Summary
Este protocolo descreve o uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir a absorção de seguimento temporais de células que estavam na fase S de um determinado ponto no tempo. A adição de corantes de ADN e rotulagem anticorpo facilita a análise detalhada do destino das células em fase S em momentos posteriores.
Introduction
A avaliação das características do ciclo celular e alterações que ocorrem nas células durante a progressão do ciclo celular é fundamental para a compreensão de diversos aspectos da biologia, particularmente biologia do cancro. Muitos agentes em desenvolvimento para o tratamento de doenças malignas têm efeitos profundos sobre a progressão do ciclo celular ou induzir a morte de células através do ciclo celular dependente de mecanismos. A fim de estudar a dinâmica do ciclo celular ou células numa fase específica do ciclo celular, é usual para sincronizar as células. No entanto os métodos de sincronização pode ter efeitos prejudiciais sobre as células a ser estudada, potencialmente confundindo os resultados obtidos. 1 análise Recentemente, a utilização de proteínas marcadas com fluorescência que só estão presentes em fases específicas do ciclo de células têm permitido da progressão do ciclo celular em células individuais ao longo do tempo 2, no entanto as células a serem estudadas necessidade de ser geneticamente manipuladas para expressar estas proteínas marcadas, o que limita a sua utilização para sistemas em que este pode ser lidoily alcançado.
O ciclo celular consiste de duas fases activas: a fase de síntese (s), onde o DNA é replicado e mitose (M), onde ocorre a divisão celular. Estas fases são separadas por três fases de hiato, 0 G, G 1 e G 2. G 0 ou quiescência, é uma fase de repouso, onde a célula tem deixado o ciclo, L é um onde as células aumentam de tamanho antes da replicação de ADN e L 2, onde o crescimento celular continua entre a conclusão da replicação de ADN, mas antes da divisão celular. A progressão através do ciclo celular é controlado por um número de pontos de verificação. O G 1 ponto de verificação é ativada quando as condições ambientais não são favoráveis a síntese de DNA e impede a entrada na fase S. O intra-S fase checkpoint ou atraso pode ser desencadeada por danos no DNA que pode resultar em forquilhas de replicação paralisadas. Durante G 2 a fidelidade do DNA replicado é confirmada e se o dano for detectado, em seguida, o G2 3 A activação destes pontos de verificação é normalmente usado para sincronizar as populações de células. Checkpoints do ciclo celular pode ser activada por um número de factores, mas na biologia do cancro a mais comum é a detecção de danos no DNA. A resposta a danos no ADN é iniciada pela PI3-quinase-quinases como ataxia e telangiectasia Rad3 relacionado (ATR) e a ataxia telangiectasia mutada (ATM) que activam as cinases efectoras a jusante Chk1 e Chk2, respectivamente. 3 Uma série de eventos activa Chk1 incluindo parado forquilhas de replicação, ligações cruzadas de DNA e danos da radiação ultravioleta enquanto Chk2 é ativado principalmente por quebras de cadeia dupla.
O método usual para estudar o efeito de condições alteradas no comprimento do ciclo celular is para sincronizar as células numa fase específica do ciclo celular. 1 Isto pode ser alcançado através de vários métodos. As células podem ser fisicamente separadas com base no tamanho, densidade, dispersão lateral (granulosidade), e expressão de marcadores de superfície celular. Mais praticamente, as células podem ser sincronizado por meios químicos. Vários agentes, tais como timidina, hidroxiureia e arabinósido de citosina podem ser utilizados para inibir a síntese de ADN em fase S do ciclo celular, resultando numa acumulação de células em fase S que continuam ciclismo após os agentes são removidos. As células tratadas com nocodazole, o que impede a formação do fuso mitótico, parada com uma L 2 - ou M-fase teor de ADN. Eliminação do soro do meio de cultura resulta na acumulação de células na fase G 0. A re-adição de nutrientes dentro das séricos cultura re-inicia o ciclo normal das células. No entanto, todos esses métodos de sincronização interferir com ciclos normais e o crescimento de células e pode Result em morte celular significativa.
