Summary
Этот протокол описывает использование бромдезоксиуридин (BrdU) поглощения, чтобы разрешить временную отслеживание клеток, которые были в S фазе на определенный момент времени. Добавление красителей ДНК и маркировки антител способствует детальный анализ судьбы S фазовых клеток в более поздние времена.
Introduction
Оценка возможностей клеточного цикла и изменений, которые происходят в клетках в течение клеточного цикла является фундаментальным для понимания многих аспектов биологии, в частности биологии рака. Многие агенты в развитии для лечения злокачественных опухолей оказывают глубокое воздействие на прогрессирование клеточного цикла или индуцируют гибель клеток с помощью клеточного цикла зависимых механизмов-. С целью изучения динамики клеточного цикла или клеток в определенной фазе клеточного цикла, обычно для синхронизации клеток. Однако методы синхронизации может иметь пагубные последствия для клеток изучаются, потенциально сомнительных полученные результаты. 1 Недавно использование флуоресцентно меченых белков, которые присутствуют только в конкретных фаз цикла клетки имеют разрешенное анализ клеточного цикла в одиночных камерах в течение долгого времени 2, однако эти клетки должны быть изучены необходимость быть генетически манипулировать, чтобы выразить эти меченных белков, ограничивает их использование в системах, где это может быть прочитанаIly достигнута.
Клеточный цикл состоит из двух активных фаз: синтез-(S) фазы, где ДНК репликации и митоза (М), где деление клеток имеет место. Эти фазы разделяют три фазы пробел, G 0, G 1 и G 2. G 0 или неподвижность, это фаза отдыха, где клетка оставил цикл, G 1, когда клетки увеличиваются в размере до репликации ДНК и G 2, где рост клеток продолжается между завершением репликации ДНК, но до деления клеток. Прогрессирование через клеточный цикл контролируется числом пропускных пунктов. G 1 пункт пропуска активируется, когда условия окружающей среды не поддерживают синтеза ДНК и предотвращает попадание в S фазе. Фаза контрольно-пропускной пункт или задержка внутри S могут быть вызваны повреждением ДНК, что может привести к тупик вилки репликации. Во G 2 верность реплицированного ДНК подтвердил, и если обнаруживается дефект, то G 2 3 Активация этих пропускных пунктах обычно используется для синхронизации клеточных популяций. Контрольные клеточного цикла могут быть активированы с помощью целого ряда факторов, но в биологии рака наиболее распространенным является обнаружение повреждения ДНК. Реакция повреждение ДНК инициируется PI3-киназы-подобных киназ атаксии телеангиэктазии и Rad3 связанной (ATR) и атаксия-телеангиэктазия мутантный (ATM), что активации эффекторных киназ вниз по течению Chk1 и Chk2, соответственно. 3 спектр событий активирует Chk1 в том числе в тупик вилки репликации, сшивки ДНК, и ультрафиолетовое излучение, а ущерб Chk2 в первую очередь активируется двунитевых разрывов.
Обычный метод для изучения влияния изменившихся условий на длине I клеточного циклас синхронизировать клетки в определенной фазе клеточного цикла. 1 Это может быть достигнуто с помощью нескольких способов. Клетки могут быть физически разделены в зависимости от размера, плотности, боковое рассеивание (зернистости), и маркеров экспрессии клеточной поверхности. С практической точки, клетки могут быть синхронизированы с помощью химических средств. Несколько агенты, такие как гидроксимочевина тимидина, и цитозинарабинозидом может быть использовано, чтобы ингибировать синтез ДНК в S фазе клеточного цикла, что приводит к накоплению клеток в S фазе, которые продолжают велосипеде после агенты не будут удалены. Клетки обрабатывали нокодазолом, что предотвращает образование митотического веретена, остановки с G 2 - или М-фазы содержанием ДНК. Ликвидация сыворотки из результатов культуральной среды в накоплении клеток в G 0 фазе. Повторное добавление питательных веществ в культуре сыворотки возобновит нормальную велосипеде клеток. Тем не менее, все эти методы синхронизации мешать нормальной езды на велосипеде и рост клеток и может Ресулт в значительной гибели клеток.
