Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización

doi: 10.3791/52840 Published: August 16, 2015

Summary

Este protocolo describe el uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir la absorción de la seguimiento temporal de las células que estaban en fase S en un punto específico en el tiempo. La adición de colorantes de ADN y el etiquetado de anticuerpos facilita el análisis detallado del destino de las células en fase S en épocas posteriores.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La evaluación de las características del ciclo celular y los cambios que se producen en las células durante la progresión del ciclo celular es fundamental para la comprensión de muchos aspectos de la biología, en particular la biología del cáncer. Muchos agentes en desarrollo para el tratamiento de tumores malignos tienen efectos profundos sobre la progresión del ciclo celular o inducir la muerte celular a través del ciclo celular dependiente de mecanismos. Con el fin de estudiar la dinámica del ciclo celular o células en una fase particular del ciclo celular, es habitual para sincronizar las células. Sin embargo métodos de sincronización pueden tener efectos perjudiciales sobre las células que se estudian, potencialmente confundiendo a los resultados obtenidos. 1 análisis Recientemente, el uso de proteínas etiquetadas con fluorescencia que sólo están presentes en fases particulares del ciclo de las células han permitido de la progresión del ciclo celular en las células individuales a través del tiempo 2, sin embargo las células a ser estudiadas necesidad de ser manipulados genéticamente para expresar estas proteínas etiquetadas, lo que limita su uso a sistemas en los que esto puede ser leidoslia logrado.

El ciclo celular consiste de dos fases activas: la fase de síntesis (S), donde se replica el ADN y la mitosis (M), donde la división celular tiene lugar. Estas fases están separadas por tres fases gap, G 0, G 1 y G 2. G 0 o quiescencia, es una fase de reposo donde la célula ha dejado el ciclo, G 1 es donde las células aumentan de tamaño antes de la replicación del ADN y G 2, donde el crecimiento celular continúa entre la terminación de la replicación del ADN pero antes de la división celular. La progresión a través del ciclo celular está controlada por un número de puntos de control. El G 1 puesto de control se activa cuando las condiciones ambientales no son de apoyo de la síntesis de ADN e impide la entrada en fase S. El puesto de control de fase intra-S o el retraso pueden ser provocados por daños en el ADN que puede resultar en las horquillas de replicación estancado. Durante G 2 la fidelidad de la ADN replicado se confirma y si se detecta daño, entonces el G 2 3 La activación de estos puntos de control se utiliza comúnmente para sincronizar las poblaciones de células. Los puntos de control del ciclo celular pueden ser activados por un número de factores, pero en la biología del cáncer el más común es la detección de daños en el ADN. La respuesta al daño del ADN se inicia por la PI3-quinasa quinasas ataxia y telangiectasia Rad3 relacionados (ATR) y ataxia telangiectasia mutada (ATM) que activan las quinasas efectoras aguas abajo Chk1 y Chk2, respectivamente. 3 Una serie de eventos se activa Chk1 incluyendo estancado horquillas de replicación, entrecruzamientos de ADN, y el daño por radiación ultravioleta, mientras que Chk2 se activa principalmente por roturas de doble hebra.

El método usual para estudiar el efecto de las condiciones alteradas de la longitud de la i ciclo celulars para sincronizar las células en una fase particular del ciclo celular. 1 Esto puede lograrse a través de varios métodos. Las células pueden separarse, físicamente basan en el tamaño, densidad, dispersión lateral (granularidad), y marcadores de expresión de la superficie celular. Más prácticamente, las células pueden ser sincronizados por medios químicos. Varios agentes tales como la timidina, la hidroxiurea y arabinósido de citosina se pueden utilizar para inhibir la síntesis de ADN en la fase S del ciclo celular que resulta en una acumulación de células en fase S que siguen ciclismo después se eliminan los agentes. Las células tratadas con nocodazol, que previene la formación del huso mitótico, arresto con un G 2 - o M-fase el contenido de ADN. Eliminación de suero a partir de los resultados de medio de cultivo en la acumulación de células en G 0 fase. El re-adición de los nutrientes dentro de las séricos cultura re-inicia el ciclo normal de las células. Sin embargo, todos estos métodos de sincronización interfieren con el ciclo normal y crecimiento de las células y puede Result en la muerte celular significativa.