A sincronização das células de leucemia linfoblástica aguda é particularmente difícil e estas células não são passíveis de manipulação genética. O método aqui descrito permite a avaliação da dinâmica do ciclo celular e o estudo de células em fases específicas do ciclo celular, sem sincronização tradicional ou modificação genética. Este método também pode ser útil para outros tipos de células em que a modificação genética e procedimentos de sincronização tradicionais não são prontamente obtidos. O método baseia-se no uso há muito estabelecida de bromodesoxiuridina (BrdU) a incorporação, o que tem muito pouco impacto sobre o crescimento a curto prazo e a proliferação de células. 4 protocolos BrdU Estabelecida tirar vantagem da incorporação de BrdU no ADN sintetizado de novo durante a fase S . Isto marca permanentemente células como estando em fase S durante a exposição BrdU. Esta população pode ser identificado em pontos de tempo mais tardios por coloração para BrdU Incorporção e, assim, agir como uma população sincronizados que podem ser seguidos e avaliados ao longo do tempo permitindo o estudo dos efeitos da droga sobre o trânsito do ciclo celular. BrdU precisa de ser exposto antes da coloração do anticorpo, geralmente atingidos após a ADNase ou tratamento ácido. 6,7 utilizando citometria de fluxo para detectar BrdU incorporada possibilita a inclusão de marcadores adicionais. O mais importante é a utilização de corantes para medir o teor de ADN, permitindo a avaliação da distribuição de fases do ciclo celular das células que estavam na fase S no início do estudo. 8 antigénios de superfície ou intracelulares adicionais Além disso, também pode ser estudada. 9 Estes pode referir-se os eventos do ciclo celular, tais como Ki67 ou características celulares para aparentemente não relacionadas, tais como marcadores de apoptose como a caspase-3 clivada. As aplicações potenciais são limitadas pela imaginação do investigador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo aqui descrito utiliza a linha celular de leucemia linfoblástica aguda NALM6 mas pode ser aplicada a outros tipos de células.
1. Soluções e Reagentes
- RPMI completo
- Adicionar 56 ml de soro fetal de vitelo (FCS) e 5,5 ml de 200 mM de L-glutamina a um frasco de 500 ml de meio RPMI-1640.
- BrdU da Solução
- Prepare 32,5 mM de BrdU (10 mg / ml) em fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (DPBS).
- BrdU completo RPMI
- Adicionar 6,2 ml de solução de estoque de BrdU para 10 ml de meio RPMI completo.
- Solução DNase
- Prepare 1 mg de ADNase / ml em DPBS.
- Tampão de Coloração
- Prepare a 3% de FCS inactivado pelo calor e azida de sódio 0,09% em DPBS.
- Consulte a Lista de Materiais para definições de Fixação Buffer, Permeabilização Tampão e tampão de lavagem.
2. Células
NãoTe: As células não foram cultivadas durante mais de 6 meses. Este método é directamente adaptável a qualquer linha de células não-aderentes com os ajustes para a densidade de células e meios de cultura. Use de células que estão a crescer exponencialmente no início da experiência.
- Manter as células NALM6 em T-75 frascos de cultura em RPMI completo. Execute todas as etapas, em condições estéreis, utilizando uma classe II biossegurança gabinete.
- Manter células NALM6 entre 1-2 x 10 6 culas por ml, dividindo a cultura de três vezes por semana.
- Incubar a 37 ° C em 5% de CO2 em ar.
3. Pulso marcação das células com BrdU
CUIDADO: Manusear com cuidado BrdU, pois é um agente mutagênico e teratogênico potencial.
- Centrifugar células a 150 xg durante 5 minutos. Nota: A transferência de células em meio fresco melhora a reprodutibilidade dos resultados.
- Realizar uma contagem de células e as células ressuspender em completo RPMI a 2 x 10 6 cells / ml.