Синхронизация острого лимфобластного лейкоза клеток является особенно сложным, и эти клетки не поддаются генетической манипуляции. Описанный здесь метод позволяет оценить динамику клеточного цикла и исследование клеток в отдельных фаз клеточного цикла без традиционных синхронизации или генетической модификации. Этот метод также может быть полезен для других типов клеток, где генетическая модификация и традиционные процедуры синхронизации не легко достигается. Метод основан на давние использования бромдезоксиуридина (BrdU) регистрации, которая имеет очень небольшое влияние на краткосрочный рост и пролиферацию клеток. 4 Установленные протоколы BrdU воспользоваться включения BrdU во вновь синтезированной ДНК во время S фазы , Это постоянно отмечает клетки, побывав в S фазе во время экспозиции BrdU. Это население может быть идентифицирован в более поздние моменты времени путем окрашивания BrdU для incorporвания и тем самым выступать в качестве синхронизированной населения, которые могут применяться, и в течение долгого времени оценочной позволяет изучение эффектов препарата по транзиту клеточного цикла. BrdU нужно подвергаться до окрашивания антител, как правило, достигается следующее ДНКазы или кислотной обработки. 6,7 Использование проточной цитометрии для обнаружения BrdU включены позволяет включение дополнительных маркеров. Наиболее важным является использование красителей для измерения содержания ДНК, позволяя оценку фазы клеточного цикла распределения клеток, которые были в S фазе в начале исследования. 8 Кроме дополнительные поверхности или внутриклеточные антигены также могут быть изучены. 9 Они может относиться к событиям клеточного цикла, таких как Ki67 или, казалось бы, не связанных между собой функций клеток, таких как апоптоз маркеров, как расщепляется каспазы-3. Потенциальные применения ограничены фантазией исследователя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол, описанный здесь, использует острый лимфобластный лейкоз линию клеток NALM6 но может быть применено к другим типам клеток.
1. Решения и реагенты
- Полный RPMI
- Добавить 56 мл фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 5,5 мл 200 мМ L-глутамина в 500 мл бутылку среде RPMI-1640.
- BrdU со Решение
- Подготовьте 32,5 мМ BrdU (10 мг / мл) в Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (DPBS).
- BrdU Полный RPMI
- Добавить 6,2 мкл исходного раствора BrdU в 10 мл полной среды RPMI.
- ДНКазы решение
- Подготовьте 1 мг / мл ДНКазы в DPBS.
- Окрашивание буфера
- Готовят 3% инактивированной нагреванием ФТС и 0,09% азида натрия в DPBS.
- Обратитесь к Список материалов для определения фиксации буфера, пермеабилизирующего буфера и промывочного буфера.
2. Клетки
НетTe: Клетки не культивировали в течение более 6 месяцев. Этот метод напрямую адаптируется к любой неадгезированных клеточной линии с корректировкой плотности клеток и питательных сред. Использование клеток, которые экспоненциально растет с начала эксперимента.
- Поддержание NALM6 клеток в Т-75 колбы с культурой в полном RPMI. Выполните все шаги в стерильных условиях, используя класс Кабинета II биобезопасности.
- Поддержание NALM6 клетки между 1-2 х 10 6 клеток на мл, разделив культуры трижды в неделю.
- Инкубировать при 37 ° С в 5% СО 2 в воздухе.
3. Импульсный маркировки клеток с BrdU
ВНИМАНИЕ: Обращайтесь BrdU с осторожностью, поскольку это потенциальная мутагенным и тератогенным.
- Центрифуга клетки при 150 мкг в течение 5 мин. Примечание: Передача клеток в свежую среду улучшает воспроизводимость результатов.
- Выполните подсчет клеток и ресуспендирования клеток в RPMI Полный на 2 х 10 6 СELLS / мл.
- Развести ячеек 1 в 2 с BrdU Полный RPMI получения конечной концентрации клеток 1 × 10 6 клеток / мл.