Sincronización de las células de la leucemia linfoblástica aguda es particularmente difícil y estas células no son susceptibles a la manipulación genética. El método aquí descrito permite la evaluación de la dinámica del ciclo celular y el estudio de células en fases particulares del ciclo celular sin sincronización tradicional o modificación genética. Este método también puede ser útil para otros tipos de células que no se consigue fácilmente la modificación genética y los procedimientos de sincronización tradicionales. El método se basa en el uso a largo establecido de bromodesoxiuridina (BrdU) incorporación, que tiene muy poco impacto en el crecimiento a corto plazo y la proliferación de las células. 4 protocolos establecidos BrdU toman ventaja de la incorporación de BrdU en el ADN recién sintetizado durante la fase S . Esto marca permanentemente las células como haber estado en la fase S durante la exposición BrdU. Esta población puede ser identificado en los puntos de tiempo posteriores por tinción para incor BrdUación y por lo tanto actúan como una población sincronizada que puede ser seguido y evaluado con el tiempo lo permite el estudio de los efectos del fármaco sobre el tránsito del ciclo celular. BrdU necesita ser expuesta antes de la tinción de anticuerpos, por lo general realizados a raíz de DNasa o tratamiento ácido 6,7. El uso de la citometría de flujo para detectar BrdU incorporado permite la inclusión de marcadores adicionales. El más importante es el uso de tintes para medir el contenido de ADN, lo que permite la evaluación de la distribución de fase del ciclo celular de las células que estaban en fase S en el inicio del estudio. 8 de superficie o intracelulares antígenos Además adicionales también pueden ser estudiados. 9 Estos pueden estar relacionados con los eventos del ciclo celular, como Ki67 o funciones celulares para aparentemente no relacionados, tales como marcadores de apoptosis como exfoliados caspasa-3. Las posibles aplicaciones están limitadas por la imaginación del investigador.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

El protocolo descrito aquí utiliza la línea celular de leucemia linfoblástica aguda NALM6 pero se puede aplicar a otros tipos de células.

1. Soluciones y Reactivos

  1. RPMI completo
    1. Añadir 56 ml de suero de ternera fetal (FCS) y 5,5 ml de 200 mM de L-glutamina a una botella de 500 ml de medio RPMI-1640.
  2. BrdU de la Solución
    1. Preparar 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) en fosfato de Dulbecco Buffered Saline (DPBS).
  3. BrdU completo RPMI
    1. Añadir 6,2 l de solución madre de BrdU a 10 ml de RPMI completo.
  4. Solución DNasa
    1. Preparar 1 mg de DNasa / ml en DPBS.
  5. La tinción Buffer
    1. Preparar 3% de FCS inactivado por calor y 0,09% de azida de sodio en DPBS.
  6. Consulte la Lista de materiales para las definiciones de Fijación Buffer, permeabilización Buffer y el tampón de lavado.

2. Las células

NoTe: Las células no fueron cultivadas por más de 6 meses. Este método es directamente adaptable a cualquier línea celular no adherente con ajustes a la densidad de células y medios de cultivo. Utilice células que están creciendo exponencialmente a la iniciación del experimento.

  1. Mantener células NALM6 en frascos de cultivo T-75 en RPMI completo. Realice todos los pasos en condiciones estériles utilizando una Clase II Bioseguridad gabinete.
    1. Mantener células NALM6 entre 2.1 x 10 6 células por ml mediante el fraccionamiento de la cultura tres veces por semana.
    2. Se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2 en el aire.