- Dilui-se as células em 1 2 com BrdU RPMI completo produzindo uma concentração celular final de 1 x 10 6 células / ml.
- Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 45 min, depois dilui-se em 1 10 células com meio RPMI completo. Células centrifugar a 150 xg durante 5 min e cuidadosamente descartar todo o sobrenadante.
- Ressuspender as células em um pequeno volume (~ 100 mL) de meio RPMI completo, executar uma contagem das células e ajusta-se 1 x 10 6 células / ml.
- Pipetar 1 mL de células nos poços de uma placa de 48 poços. Pipeta de 1 ml de DPBS em todos os poços desocupadas para obter resultados mais reproduzíveis.
- Incubar a 37 ° C em 5% de CO 2 no ar para timepoints desejados, aqui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24 horas. Nota: O período de tempo vai depender do que o projeto experimental tem como objetivo medir.
- Transferir todas as células em tubos de FACS utilizando uma pipeta. Lavar o bem sequencialmente com 1 ml volumes de PBS para um volume total final de 5 ml.
- Centrifugar a 150 xg durante 5 min e cuidadosamente remover todo o sobrenadante. As células estão prontas para a coloração, executar esta (secção 4) imediatamente.
4. A coloração celular
Nota: Se for necessária a coloração da superfície das células realizá-la antes da fixação, assegurando que as células são mantidas a 4 ° C durante toda.
- Ressuspender as células em 100 ul de tampão de coloração (por coloração da superfície opcional, adicionar o volume recomendado de anticorpo para antigénios de superfície e incuba-se durante 30 min a 4 ° C).
- Adicionar 1 ml de tampão de coloração, centrifugar durante 5 minutos a 150 xg e desprezar o sobrenadante.
Nota: anticorpo específico, a concentração, tempo de incubação, etc variará dependendo objectivos específicos experimentais. - Fixação e permeabilização
- Ressuspender as células em 100 ul de tampão de fixação e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 1 ml de of tampão de lavagem, centrifuga-se durante 5 min a 150 xg e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 100 ul de tampão de permeabilização e incubar as células durante 10 minutos em gelo.
- Adicionar 1 ml de tampão de lavagem, centrifugar durante 5 minutos a 150 xg, e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 100 ul de tampão de fixação por tubo e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 1 ml de tampão de lavagem, centrifugar durante 5 minutos a 150 xg, e desprezar o sobrenadante.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui se necessário. As células fixadas são estáveis durante vários dias a 4 ° C, se ressuspensa em tampão de coloração. Remover o tampão de coloração após a centrifugação antes de prosseguir.
- O tratamento DNase
- Ressuspender as células em 100 ul de solução de ADNase (30 mg de ADNase / 10 6 células) e incubar as células durante 1 h a 37 ° C.
- Adicionar 1 ml de tampão de lavagem, centrifugar a 150 xg durante 5 minutos e descartar o sobrenadante.
- Coloração de anticorpos
Nota: A coloração para outros marcadores de BrdU intracelulares pode ser realizada em simultâneo com a coloração BrdU.- IMPORTANTE: Prepare os controles de compensação consistem de células não coradas e as células marcadas com cada único fluorocromo. Idealmente, usar os mesmos anticorpos para os controlos de compensação, como os utilizados nos tubos experimentais. No entanto, se isso não for possível, os anticorpos para antigénios substitutos altamente expressos conjugado com o mesmo fluorocromo.
- Ressuspender as células em 50 ul de tampão de lavagem e adicionar 1 mL / 10 6 células de anticorpo BrdU. Nota: pode também ser adicionado directamente conjugado anticorpos para outros antigénios intracelulares específicos.
NOTA:. Os anticorpos para histona H3 fosforilada em Ser10 pode ser utilizado para discriminar entre células em G2 e M, histona H3 é fosforilada em Ser10 durante a mitose 10 Os anticorpos para cdc2 fosforilada em Tyr15 pode ser usado para detectar células que o VHAe compromete-se a mitose. 11 - Incubam-se as células durante 20 minutos à temperatura ambiente.