- Инкубируют при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 45 мин, затем разбавленным ячеек 1 в 10 с полной среде RPMI. Центрифуга клетки при 150 мкг в течение 5 мин и осторожно выбросить всю супернатанта.
- Ресуспендируют клеток в небольшом объеме (~ 100 мкл) полного RPMI, выполнить подсчет клеток и корректировать до 1 × 10 6 клеток / мл.
- Пипетка 1 мл клеток в лунки 48-луночного планшета. Внесите 1 мл DPBS в любых незанятых скважин для получения более воспроизводимые результаты.
- Инкубировать при 37 ° С в 5% СО 2 в воздухе в течение желаемых временных точках, здесь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, и 24 ч. Примечание: Длина и время будет зависеть от того, опытно-конструкторских является измерение.
- Перенесите все клетки в FACS труб с использованием пипетки. Промыть последовательно а 1 мл VoluМЭС PBS до конечной общего объема 5 мл.
- Центрифуга при 150 х г в течение 5 мин и тщательно удалить все супернатанта. Клетки готовы к окрашиванию, выполните это (раздел 4) немедленно.
4. Сотовый Окрашивание
Примечание: Если поверхность окрашивание клеток требуется выполнить его до фиксации, гарантируя, что клетки выдерживали при 4 ° С на протяжении.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл окрашивающего буфера (для дополнительного окрашивания поверхности, добавить рекомендуемый объем антитела к поверхностным антигенам и инкубируют в течение 30 мин при 4 ° С).
- Добавить 1 мл окрашивающего буфера, центрифугируют в течение 5 мин при 150 х г и отбросить супернатант.
Примечание: специфическое антитело, концентрации, времени инкубации и т.д. будет варьироваться в зависимости от конкретных экспериментальных целей. - Фиксация и проницаемости
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл буфера фиксации и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Добавить 1 мл ое промывочный буфер, центрифуги в течение 5 мин при 150 мкг и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл буфера пермеабилизации и инкубируют клетки в течение 10 мин на льду.
- Добавить 1 мл промывочного буфера, центрифуг в течение 5 мин при 150 мкг, и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл буфера фиксации на пробирку и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавить 1 мл промывочного буфера, центрифуг в течение 5 мин при 150 мкг, и отбросить супернатант.
Примечание: протокол может быть приостановлена здесь, если требуется. Фиксированные клетки стабильны в течение нескольких дней при температуре 4 ° С, если ресуспендировали в буфере для окрашивания. Снимите буфер окрашивания После центрифугирования прежде чем продолжить.
- ДНКазы лечение
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл ДНКазы раствора (30 мкг ДНКазы / 10 6 клеток) и инкубируют клетки в течение 1 часа при 37 ° С.
- Добавить 1 мл промывочного буфера, центрифугируют при 150 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант.
- Антитела Окрашивание
Примечание: Окрашивание для других, чем BrdU внутриклеточных маркеров могут быть выполнены одновременно с окрашиванием BrdU.- ВАЖНО: Подготовка компенсации управления, состоящие из неокрашенных клеток и клеток, меченных каждого отдельного флуорохромом. В идеале, использовать одни и те же антитела для управления компенсации, как те, которые используются в экспериментальных трубок. Однако, если это невозможно, заменяющие антитела к высоким уровнем экспрессии антигенов, конъюгированный с той же флуорохромом.
- Ресуспендируют клеток в 50 мкл промывочного буфера и добавить 1 мкл / 10 6 клеток BrdU антителами. Примечание: Непосредственно конъюгированные антитела к другим антигенам специфическими внутриклеточными также могут быть добавлены.
Примечание:. Антитела к гистона Н3 фосфорилированным по Ser10 может быть использовано для различения клеток в G2 и М, гистона H3 фосфорилируется по Ser10 при митозе 10 Антитела к cdc2 фосфорилируется на Tyr15 может быть использован для обнаружения клеток, которые HAVе стремится к митоза. 11 - Инкубируйте клетки в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Добавить 1 мл промывочного буфера, центрифуг клетки при 150 мкг в течение 5 мин и отбросить супернатант.
