多くの欠点は、死による細胞損失は、潜在的に、細胞増殖の過小評価につながる、考慮されていないことです。また、これらの方法は、バルク集団を測定し、単一細胞の研究や介して細胞の通過を許可していません細胞周期。

一般的に使用される増殖アッセイの、おそらく最も信頼できる正確なDNA合成を測定するものです。伝統的な細胞増殖アッセイは、新たに合成されたDNAに取り込まれる3 H-チミジン、一晩に数時間、細胞を培養する。13この方法の明らかな問題は、放射性物質の使用であるが、他の制限は結果が平均を測定することです細胞集団の増殖。追加のステップが必要とされるが、BrdUを同様に、放射線問題なく使用することができ、BrdUを潜在的な変異原です。しかしながら、BrdUを単一細胞の分析を可能にする、フローサイトメトリーと適合性であるという利点を有する。単一細胞レベルでの細胞増殖を評価するための互換性のあるサイトメトリー法14その他の流れを(細胞膜または細胞タンパク質を標識する色素の増加を含みますdaught間で分ける例えば CFSE)ER細胞を、DNA挿入色素と抗体による細胞周期特異的な抗原検出。細胞標識色素の最高は、細胞分裂の回数にわたって、細胞分裂の追跡を可能にする。15細胞周期のステージや分布についての情報は得られていないが彼らは、増殖の直接測定を提供します。このようなヨウ化プロピジウムまたは7-AADは、強力な細胞周期分布16を提供するが、一時的ではない、データなどのDNAインターカレート色素を用いたDNA含有量の測定。であっても複数の時点の評価には、細胞周期、または特定の細胞周期相の長さを評価することはできないままです。細胞周期特異的な抗原は、非同期細胞集団における細胞周期の段階を評価することができます。一般的に使用される細胞周期特異的抗原はG 0/1、PCNA(増殖細胞核抗原)18、及びhのリン酸化の間にないSの間に発現されるのKi-67、17、G 2細胞周期のM期を含むがH3。19 istoneこれらは、細胞周期のステージに関する良好なデータを提供するが、細胞周期の動態に関連する情報が不足しています。

細胞周期動態に関するデータを取得する伝統的な細胞周期の進行をブロックする薬剤または培養条件を用いて細胞を同期させて検討されています。これは、一度、細胞周期を通して進行すると共に細胞の波を生じ、除去ブロックの後ろの細胞の蓄積を引き起こす。1細胞周期の持続時間および種々の細胞周期段階の長さの計算はことが可能です。細胞は、血清欠乏によりG 0に入るアクティブセルのサイクリングを終了するように誘導することができます。これは、多くの形質転換された細胞型を含む特定の細胞型、その他、信頼性の高い方法であるが、血清の再添加すると、細胞は、その後、細胞周期を終了することができない。その後のフェーズに合わせて20を移動させることができると頻繁として細胞死を受けます実際の結果。21私たちのSTUダイは、これは急性リンパ芽球性白血病細胞のための状況であることが判明しました。さらに、細胞は、しばしば十分に同期して、細胞周期を再入力に失敗します。化学的方法は、細胞周期の特定の段階において細胞周期停止を誘導するために使用することができます。それぞれ( 例えばノコダゾール)、DNA合成( 例えば、過剰チミジン)を防止または紡錘体の形成を防止する。例えば、エージェントSとM期で逮捕細胞が、毒性があり、かなりの割合で成長障害や死につながることができます細胞全ての細胞に。22これらの方法はかなりの割合を殺すことなく細胞の大部分を阻止するために失敗しました。目的は、細胞周期のパラメータの潜在的な抗白血病剤の効果を評価することであったことを考慮すると、同期化から生じる細胞死は受け入れられません。細胞を同期させる方法の多数の記述にもかかわらず、すべての欠点を有します。主な問題は次のとおりです。不十分細胞周期の所望の部分のセルのための濃縮、細胞周期の正常な生理機能や、観察されるように、過度の毒性を妨害。