- Adicionar 1 ml de tampão de lavagem, as células de centrifugação a 150 xg durante 5 minutos e descartar o sobrenadante.
- DNA Stain para análise do ciclo celular
- Soltar sedimento e adicionar 20 uL da solução de 7-AAD (0,25 ug). Nota: É crítico para utilizar uma quantidade constante de 7-AAD / célula.
- Ressuspender as células em 1 ml de tampão de coloração.
5. Recolha de Citometria de Fluxo de Dados
Nota: A máquina necessária vai depender da quantidade e natureza dos fluorocromos utilizados.
- Recolher os seguintes parâmetros: o FSC-A, SSC-A, o FSC-H (FSC-W pode ser utilizado em vez do FSC-H) e 7-AAD fluorescência numa escala linear. Recolhe-se o canal de APC numa escala logarítmica. Colete quaisquer canais adicionais necessários para a avaliação dos rótulos superficiais ou internos utilizando uma escala logarítmica.
- Execute comcompensação de sobreposição de sinais em espectros de emissão observada entre diferentes fluorocromos antes de analisar as amostras. Nota: A maioria dos citómetros de fluxo fará isso automaticamente.
- Recolher pelo menos 10.000 eventos para cada amostra.
6. Análise de citometria de fluxo de dados
Nota: FlowJo foi utilizado neste estudo de citometria de fluxo para a análise de dados, mas outros pacotes de software também pode ser usado. A estratégia de propagação é ilustrado na Figura 1.
- Identificar a população de células viáveis utilizando parâmetros FSC-A e SSC-A.
- Dentro desta população excluir dupletos e agregados utilizando FSC-A e FSC-H (FSC-W também podem ser usados aqui).
- Dentro desta população definir um gráfico de pontos utilizando 7-AAD no eixo dos x e BrdU-APC no eixo dos y.
Figura 1: Estratégia Gating Esquerda pa.nel: células ungated são mostrados em um FCS-A vs. SSC-A gráfico de pontos. A população de células viáveis é identificado pela porta mostrado. Centro painel: células fechadas a partir do painel esquerdo são mostrados em uma FSC-A vs. FSC-H gráfico de pontos (FSC-W pode ser usado em vez de altura). Parelhas e agregados são identificados e excluídos pelo portão mostrado. Painel direito: células fechadas a partir da data de exclusão gibão no painel central são mostrados em um 7-AAD vs. APC-A gráfico de pontos. O anticorpo é marcado com BrdU APC permitindo a identificação de células que incorporaram BrdU durante a marcação por pulsos. 7-AAD fornece informações sobre o conteúdo de DNA. O portão superior define células positivas para BrdU e, portanto, na fase S no momento do pulso de BrdU, o portão inferior esquerdo, as células em G 0/1 ea porta inferior direito aqueles em G2 / M. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.- Um ciclo celular nálise
- Abra o ficheiro de dados e primeira porta nas células do portão exclusão dupleto.
- Analisar essa população para distribuição do ciclo celular (localizado sob plataformas em software Flojo) e usar o modelo de Dean-Jett-Fox.
- Obter as posições do G 0/1 e G 2 / M picos utilizando criar portões.
- Porta nas células BrdU positivas e sujeita essa população a mesma análise do ciclo celular.
- Forneça as posições para o G 0/1 e G 2 / M picos aplicando os mesmos portões de criar portas e definir restrições (usando as portas criadas) para as posições do G 0/1 e G 2 / M picos. Isto é ilustrado nos primeiros dois painéis da Figura 2.
Nota: Outro software também pode ser usado para analisar os dados e as instruções iria variar em conformidade.