- Пятно ДНК анализа клеточного цикла
- Ослабьте осадок и добавить 20 мкл раствора 7-АСР (0,25 мкг). Примечание: Очень важно, чтобы использовать постоянное количество 7-АСР / клетку.
- Ресуспендируют клеток в 1 мл окрашивающего буфера.
5. Сбор данных проточной цитометрии
Примечание: машина необходимую будет зависеть от количества и характера используемых флуорохромами.
- Собирают следующие параметры: ЛПС-А, SSC-ЛПС-Н (FSC-W может быть использован вместо FSC-H) и флуоресценции 7-АСР на линейной шкале. Соберите канал APC по логарифмической шкале. Соберите все дополнительные каналы, необходимые для оценки поверхностных или внутренних меток с использованием логарифмической шкалы.
- Выполните компенсации перекрытия сигналов в спектрах излучения наблюдалось между различными флуорохромами прежде чем анализировать образцы. Примечание: Большинство цитометров потока будет выполнять это автоматически.
- Собирают по меньшей мере 10000 события для каждого образца.
6. Анализ проточной цитометрии данных
Примечание: FlowJo был использован в данном исследовании для проточной цитометрии анализа данных, но другие программные пакеты также могут быть использованы. Стратегия стробирования показано на рисунке 1.
- Определить жизнеспособной популяции клеток с использованием параметров FSC-A и SSC-A.
- В этой популяции исключить дублеты и агрегаты с использованием FSC-A и FSC-H (FSC-W также может быть использован здесь).
- В этой популяции установить точка участок с использованием 7-AAD на оси х и BrdU-АПК по оси ординат.
Рисунок 1: Память Стратегия слева годовых.нель: ungated клетки показано на FCS-A против SSC-точка участка. Жизнеспособным клеточной популяции идентифицируется ворот, показанного. Панель центр: клетки закрытых из левой панели показаны на FSC-A против FSC-Н точка участка (FSC-W может быть использован вместо высоты). Дублеты и агрегаты идентифицируются, и исключается ворот показано на рисунке. Правая панель: клетки закрытых от дублета даты исключения в центральной панели показаны на 7-AAD против APC-точка участка. BrdU антитело мечено APC позволяет идентифицировать клетки, которые включили BrdU в течение импульса маркировки. 7-AAD предоставляет информацию о содержании ДНК. Верхняя ворота определяет клетки положительные для BrdU и, следовательно, в S фазе в момент BrdU импульса, в нижнем левом ворот, клеток в G 0/1 и нижней правой ворот тех в G 2 / M. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть крупная версия этой фигуры.- Клеточного цикла нализ
- Откройте первый файл данных и ворота на клетки в дублет исключения ворот.
- Анализ этой группы населения для распределения клеточного цикла (находится под платформы в программном обеспечении FloJo) и использовать модель Дина-Джетт-Fox.
- Получите позиции G 0/1 и G 2 / M пики, использующие создать ворота.
- Ворота на BrdU положительных клеток и субъекта этого население же анализа клеточного цикла.
- Обеспечить позиции для G 0/1 и G 2 / M пики применяя те же самые ворота из ворот создания и настройки ограничений (с использованием созданных ворота) для позиций G 0/1 и G 2 / M пиков. Это показано в первые 2 панелей фиг.2.
Примечание: Другие программы также могут быть использованы для анализа данных, а также инструкции будет меняться соответственно.