ここで説明する方法は、細胞がS期の細胞を同定するためにBrdUで短時間インキュベートするあれパルスシステムの単純な拡張です。我々は、45分間のパルスは我々のシステムで最適であることが見出されなく、十分な標識が得られた場合、より短い期間を使用することができます。のBrdUを除去した後の培養細胞に継続することにより、S期、G 2、有糸分裂、G 1および次の細胞周期への進入の残りを通じて進行を追跡することが可能です。さらに、細胞に追従することが可能です。このシステムの利点は、これらの実験の時間枠内の細胞に対する毒性の証拠がないと、メディアの変更のみカップルが必要とされる細胞の増殖に対して最小限の混乱があることです。細胞は、それ以外の場合はコンティに維持されていますnuous文化。方法のフローサイトメトリーベースの性質は、それが付加的な表面または細胞内染色による細胞の亜集団の同定と組み合わせることができることを意味します。我々は、APCコンジュゲートのBrdU抗体を使用したが、他の結合体は、抗体のパネルの開発を容易にするように置換することができます。 7-AADは多色染色するためのオプションを最大化単一チャネルで蛍光を発するので、私たちは、ヨウ化プロピジウムではなく、7-AADを使用していました。同様DAPIまたはヘキストはDNA染色として使用されるが、UVレーザーを必要とすることができます。 DNA染色のためのより緊密なCVがエタノール固定を使用して得ることができるが、これは頻繁に追加の表面または細胞質汚れのオプションを制限し、抗体染色を損ないます。最大の欠点は、S期は非常に標識された細胞は、先ほど入力またはパルス期間中のS期を終了しようとしている可能性があり、約8時間持続することがあります。その結果、同期はいくつかの他のシステムとのようにタイトではありません。しかしながら、DNAを示す色素でBrdU標識を組み合わせることによって特定の細胞周期依存性タンパク質の含有量および抗体は、強力なデータを得ることができます。

一貫性のあるデータを得るためには、細胞は、正しい濃度で、すべての条件が比較さにわたって細胞濃度が一貫していることであることを保証することが重要です。批判的に7-AAD染色の明度は細胞濃度に非常に敏感です。自動細胞計数システムを使用すると、その細胞濃度は、プロセスの各ステップで、すべてのサンプルで一貫していることを確認することができます。もう一つの重要な点は、細胞がBrdUをにさらされている時間の長さです。小さな変動は、かなりの違いに変換することができるので、すべての試料が正確に同じ時間のBrdUとともにインキュベートすることが重要です。最後に、最適な染色を得るために、抗体を滴定することが重要であり、バッチが変更されるたびにこれが繰り返されるべきです。すべての手順は、一貫して続いており、細胞濃度は、このメトその後一定に保持した場合dは確実に同期を必要とせずに細胞周期の細胞の追跡を可能にします。特定の細胞型に合うし、具体的な質問に対処するためにこの方法を変更する余地もあります。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC BrdU Flow Kit BD Biosciences 552598 Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm
Buffer (referred to as Fixation Buffer)
BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus BD Biosciences 561651 Referred to as Permeabilization buffer
BD Perm/Wash Buffer BD Biosciences 554723 Referred to as Wash buffer
DNase Sigma D-4513
BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes BD Biosciences 352008
BD Pharmingen Stain Buffer BD Biosciences 554656
BD LSR FORTESSA flow cytometer BD Biosciences FORTESSA
Pipetman Gilson P2, P20, P100, P1000
RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml Lonza 12-167F
DPBS Lonza 17-512F
Fetal Bovine Serum FisherBiotec FBS-7100113
L-Glutamine Sigma G7513-100ML
5-Bromo-2′-deoxyuridine Sigma B5002-1G
Falcon TC 150 cm2 vented Flasks BD Biosciences 355001
Pipettes 25 ml Greiner 760180
Aersol Pipettes 200 µl Interpath 24700
Aersol Pipettes 1 ml Interpath 24800
Centrifuge Spintron GT-175R
CO2 incubator Binder C 150
AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody Cell Signalling 9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb Cell Signalling 2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb Cell Signalling 2348S
NALM6  DSMZ ACC-128

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References

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同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡
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Welschinger, R., Bendall, L. J. Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization. J. Vis. Exp. (102), e52840, doi:10.3791/52840 (2015).More

Welschinger, R., Bendall, L. J. Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization. J. Vis. Exp. (102), e52840, doi:10.3791/52840 (2015).

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