3. Pulso Etiquetado de células con BrdU

PRECAUCIÓN: Manipule BrdU con cuidado, ya que es un mutágeno potencial y teratógeno.

  1. Centrifugar las células a 150 xg durante 5 min. Nota: La transferencia de células en medio fresco mejora la reproducibilidad de los resultados.
  2. Realizar un recuento de células y las células volver a suspender en RPMI completo a 2 x 10 6 canas / ml.
  3. Diluir las células en 1 2 con BrdU RPMI completo produciendo una concentración final de células de 1 x 10 6 células / ml.
  4. Incubar a 37 ° C con 5% de CO2 durante 45 min, luego se diluye células 1 en 10 con RPMI completo. Centrifugar las células a 150 xg durante 5 min y cuidadosamente descartan todo el sobrenadante.
  5. Resuspender las células en un volumen pequeño (~ 100 l) de RPMI completo, realizar un recuento de células y se ajustan a 1 x 10 6 células / ml.
  6. Pipetear 1 ml de las células en los pocillos de una placa de 48 pocillos. Pipeta 1 ml de DPBS en cualquier pozo desocupadas para obtener resultados más reproducibles.
  7. Incubar a 37 ° C en 5% de CO2 en aire para puntos de tiempo deseados, aquí 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24 h. Nota: La cantidad de tiempo dependerá de lo que tiene como objetivo el diseño experimental para medir.
  8. Transferencia de todas las células en tubos de FACS utilizando una pipeta. Enjuague la secuencialmente bien con 1 ml volumes de PBS a un volumen total final de 5 ml.
  9. Centrifugar a 150 xg durante 5 minutos y retirar con cuidado todo el sobrenadante. Las células están listas para la tinción, realizan esta (sección 4) inmediatamente.

4. La tinción celular

Nota: Si se requiere tinción de la superficie de las células que realizar antes de la fijación, asegurando que las células se mantienen a 4 ° C durante todo.

  1. Resuspender las células en 100 l de tampón de tinción (para la tinción de superficie opcional, añadir el volumen recomendado de anticuerpo a la superficie antígenos y se incuba durante 30 min a 4 ° C).
  2. Añadir 1 ml de tampón de tinción, de centrifugación durante 5 min a 150 xg y descartar el sobrenadante.
    Nota: El anticuerpo específico, concentración, tiempo de incubación etc. variará dependiendo de las metas experimentales específicas.
  3. Fijación y permeabilización
    1. Resuspender las células en 100 l de tampón de fijación y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente.
    2. Añadir 1 ml otampón de lavado f, centrifugar durante 5 min a 150 xg y desechar el sobrenadante.
    3. Resuspender las células en 100 l de tampón de permeabilización e incubar las células durante 10 min en hielo.
    4. Añadir 1 ml de tampón de lavado, de centrifugación durante 5 min a 150 xg, y descartar el sobrenadante.
    5. Resuspender las células en 100 l de tampón de fijación por tubo y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.
    6. Añadir 1 ml de tampón de lavado, de centrifugación durante 5 min a 150 xg, y descartar el sobrenadante.
      Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí, si es necesario. Las células fijadas son estables durante varios días a 4 ° C si se resuspendieron en tampón de tinción. Retire el tampón de tinción después de la centrifugación antes de continuar.
  4. DNasa tratamiento
    1. Resuspender las células en 100 l de solución de DNasa (30 g de DNasa / 10 6 células) y se incuban las células durante 1 hora a 37 ° C.
    2. Añadir 1 ml de tampón de lavado, centrifugar a 150 xg durante 5 min y desechar el sobrenadante.
    3. Antibody tinción
      Nota: La tinción para marcadores intracelulares distintos de BrdU se puede realizar simultáneamente con la tinción de BrdU.
      1. IMPORTANTE: Preparar los controles de compensación que constan de células no teñidas y células marcadas con cada solo fluorocromo. Lo ideal es utilizar los mismos anticuerpos para los controles de compensación como los utilizados en los tubos experimentales. Sin embargo, si esto no es factible, los anticuerpos a los antígenos sustitutos altamente expresados ​​conjugarse con el mismo fluorocromo.
      2. Resuspender las células en 50 l de tampón de lavado y añadir 1 l / 10 6 células de anticuerpo BrdU. Nota: anticuerpos conjugado directamente a otros antígenos intracelulares específicas también se pueden añadir.
        NOTA:. Los anticuerpos frente a la histona H3 fosforilada en Ser10 se pueden utilizar para discriminar entre células en G2 y M, la histona H3 es fosforilada en Ser10 durante la mitosis 10 Los anticuerpos frente a cdc2 fosforilados en Tyr15 puede ser utilizado para detectar las células que have comprometida con la mitosis. 11
      3. Se incuban las células durante 20 min a temperatura ambiente.
      4. Añadir 1 ml de tampón de lavado, las células de centrifugación a 150 xg durante 5 min y desechar el sobrenadante.
    1. ADN de manchas de Análisis de Ciclo Celular
      1. Aflojar pellet y añadir 20 l de la solución de 7-AAD (0,25 g). Nota: Es importante utilizar una cantidad constante de 7-AAD / célula.
      2. Resuspender las células en 1 ml de tampón de tinción.