840 / 52840fig2highres.jpg "ширина =" 700 "/>
Рисунок 2:. Клеточного цикла прогрессии первая панель (все ячейки) закрытого на клеточной популяции, определяемой дублет исключения ворот. Это население было отображается на гистограмме с 7-AAD на оси абсцисс. Пик G 0/1 пика обозначено стрелкой ниже оси. В последующие панелей BrdU положительных клеток были воротами на, как показано на рисунке 1. Значение для G 0/1 позиции, полученного при стробирования в дублет исключения ворот применяется к BrdU положительных клеток в закрытых программного обеспечения клеточного цикла FlowJo. Каждый последующий панель закрытого на положительной популяции BrdU, как показано на фиг.1 и положением пика G 0/1 на основе значения, полученного при анализе все население, как показано в первых двух панелей. Использование отрицательного фракции BrdU чтобы определить местоположение населения G 0/1 для BrdU-положительных клеток в той же SAMPле контролирует любые незначительные различия в интенсивности окраски ДНК между образцами. Показано на каждой панели число представляет собой время, так как импульс BrdU закончился. Фазы клеточного цикла расчетные приведены в затененной зелени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эта методика может быть использована для получения различной информации. Через несколько приложений изложены здесь.
Оценка длительности клеточного цикла
Чтобы определить время, необходимое для клеток транзит через клеточного цикла, клетки собирают в различные моменты времени после импульса BrdU. Интервалы между оценками может быть приспособлено к конкретным клеткам анализируемых. Кроветворных клеточные линии были оценены каждый час в течение 24 ч в отсутствие какого-либо лекарственной терапии, чтобы определить длину фазах клеточного цикла в стандартных условиях культивирования. Рисунок 2 показывает выбор снимка анализа NALM6 клеток в течение периода 24 ч. Клетки в S фазе при времени BrdU импульса (т.е. в положительном ворот BrdU на фиг.1) был достигнут прогресс благодаря G 2 / М, с пиком клеток в этой фазе клеточного цикла обнаружения 10 ч после BrdU рulse. Доля BrdU меченых клеток в S фазе достигла Надир 14 ч после импульса и почти все клетки вернулись к G 1 после 17 часов. К 24 ч доля BrdU меченых клеток были вернулся S фазу в рамках своего следующего клеточного цикла, указывая, что клетки могут завершить клеточный цикл в течение 24 часов, однако большинство из них еще не вступил второй раунд репликации, в соответствии с известным 36 ч время удвоения для этих клеток.
Распределение клеточного цикла может быть доработан путем включения дополнительных маркеров. Например, добавление антитела к фосфорилированным гистона H3 на Ser10 (маркера клеток в митозе) позволяет дискриминацию клеток в митозе от тех, в G 2 (слева панели, показанной на фиг.3).
Рисунок 3: Подтверждениеклеточного цикла стадии Использование дополнительных маркеров. Верхние панели показывают анализ клеточного цикла клеток с положительной ворот BrdU, как показано на рисунке 1. Клетки были инкубированы в присутствии или в отсутствие 3 нМ винкристина в течение 18 часов после BrdU импульса , Анализ клеточного цикла проводили, как описано на рисунке 2. Нижние панели показывают те же клетки на 7-AAD vs. гистона H3 фосфорилированы на Ser10 точка участка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Оценка эффектов лекарств на клеточного цикла
Цитостатики может иметь серьезные последствия для прогресса клеточного цикла и может вызвать гибель клеток. Эффект препаратов на прогрессирование клеточного цикла может быть оценена путем добавления интересующих лекарственных средств после BrdU импульса. Два примера приведены. Первым был ситуация, когда индукция огибель клеток е посрамлены анализ данных клеточного цикла (правый панелях рис 3). NALM6 клетки подвергались воздействию 3 нМ винкристина в течение 18 часов после BrdU импульса. Клетки, как ожидается, арестовать в митозе, как винкристин мишеней микротрубочек. Однако анализ клеточного цикла предположил, что клетки не арестован, но транзитом до G 0/1 (рис 3 верхняя правая панель). Добавление антитела к фосфорилированным гистона H3 на Ser10 показали, что клетки не выходили митоз (Рисунок 3 ниже, справа), несмотря на то, пониженное содержание ДНК. Вполне вероятно, что содержание ДНК была снижена, потому что клетки апоптоза и начали ухудшать их ДНК. Поскольку клетки инициативе апоптоз в митоза (т.е. с 4 н ДНК), они появляются как S фазы или G 0/1 клеток вместо типичного апоптическая суб-G 1 пика.