840 / 52840fig2highres.jpg "width =" 700 "/>
Figura 2:. Progressão do Ciclo Celular O primeiro painel (todas as células) é fechado na população de células definida pela porta exclusão dupleto. Esta população foi exibida num histograma com 7-AAD no eixo dos X. O pico do pico G 0/1 é indicado pela seta por baixo do eixo. Em subsequentes painéis de células positivas para BrdU foram fechado em, como mostrado na Figura 1. O valor para a posição de 0/1 L obtido quando gating da porta exclusão dupleto é aplicada às células positivas para BrdU fechado dentro FlowJo software do ciclo celular. Cada painel posterior foi fechado sobre a população de BrdU positiva, como mostrado na Figura 1 e a posição do pico G 0/1 com base no valor obtido na análise de toda a população, como mostrado nos primeiros dois painéis. Utilizando a fracção negativa BrdU para identificar a localização da população L 0/1 para as células positivas para BrdU no mesmo SAMPle controla por quaisquer ligeiras diferenças na intensidade da mancha de ADN entre as amostras. O número mostrado em cada painel representa o tempo que o pulso de BrdU terminou. As fases do ciclo celular calculados são mostrados em verde com sombra. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esta metodologia pode ser utilizada para obter uma gama de informações. Alguns aplicativos são descritas aqui.
Avaliação da duração do ciclo celular
Para determinar o tempo necessário para que as células de trânsito através do ciclo celular, as células são colhidas em vários pontos de tempo após o pulso de BrdU. Os intervalos entre as avaliações pode ser adaptado para as células particulares a serem analisadas. Linhas de células hematopoiéticas foram avaliadas a cada hora ao longo de um período de 24 horas, na ausência de qualquer tratamento medicamentoso para determinar o comprimento de fases do ciclo celular sob condições de cultura padrão. A Figura 2 mostra uma análise de selecção de células NALM6 instantâneo durante um período de 24 horas. As células em fase S na altura do pulso de BrdU (isto é, dentro da porta de BrdU positiva na Figura 1) evoluíram até G 2 / M, com um pico de células em que a fase do ciclo celular sendo detectada 10 horas após o BrdU pulse. A proporção de células marcadas com BrdU em fase S atingiu o seu ponto mais baixo 14 h após o pulso e quase todas as células tinham retornado a G 1 após 17 h. Por 24 horas de uma parte das células BrdU marcado tinha reentrou fase S como parte de seu próximo ciclo celular indicando que as células podem completar um ciclo celular dentro de 24 horas, porém a maioria ainda não tinha entrado em uma segunda rodada de replicação, consistente com o conhecido 36 h tempo de duplicação para estas células.
A distribuição do ciclo celular pode ser adicionalmente refinado com a inclusão de marcadores adicionais. Por exemplo, a adição de um anticorpo de histona H3 em Ser10 fosforilada (um marcador de células em mitose) permite a discriminação de células em mitose daqueles em G 2 (painéis da Figura 3 à esquerda).
Figura 3: Confirmaçãoda fase do ciclo celular utilizando marcadores adicionais. Os painéis superiores mostram a análise do ciclo celular de células a partir do portão de BrdU positiva, como mostrado na Figura 1. As células foram incubadas na presença ou ausência de 3 nM de vincristina durante 18 horas, após o pulso de BrdU . A análise do ciclo celular foi realizado como descrito na Figura 2. Os painéis inferiores mostram as mesmas células de 7-AAD contra histona H3 fosforilada nos Ser10 gráfico de pontos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Avaliação dos efeitos da droga sobre o ciclo celular
Os agentes citotóxicos podem ter efeitos profundos sobre o progresso do ciclo celular e podem induzir a morte celular. O efeito da droga sobre a progressão do ciclo celular pode ser avaliada pela adição dos fármacos de interesse após o pulso de BrdU. Dois exemplos são mostrados. A primeira era uma situação em que a indução Of morte celular confundido a análise dos dados do ciclo celular (painéis da direita da Figura 3). NALM6 células foram expostas a 3 nM de vincristina durante 18 horas, após o pulso de BrdU. As células foram esperado para prender na mitose como alvos vincristina microtúbulos. No entanto, a análise do ciclo celular sugeriu que as células não tinham prendido mas transitado através de G 0/1 (Figura 3 painel superior direito). A adição de um anticorpo de histona H3 em Ser10 fosforilada mostraram que as células não tinha saído mitose (Figura 3 painel inferior direito), apesar de ter um teor de ADN reduzida. É provável que o teor de ADN foi reduzida porque as células estavam a sofrer apoptose e tinha começado a degradar o seu DNA. Uma vez que as células da apoptose iniciado enquanto na mitose (isto é, com o DNA 4N), que aparecem como fase S ou G 0/1 células em vez de do sub-apoptótica típica L 1 pico.