    5. Recogida de Citometría de Flujo de Datos

    Nota: La máquina requerida dependerá del número y naturaleza de los fluorocromos usados.

    1. Recoge los siguientes parámetros: FSC-A, SSC-A, FSC-H (FSC-W se pueden utilizar en lugar de FSC-H) y 7-AAD fluorescencia en una escala lineal. Recoger el canal de APC en una escala logarítmica. Recoge los canales adicionales que se requieren para la evaluación de la superficie o internos etiquetas utilizando una escala logarítmica.
    2. Realizar comcompensación de las señales en los espectros de emisión observada entre diferentes fluorocromos antes de analizar las muestras superpuestas. Nota: La mayoría de citómetros de flujo realizarán automáticamente.
    3. Recoge al menos 10.000 eventos en cada muestra.

    6. Análisis de Citometría de Flujo de Datos

    Nota: FlowJo se utilizó en este estudio para el análisis de citometría de flujo de datos, pero otros paquetes de software también pueden ser utilizados. La estrategia gating se ilustra en la Figura 1.

    1. Identificar la población de células viables utilizando parámetros FSC-A y SSC-A.
    2. Dentro de esta población excluir dobletes y agregados utilizando FSC-A y FSC-H (FSC-W también puede ser utilizado aquí).
    3. Dentro de esta población establecer un gráfico de puntos usando 7-AAD en el eje x y BrdU-APC en el eje y.

    Figura 1
    Figura 1: Estrategia de apertura de puerta izquierda pa.nel: células ungated se muestran en una FCS-A vs SSC-Un gráfico de puntos. La población de células viable se identifica por la puerta se muestra. Panel central: células cerradas desde el panel de la izquierda se muestran en una FSC-A vs FSC-H gráfico de puntos (FSC-W se puede utilizar en lugar de la altura). Dobletes y agregados se identifican y excluidos por la puerta se muestra. Panel derecho: células cerradas a partir de la fecha de exclusión doblete en el panel central se muestran en un 7-AAD vs. APC-Un gráfico de puntos. El anticuerpo BrdU se etiqueta con APC que permite la identificación de las células que han incorporado BrdU durante el etiquetado pulso. 7-AAD proporciona información sobre el contenido de ADN. La puerta superior define células positivas para BrdU y por lo tanto en la fase S en el momento del impulso de BrdU, la puerta inferior izquierda, las células en G 0/1 y la puerta inferior derecha los de G 2 / M. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