Рисунок 4:. Обнаружение клеточного цикла Этап удельным убийство точечные графики показывают процент BrdU-позитивных клеток, оставшихся в культуре через 24 часа после BrdU импульса. Клетки культивировали в присутствии или в отсутствии транспортного средства в одиночку (контроль), 1,5 или 16 мкМ RAD001 после окончания импульса BrdU. Нижняя панель показывает процент клеток, которые были BrdU положительные по 24 ч инкубации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
В другом примере, на рисунке 4 показано, как в присутствии низкой концентрации RAD001 (MTOR ингибитора) клеток смогли завершить клеточный цикл, но потом прошли задержку или арест в G 0/1. Более высокая концентрация RAD001 основном предотвратить клетки от TRAnsiting до G 0/1. Важно клетки в S фазе (т.е. BrdU положительные) было показано, преимущественно исчезают из культуры, когда RAD001 был добавлен. Это говорит о том, что клетки, проходящие через G 2 / M были более чувствительны к гибели клеток с помощью этого средства. 12
Кроме того, можно исследовать реакцию клеток в отдельных фаз клеточного цикла с использованием антитела к специфическим антигенам. На рисунке 5 активации контрольно-пропускного пункта клеточного цикла контрольного белки Chk1 и chk2 в ответ на лечение винкристин показано. Chk1 и Chk2 активируются с помощью фосфорилирования Ser345 на и Thr68 соответственно. Активация Chk1 и Chk2 можно увидеть в клетках, которые появляются, чтобы содержание ДНК 2N, но, как показано на рисунке 5, вероятно, будут клетки в митоз, что уже начато деградации ДНК в результате апоптоза.
Можно добавить наркотики в различные моменты времени послеBrdU импульса, чтобы изучить эффект агента на клетки на различных этапах клеточного цикла.
Рисунок 5:. Обнаружение изменений в клетках, в частности фазах клеточного цикла верхняя панель показывает клетки стробированных на положительных клеток BrdU как показано на рисунке 1, в 7-AAD против фосфорилированного Chk1 (слева) или chk2 (справа) точечных участков. Клетки были культуры в течение 18 часов после BrdU импульса в присутствии или в отсутствие 3 нМ винкристина, как для фиг.3. Нижние панели показывают наложения гистограммы тех же клетках закрытых либо на 2N или 4N фракции, как указано. Пожалуйста, нажмите здесь Чтобы смотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Способность к анализу клеточного цикла имеет важное значение для понимания биологии рака и механизма действия обоих препаратов и генов, которые влияют на пролиферацию и рост клеток. В то время как есть множество анализов, которые, как сообщается измерения пролиферации клеток, большинство только обеспечить меру, указывает количество клеток присутствуют. Они включают в себя анализы, которые измеряют количество клеток по прямой визуализации и подсчета, метаболической активности или АТФ концентрации. Основным преимуществом многих из этих методов является то, что они относительно легко выполнить и поддаются форматов микропланшетов и автоматизации, что делает их полезными для скрининга большого количества условий или соединений. Недостатком многих из этих методов является то, что потеря клеток из-за смерти не приняты во внимание, что потенциально ведет к недооценке клеточной пролиферации. Кроме того, эти методы измерения объемной населения и не позволяют изучать отдельные клетки или транзит клеток черезклеточного цикла.