Figura 4:. A detecção de fase do ciclo celular morte específica Os gráficos de pontos mostram a percentagem de células positivas para BrdU que permanecem na cultura de 24 horas após o pulso de BrdU. As células foram cultivadas na presença ou ausência do veículo sozinho (controle), 1,5 ou 16 uM RAD001 uma vez que o fim do impulso de BrdU. O painel inferior mostra a percentagem de células que eram BrdU positiva sobre a incubação de 24 horas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em outro exemplo, a Figura 4 mostra como, na presença de uma baixa concentração de RAD001 (um inibidor de mTOR) as células foram capazes de completar o ciclo celular, mas, em seguida, foram submetidos a um atraso ou paragem em G 0/1. Uma concentração mais elevada de células de RAD001 tra amplamente prevenidansiting através de G 0/1. Importante células em fase S (ou seja, de BrdU positiva) foram mostrados para desaparecer preferencialmente a partir da cultura quando RAD001 foi adicionado. Isto sugere que as células que passam através de G2 / M foram mais susceptíveis à morte celular por este agente 12.
É também possível examinar respostas de células em fases específicas do ciclo celular utilizando anticorpos para antigénios específicos. Na Figura 5 a activação do checkpoint do ciclo celular controlar proteínas cinases Chk1 e Chk2, em resposta ao tratamento com vincristina é mostrado. Chk1 e Chk2 são activadas por fosforilação em Ser345 e Thr68, respectivamente. A activação de cinases Chk1 e Chk2 pode ser visto em células que parecem ter um teor de ADN 2N, mas como mostrado na Figura 5 são provavelmente células em mitose que têm início a degradação de ADN, como resultado da apoptose.
É possível adicionar fármacos em vários pontos de tempo após aPulso de BrdU para examinar o efeito do agente em células em diferentes fases do ciclo celular.
Figura 5:. A detecção de alterações nas células em fases do ciclo celular particular, o painel superior mostra as células gated em células positivas para BrdU, como na Figura 1 em 7-AAD vs Chk1 fosforilada (esquerda) ou Chk2 (direita) gráficos de pontos. As células haviam sido cultura durante 18 horas após o pulso de BrdU na presença ou ausência de 3 nM de vincristina como para a Figura 3. Os painéis inferiores mostram os histogramas de sobreposição das mesmas células gated em cada fracção 2N ou 4N, conforme indicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A capacidade de analisar o ciclo celular é importante para a compreensão da biologia do cancro e o mecanismo de acção de ambas as drogas e os genes que influenciam a proliferação das células e o crescimento. Embora haja um grande número de ensaios que medem a proliferação celular supostamente, a maioria só fornecem uma medida que indica as células Número presente. Estes incluem ensaios que medem o número de células por visualização direta e contando, atividade metabólica ou concentração de ATP. A principal vantagem de muitos destes métodos é que eles são relativamente fáceis de executar e passíveis de formatos de microplacas e automação, tornando-os úteis para o rastreio de um grande número de condições ou compostos. Uma desvantagem de muitos destes métodos é que a perda celular devido a morte não é tomada em consideração, potencialmente conduzindo a uma sub-estimativa da proliferação celular. Também estes métodos de medir a população a granel e não permitem o estudo de células individuais ou o trânsito de células atravéso ciclo celular.