    1. Ciclo Celular A nálisis
      1. Abra la primera archivo de datos y la puerta a las células en la puerta de exclusión doblete.
      2. Analizar esta población para la distribución del ciclo celular (que se encuentra bajo plataformas de software FloJo) y utilizar el modelo de Dean-Jett-Fox.
      3. Obtener las posiciones del G 0/1 y G 2 / M picos utilizando crear puertas.
      4. Puerta en la BrdU células positivas y sujetos a esta población con el mismo análisis del ciclo celular.
      5. Proporcionar las posiciones para el G 0/1 y G 2 / M picos mediante la aplicación de las mismas puertas de crear puertas y el establecimiento de restricciones (utilizando las puertas creadas) para las posiciones del G 0/1 y G 2 / M picos. Esto se ilustra en los primeros 2 paneles de la Figura 2.
        Nota: Otro software también se puede utilizar para analizar los datos y las instrucciones podría variar en consecuencia.

    840 / 52840fig2highres.jpg "width =" 700 "/>
    Figura 2:. Progresión El primer panel de Ciclo Celular (Todas las células) es cerrada en la población de células definida por la puerta de la exclusión doblete. Esta población se muestra en el histograma con 7-AAD en el eje X. El pico de la 0/1 pico G está indicado por la flecha por debajo del eje. En los paneles posteriores células BrdU positivas han sido cerrada en como se muestra en la Figura 1. Se aplica el valor para la posición G 0/1 obtenida cuando gating de la puerta de exclusión doblete a las células BrdU positivas cerradas dentro de software FlowJo ciclo celular. Cada panel posterior fue cerrada en la población BrdU positivo como se muestra en la Figura 1 y la posición del pico G 0/1 basado en el valor obtenido en el análisis de toda la población como se muestra en los dos primeros paneles. Uso de la fracción negativa BrdU para identificar la ubicación de la población G 0/1 para las células BrdU positivas en la misma sample controla de ningún ligeras diferencias en la intensidad de la mancha de ADN entre muestras. El número que aparece en cada panel representa el tiempo desde que terminó el pulso de BrdU. Las fases del ciclo celular calculados se muestran en verde sombra. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Esta metodología se puede utilizar para obtener una gama de información. Algunas aplicaciones se describen aquí.

Evaluación de la duración del ciclo celular

Para determinar el tiempo requerido para que las células tránsito a través del ciclo celular, las células se cosecharon a diversos puntos de tiempo tras el pulso de BrdU. Los intervalos entre las evaluaciones pueden ser adaptadas a las células particulares que se analiza. Líneas celulares hematopoyéticas se evaluaron cada hora durante un período de 24 horas en ausencia de cualquier tratamiento farmacológico para determinar la longitud de fases del ciclo celular bajo condiciones de cultivo estándar. La Figura 2 muestra una selección de análisis instantánea de células NALM6 durante un período de 24 hr. Las células en fase S en el momento del impulso de BrdU (es decir, dentro de la puerta segura de BrdU en la Figura 1) progresado a través de G 2 / M, con un pico de células en que fase del ciclo celular de ser detectado 10 hr después de la BrdU pUlse. La proporción de células BrdU etiquetados en fase S alcanzó su nadir 14 hr después del pulso y casi todas las células había regresado a G 1 después de 17 hr. Por 24 horas una proporción de las células BrdU marcado había vuelto a entrar en la fase S, como parte de su próximo ciclo celular que indica que las células pueden completar un ciclo celular dentro de las 24 horas, sin embargo la mayoría aún no había entrado en una segunda ronda de replicación, en consonancia con el conocido 36 hr tiempo de duplicación de estas células.

Distribución del ciclo celular puede ser refinado adicionalmente por la inclusión de marcadores adicionales. Por ejemplo, la adición de un anticuerpo para la histona H3 fosforilada en Ser10 (un marcador de células en mitosis) permite la discriminación de las células en mitosis de las de G 2 (paneles de la Figura 3 a la izquierda).