Из широко используемых анализах пролиферации, возможно, самых надежных и точных те, которые измеряют синтез ДНК. Традиционные анализы пролиферации клеток инкубировать клетки в течение нескольких часов до ночи с 3 H-тимидина, который включен во вновь синтезированную ДНК. 13 очевидная проблема с этим методом является использование радиоактивных материалов, но одно ограничение состоит в том, что в результате мероприятий в среднем Распространение в популяции клеток. BrdU может быть так же использован без проблем излучения, хотя требуются дополнительные шаги и BrdU является мутагенным потенциалом. Тем не менее, BrdU имеет то преимущество, что совместимо с проточной цитометрии, позволяющие анализ отдельных клеток. 14 Другие проточной цитометрии совместимых методов оценки пролиферации клеток на одном уровне клеток включают большее число красителей, которые этикетке клеточной мембраны или клеточных белков ( например CFSE), что разделить между daughtER клетки, ДНК интеркалирующих красители и клеточный цикл обнаружения антигена антителами. Лучше маркировки клеток красителей позволяют отслеживать деление клеток в течение ряда клеточных делений. 15 Они обеспечивают прямое измерение пролиферации, хотя никакой информации об этапе или распределения клеточного цикла не получается. Измерение содержания ДНК с помощью ДНК-интеркалирующего красители, такие как пропидийиодидом или 7-ААР обеспечить надежную распределение клеточного цикла 16, но не временное, данные. Даже при оценке различные моменты времени остается невозможным оценить длину клеточного цикла или конкретных фазах клеточного цикла. Клеточного цикла специфические антигены могут быть использованы для оценки фазы клеточного цикла в несинхронизированной клеточной популяции. Обычно используется клеточного цикла конкретные антигены включают Ki-67, 17, которая выражается во время S, G 2 и М фазах клеточного цикла, но не во время G 0/1, PCNA (пролиферирующих клеток ядерного антигена) 18 и фосфорилирования чistone Н3. 19 Хотя эти обеспечивают хорошие данные о стадии клеточного цикла, информацию о динамике клеточного цикла не хватает.
Получение данных о динамике клеточного цикла традиционно был рассмотрен синхронизации клеток с использованием агентов или условий культивирования, которые блокируют прогрессирование клеточного цикла. Это приводит к накоплению клеток позади блока, что после удаления, в результате волне клеток прогрессирующих вместе через клеточного цикла. 1 Расчет продолжительности клеточного цикла и длины различных фазах клеточного цикла становится возможным. Клетки могут быть вызваны для выхода активная ячейка велосипеде ввод G 0 сыворотки лишения. По повторного добавления сыворотки клетки могут затем двигаться вместе в последующих этапах. 20 В то время как это надежный способ для некоторых типов клеток, другие, в том числе многих типов клеток, трансформированных, не выходят из клеточного цикла и часто подвергаются клеточной гибели, как Результат. 21 Действительно наша стуумирает нашел, что это будет ситуация для острого лимфобластного лейкоза клеток. Кроме того, клетки часто не повторно клеточный цикл в достаточно синхронно. Химические методы могут быть использованы для индуцирования клеточного цикла в конкретных фазах клеточного цикла. Например, агенты, которые препятствуют синтезу ДНК (например, превышение тимидина) или предотвратить образование митотического веретена (например, нокодазол) арест клеток в S и M фаз соответственно, но являются токсичными и могут привести к нарушению роста и даже смерти в значительной части клетки. 22 во всех клетках эти методы не смогли арестовать большинство клеток, не убивая значительную часть. Учитывая, что целью было оценить влияние потенциального противолейкемическую агента по параметрам клеточного цикла, гибель клеток в результате синхронизации неприемлемо. Несмотря описание большого количества методов для синхронизации клеток, все они имеют недостатки. Основными проблемами являются: недостаточнообогащение клеток в нужной части клеточного цикла, нарушения в нормальной физиологии клеточного цикла или, как это наблюдалось, избыток токсичности.