Dos ensaios de proliferação comumente usados, talvez o mais fiáveis e precisas são aqueles que medem a síntese de DNA. Os ensaios de proliferação de células tradicionais incubar as células durante algumas horas até durante a noite com 3 H-timidina, a qual é incorporada no ADN sintetizado de novo. 13 O problema óbvio com este método é o uso de materiais radioactivos, mas uma outra limitação é que as medidas de resultado da média proliferação de uma população de células. BrdU pode ser utilizado de forma semelhante, sem os problemas de radiação, embora sejam necessários passos adicionais e de BrdU é um mutagéneo potencial. No entanto, BrdU tem a vantagem de ser compatível com citometria de fluxo, permitindo a análise de células individuais. 14 Outros métodos de citometria de fluxo compatíveis para a avaliação da proliferação de células ao nível da célula individual incluem um número crescente de corantes que rotulam a membrana celular ou proteínas celulares ( por exemplo CFSE) que dividem entre daughtcélulas er, corantes intercalantes de DNA e ciclo celular detecção do antígeno específico por anticorpos. O melhor de corantes de rotulagem célula permitir um acompanhamento divisão celular ao longo de um certo número de divisões de células. 15 Eles fornecem uma medida directa da proliferação, embora nenhuma informação sobre a fase do ciclo celular ou da distribuição é obtida. A medição do teor de ADN, utilizando ADN corantes intercalantes, tais como iodeto de propídio ou 7-AAD fornecem forte distribuição do ciclo celular de 16, mas não temporal de dados. Mesmo com a avaliação de vários pontos de tempo que continua a ser possível avaliar o comprimento do ciclo celular ou a fases específicas do ciclo celular. Antigénios específicos do ciclo celular pode ser utilizada para avaliar a fase do ciclo celular numa população de células não sincronizado. Antigénios específicos do ciclo celular vulgarmente utilizados incluem Ki-67, 17, que é expresso durante as S, G2 e M as fases do ciclo celular, mas não G durante 0/1, PCNA (antigénio nuclear de proliferação celular) 18, e fosforilação de histone H3. 19 Enquanto estes fornecem bons dados sobre a fase do ciclo celular, informações relativas a dinâmica do ciclo celular está faltando.
Obtenção de dados sobre a dinâmica do ciclo celular tem sido tradicionalmente analisada por meio da sincronização células usando agentes ou condições de cultura que bloqueiam a progressão do ciclo celular. Isto provoca uma acumulação de células por trás do bloco, que uma vez removido, resultam em onda de células que progridem em conjunto através do ciclo celular. 1 O cálculo da duração do ciclo celular e o comprimento das várias fases do ciclo celular é então possível. As células podem ser induzidas a sair do ciclo celular activo entrando L 0 por privação de soro. Após a re-adição de soro as células podem, em seguida, se movem juntos em fases subsequentes. 20 Embora este seja um método fiável para certos tipos de células, outros, incluindo muitos tipos de células transformadas, não conseguem sair do ciclo celular e, frequentemente, sofrem morte celular como um resultado. 21 De fato nossa stumorre encontrei este para ser a situação para as células de leucemia linfoblástica aguda. Além disso, as células não conseguem, muitas vezes, reentrar no ciclo celular de uma forma suficientemente sincronizada. Os métodos químicos pode ser utilizado para induzir a paragem do ciclo celular em fases específicas do ciclo celular. Por exemplo, agentes que impedem a síntese de ADN (por exemplo, excesso de timidina) ou impedir a formação do fuso mitótico (por exemplo, nocodazol) células de prisão em fases S e M, respectivamente, mas são tóxicos e podem resultar em perturbações do crescimento e até mesmo a morte em uma proporção significativa do 22 células. Em todas as células estes métodos falharam a prender a maior parte das células sem matar uma fracção significativa. Considerando que o objectivo foi avaliar os efeitos de um potencial agente anti-leucémica sobre os parâmetros do ciclo celular, a morte celular resultante de sincronização era inaceitável. Apesar da descrição de um grande número de métodos para sincronizar as células, todos têm deficiências. Os principais problemas são: uma insuficienteenriquecimento para células na parte desejada do ciclo celular, perturbações da fisiologia normal do ciclo celular ou, como observado, o excesso de toxicidade.