Figura 3
Figura 3: Confirmaciónde fase del ciclo celular El uso de marcadores adicionales. Los paneles superiores muestran el análisis del ciclo celular de las células de la puerta BrdU positivo como se muestra en la Figura 1. Las células habían sido incubadas en presencia o ausencia de 3 nM vincristina durante 18 horas después del pulso de BrdU . Se realizó el análisis del ciclo celular, como se describe en la figura 2. Los paneles inferiores muestran las mismas células en 7-AAD vs. histona H3 fosforilados en Ser10 gráfico de puntos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Evaluación de los efectos de la droga sobre el Ciclo Celular

Los agentes citotóxicos pueden tener profundos efectos en el progreso del ciclo celular y pueden inducir la muerte celular. El efecto de los fármacos sobre la progresión del ciclo celular puede evaluarse mediante la adición de los fármacos de interés siguiendo el pulso de BrdU. Se muestran dos ejemplos. La primera fue una situación en la inducción omuerte celular f confundió el análisis de los datos del ciclo celular (paneles de la derecha de la figura 3). NALM6 células habían sido expuestos a 3 nM vincristina durante 18 horas después del pulso de BrdU. Se esperaba que las células para detener en la mitosis como objetivos vincristina microtúbulos. Sin embargo, el análisis del ciclo celular sugiere que las células no habían arrestado pero transitado por a G 0/1 (Figura 3 panel superior derecho). La adición de un anticuerpo para la histona H3 fosforilada en Ser10 mostró que las células no habían salido de la mitosis (Figura 3 panel inferior derecho), a pesar de tener un contenido de ADN reducida. Es probable que el contenido de ADN se redujo debido a que las células fueron sometidas a la apoptosis y habían comenzado a degradar su ADN. Dado que las células inician la apoptosis, mientras que en la mitosis (es decir, con ADN 4N), aparecen como fase S o G 0/1 células en lugar de el pico típico de apoptosis sub-G 1.

Figura 4
Figura 4:. La detección de fase del ciclo celular destrucción específica Los gráficos de puntos muestran el porcentaje de células positivas BrdU restantes en el cultivo 24 hr después del pulso de BrdU. Las células habían sido cultivadas en presencia o ausencia de vehículo solo (control), 1,5 o 16 mM RAD001 desde el final del pulso de BrdU. El panel inferior muestra el porcentaje de células que eran BrdU positivas sobre la incubación de 24 horas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En otro ejemplo, la Figura 4 muestra cómo en presencia de una baja concentración de células RAD001 (un inhibidor de mTOR) fueron capaces de completar el ciclo celular pero luego se sometió a una demora o detención en G 0/1. Una mayor concentración de RAD001 células de tra impedido en gran partensiting a través de G 0/1. Es importante destacar que las células en la fase S (es decir BrdU positivas), se mostró a desaparecer preferentemente de la cultura cuando se añadió RAD001. Esto sugiere que las células pasan a través de G 2 / M fueron más susceptibles a la muerte celular por este agente. 12

También es posible examinar las respuestas de células en fases particulares del ciclo celular utilizando anticuerpos a los antígenos específicos. En la Figura 5 la activación del punto de control del ciclo celular controlando las proteínas Chk1 y Chk2 en respuesta al tratamiento vincristina se muestra. Chk1 y Chk2 se activan por fosforilación en Ser345 y Thr68 respectivamente. La activación de Chk1 y Chk2 se puede ver en las células que parecen tener un contenido de ADN 2N pero como se muestra en la Figura 5 es probable que sean células en mitosis que han iniciado la degradación del ADN como resultado de la apoptosis.

Es posible añadir fármacos en diversos puntos temporales después de laPulso de BrdU para examinar el efecto del agente sobre las células en las diversas etapas del ciclo celular.