Метод, описанный здесь, простое расширение давно используется импульсная система, где клетки инкубировали в течение краткого периода с BrdU для выявления клеток в S фазе. Мы нашли 45 мин пульс в оптимальной в нашей системе, но более короткие периоды времени могут быть использованы, если получается достаточно маркировки. Продолжая культуре клеток после удаления BrdU можно отслеживать их развитие в течение всей остальной S фазе, G 2 митоза, G 1 и вступления в следующем цикле клеток. Это может быть возможным, чтобы следовать клетки дальше. Преимущество этой системы в том, что нет никаких доказательств токсичности для клеток в сроки этих экспериментов и есть минимальным ущербом для роста клеток, а только пару изменений СМИ требуется. Клетки поддерживали в противном случае Continuous культура. Проточной цитометрии на основе природы метода означает, что он может быть объединен с идентификацией клеток субпопуляций по дополнительной поверхности или внутриклеточного окрашивания. Мы использовали APC сопряженный BrdU антитела, но и другие конъюгаты могут быть заменены на содействие развитию антител панелей. Мы использовали 7-AAD, а не из-за пропидийиодидом 7-ААР флуоресцирует в одном канале максимизации варианты окрашивания многоцветной. Аналогично DAPI или Hoechst могут быть использованы в качестве красителей ДНК, но требуют УФ лазер. Более жесткие резюме для окрашивания ДНК может быть получена с использованием этанола фиксацию, но это часто ухудшает окрашивание антител, ограничивая возможность дополнительной поверхностью или цитоплазматических пятен. Самый большой недостаток в том, что S фаза длится около 8 ч, так меченые клетки, возможно, только что ввели, или о выходе из S фазу в период импульса. В результате синхронизации не так плотно, как с некоторыми другими системами. Тем не менее, путем объединения BrdU маркировки с красителями, указывающих ДНКСодержание и антитела к специфическим клеточного цикла зависимых белков, сильные данные могут быть получены.
Для того чтобы получить данные последовательного важно гарантировать, что клетки находятся в правильной концентрации и концентрации клеток остается постоянным во все условия сравниваемых. Критически яркость окрашивания 7-АСР очень чувствительны к концентрации клеток. Использование автоматизированной системы подсчета клеток может помочь гарантировать, что концентрация клеток согласуются во всех образцах при каждом шаге в процессе. Другим важным моментом является длина времени клетки подвергаются BrdU. Небольшие вариации могут перевести на значительные различия, поэтому важно, что все образцы инкубируют с BrdU по той же самой времени. Наконец, важно, чтобы титровать антител для получения оптимального окрашивания и это следует повторить каждый раз, когда партия изменилась. Если все шаги выполнены последовательно и концентрации клеток остается постоянным, то это метоd надежно позволяют отслеживать клеток через клеточный цикл без необходимости синхронизации. Существует также значительные возможности, чтобы изменить этот метод, чтобы удовлетворить особые типы клеток и решения конкретных вопросов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC BrdU Flow Kit | BD Biosciences | 552598 | Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer) |
| BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus | BD Biosciences | 561651 | Referred to as Permeabilization buffer |
| BD Perm/Wash Buffer | BD Biosciences | 554723 | Referred to as Wash buffer |
| DNase | Sigma | D-4513 | |
| BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| BD Pharmingen Stain Buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| BD LSR FORTESSA flow cytometer | BD Biosciences | FORTESSA | |
| Pipetman | Gilson | P2, P20, P100, P1000 | |
| RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml | Lonza | 12-167F | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| Fetal Bovine Serum | FisherBiotec | FBS-7100113 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002-1G | |
| Falcon TC 150 cm2 vented Flasks | BD Biosciences | 355001 | |
| Pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Aersol Pipettes 200 µl | Interpath | 24700 | |
| Aersol Pipettes 1 ml | Interpath | 24800 | |
| Centrifuge | Spintron | GT-175R | |
| CO2 incubator | Binder | C 150 | |
| AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody | Cell Signalling | 9708S | |
| Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2197S | |
| Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb | Cell Signalling | 2348S | |
| NALM6 | DSMZ | ACC-128 |
References
- Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Harper, J. W., Elledge, S. J. The DNA damage response: ten years after. Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).
- Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218, 474-475 (1982).
- Carayon, P., Bord, A. Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA. Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).
- Gonchoroff, N. J., et al. S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment. Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).
- Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells. Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).
- Hendzel, M. J., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106, 348-360 (1997).
- Draetta, G., Beach, D. Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement. Cell. 54, 17-26 (1988).
- Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. , (2012).
- Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester. Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).
- Beck, H. P. Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine. Cytometry. 2, 170-174 (1981).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells. Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).
- Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67. Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).
- Danova, M., et al. Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors. Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).
- Juan, G., et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry. 32, 71-77 (1998).
- Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).
- Kues, W. A., et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).
- Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization. Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).