O método descrito aqui é uma simples extensão do sistema de impulsos muito utilizado, em que as células são incubadas durante um breve período com BrdU para identificar as células na fase S. Nós achamos um pulso de 45 min para ser óptima no nosso sistema, mas os períodos de tempo mais curtos pode ser usado se for obtida a rotulagem suficiente. Ao continuar a cultura de células após a remoção do BrdU é possível controlar a sua progressão através do restante da fase S, G2, mitose, G1 e entrada para o próximo ciclo celular. Pode ser possível seguir as células mais. A vantagem deste sistema é que não há nenhuma evidência de toxicidade para as células no prazo destas experiências e há uma interrupção mínima para o crescimento das células, uma vez que apenas um par de meios de comunicação são necessárias mudanças. As células são mantidas em caso contrário conticultura nuous. A citometria de fluxo baseada na natureza do método significa que ele pode ser combinado com a identificação de subpopulações de células pela superfície adicional ou coloração intracelular. Foram utilizados anticorpos para BrdU conjugado com APC, mas outros conjugados pode ser substituído para facilitar o desenvolvimento de painéis de anticorpos. Utilizou-se 7-AAD, em vez de iodeto de propídio porque 7-AAD fluoresce em um único canal de opções para maximizar coloração multicolor. Da mesma forma DAPI ou Hoechst podem ser utilizadas como corantes de ADN, mas exigem um laser de UV. CVs mais rígidas para a coloração do DNA podem ser obtidas utilizando a fixação de etanol, mas isso freqüentemente compromete a coloração de anticorpos, limitando as opções para a superfície adicional ou manchas citoplasmáticos. A maior desvantagem é que S fase dura cerca de 8 horas, de modo células marcadas pode ter acabado de entrar ou prestes a sair da fase S durante o período de pulso. Como resultado, a sincronização não é tão apertada como com alguns outros sistemas. No entanto, através da combinação da marcação com BrdU com corantes de ADN, indicandoconteúdo e anticorpos para proteínas dependentes do ciclo celular específicos, dados fortes podem ser obtidos.
A fim de obter dados consistente é importante para assegurar que as células estão na concentração correcta e que a concentração de células é consistente em todas as condições a serem comparadas. Criticamente o brilho da coloração com 7-AAD é muito sensível à concentração de células. Utilizando um sistema de contagem de células automatizado pode ajudar a assegurar que as concentrações de células são consistentes em todas as amostras em cada etapa do processo. Outro ponto importante é o período de tempo, as células são expostas a BrdU. Pequenas variações podem traduzir-se em diferenças consideráveis, por isso, é importante que todas as amostras são incubadas com BrdU para precisamente ao mesmo tempo. Finalmente, é importante para titular anticorpos para obter uma óptima coloração e este deve ser repetido sempre que um lote é alterado. Se todos os passos são seguidos de forma consistente e concentrações de células mantida constante, então este metod permitirá fiavelmente a identificação de células através do ciclo celular, sem a necessidade de sincronização. Há também uma margem considerável para modificar este método para atender determinados tipos de células e tratar de questões específicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150 cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200 µl | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1 ml | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
References
- Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Harper, J. W., Elledge, S. J. The DNA damage response: ten years after. Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).
- Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218, 474-475 (1982).
- Carayon, P., Bord, A. Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA. Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).
- Gonchoroff, N. J., et al. S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment. Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).
- Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells. Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).
- Hendzel, M. J., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106, 348-360 (1997).
- Draetta, G., Beach, D. Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement. Cell. 54, 17-26 (1988).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. , (2012).
- Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester. Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).
- Beck, H. P. Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine. Cytometry. 2, 170-174 (1981).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells. Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).
- Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67. Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).
- Danova, M., et al. Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors. Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).
- Juan, G., et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry. 32, 71-77 (1998).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).
- Kues, W. A., et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).
- Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization. Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).