Figura 5
Figura 5:. La detección de cambios en las células en determinadas fases del Ciclo Celular El panel superior muestra células cerradas sobre las células BrdU positivas como en la Figura 1 en 7-AAD vs. Chk1 fosforilada (izquierda) o Chk2 (derecha) gráficos de puntos. Las células habían sido cultivo durante 18 hr después de la pulso BrdU en presencia o ausencia de 3 nM vincristina como para la Figura 3. Los paneles inferiores muestran los histogramas de superposición de las mismas células cerradas ya sea en la fracción 2N o 4N como se indica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La capacidad de analizar el ciclo celular es importante para la comprensión de la biología del cáncer y el mecanismo de acción de ambos fármacos y genes que influyen en la proliferación celular y el crecimiento. Mientras que hay una multitud de ensayos que miden la proliferación de células según se informa, la mayoría sólo proporciona una medida que indica las células número presente. Estos incluyen ensayos que miden el número de células por visualización directa y el recuento, la actividad metabólica o la concentración de ATP. La ventaja principal de muchos de estos métodos es que son relativamente fáciles de realizar y susceptibles de formatos de microplacas y la automatización, haciéndolos útiles para el cribado de un gran número de condiciones o compuestos. Un inconveniente de muchos de estos métodos es que la pérdida de células debido a la muerte no se toma en consideración, que puede conducir a una subestimación de la proliferación celular. También estos métodos miden la población mayor y no permiten el estudio de células individuales o el tránsito de células a través deel ciclo celular.

De los ensayos de proliferación de uso común, tal vez el más fiables y precisos son los que miden la síntesis de ADN. Ensayos tradicionales de proliferación celular Se incuban las células durante un par de horas a toda la noche con 3 H-timidina, que se incorpora en el ADN recién sintetizado. 13 El problema obvio con este método es el uso de materiales radiactivos, pero Otra limitación es que las medidas de resultado el promedio proliferación de una población de células. BrdU se puede utilizar de manera similar sin los problemas de radiación, aunque se requieren pasos adicionales y BrdU es un mutágeno potencial. Sin embargo, BrdU tiene la ventaja de ser compatible con la citometría de flujo, permitiendo el análisis de células individuales. 14 Otros métodos de citometría de flujo compatibles para evaluar la proliferación celular en el nivel de células individuales incluir un número cada vez mayor de colorantes que etiquetan la membrana celular o proteínas celulares ( por ejemplo CFSE) que dividen entre daughtcélulas er, tintes de intercalación de ADN y del ciclo celular antígeno específico de detección de anticuerpos. El mejor de los tintes de etiquetado de células permiten el seguimiento de la división celular durante un número de divisiones celulares. 15 Ellos proporcionan una medida directa de la proliferación, aunque no se obtiene información sobre el escenario o distribución del ciclo celular. La medición del contenido de ADN usando los tintes de intercalación de ADN, tales como yoduro de propidio o 7-AAD proporcionar un fuerte distribución del ciclo celular 16, pero no temporal, los datos. Incluso con la evaluación de múltiples puntos de tiempo sigue siendo imposible para evaluar la longitud del ciclo celular o fases específicas del ciclo celular. Antígenos específicos del ciclo celular pueden utilizarse para evaluar la fase del ciclo celular en una población de células no sincronizadas. Antígenos específicos del ciclo celular usados ​​comúnmente incluyen Ki-67, 17 que se expresa durante las S, G 2 y M fases del ciclo celular, pero no durante 0/1 G, PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes) 18, y la fosforilación de h. iStone H3 19 Mientras que éstos proporcionan buenos datos relativos a la fase del ciclo celular, informaciones relativas dinámica del ciclo celular que falta.

La obtención de datos sobre la dinámica del ciclo celular que tradicionalmente ha sido examinado por la sincronización de las células utilizando agentes o condiciones de cultivo que bloquean la progresión del ciclo celular. Esto provoca una acumulación de células detrás del bloque, que una vez retirado, resultar en ola de células que progresan juntos a través del ciclo celular. 1 El cálculo de la duración del ciclo celular y la longitud de las diversas fases del ciclo celular es entonces posible. Las células pueden ser inducidas a salir el ciclo celular activo entrar en G 0 por privación de suero. Tras la re-adición de suero de las células pueden entonces se mueven juntos en fases posteriores. 20 Si bien este es un método fiable para ciertos tipos de células, otros, incluyendo muchos tipos de células transformadas, fallar para salir del ciclo celular y la muerte celular se someten con frecuencia como una resultado. 21 De hecho nuestra Stumuere encontrado que esto es la situación de las células de la leucemia linfoblástica aguda. Además, las células serán a menudo no volver a entrar en el ciclo celular de una manera suficientemente sincronizada. Los métodos químicos se pueden utilizar para inducir la detención del ciclo celular en las fases específicas del ciclo celular. Por ejemplo, los agentes que impiden la síntesis de ADN (por ejemplo, el exceso de timidina) o previenen la formación del huso mitótico (por ejemplo, nocodazol) células de detención en las fases S y M respectivamente, pero son tóxicos y pueden dar lugar a trastornos del crecimiento e incluso la muerte en una proporción significativa de la . 22 células en todas las células de estos métodos no lograron detener a la mayoría de las células sin matar a una fracción significativa. Considerando que el objetivo fue evaluar los efectos de un agente anti-leucémica potencial sobre los parámetros del ciclo celular, la muerte celular resultante de la sincronización era inaceptable. A pesar de la descripción de un gran número de métodos para sincronizar las células, todos tienen deficiencias. Los principales problemas son: un insuficienteenriquecimiento para las células en la parte deseada del ciclo celular, alteraciones a la fisiología normal del ciclo celular o, como se observa, el exceso de toxicidad.

El método descrito aquí es una simple extensión del sistema de pulso utilizado durante mucho tiempo, donde las células se incuban durante un breve período con BrdU para identificar las células en fase S. Encontramos un pulso de 45 min a ser óptima en nuestro sistema pero los períodos de tiempo más cortos pueden ser utilizados si se obtiene etiquetado suficiente. Al continuar células de cultivo después de la eliminación de la BrdU es posible realizar un seguimiento de su progresión a través del resto de la fase S, G 2, mitosis, G 1 y la entrada en el siguiente ciclo celular. Puede ser posible seguir las células más. La ventaja de este sistema es que no hay evidencia de toxicidad para las células en el marco de tiempo de estos experimentos y hay una interrupción mínima para el crecimiento de las células, como se requiere sólo un par de cambios de medios de comunicación. Las células se mantienen lo contrario en conticultura nuo. La citometría de flujo basado en la naturaleza del método significa que se puede combinar con la identificación de las subpoblaciones de células por la superficie adicional o tinción intracelular. Utilizamos APC anticuerpos BrdU conjugado pero otros conjugados pueden ser sustituidos para facilitar el desarrollo de paneles de anticuerpos. Utilizamos 7-AAD en lugar de yoduro de propidio porque 7-AAD fluorescente en un solo canal de maximizar las opciones de tinción multicolor. Del mismo modo DAPI o Hoechst se pueden utilizar como manchas de ADN, sino que requieren un láser UV. CV más estrictas para la tinción de ADN se pueden obtener usando la fijación etanol pero esto compromete frecuentemente tinción de anticuerpos, lo que limita las opciones de superficie adicional o manchas citoplasmáticos. La mayor desventaja es que S fase dura aproximadamente 8 horas, por lo que las células marcadas pueden haber acaba de ingresar oa punto de salir de la fase S durante el período de pulso. Como resultado, la sincronización no es tan apretado como con algunos otros sistemas. Sin embargo, mediante la combinación de la BrdU etiquetado con colorantes que indican DNAcontenido y anticuerpos a las proteínas dependientes específicas del ciclo celular, los datos se pueden obtener fuertes.

Con el fin de obtener datos coherentes, es importante asegurar que las células están en la concentración correcta y que la concentración celular es consistente a través de todas las condiciones que se comparan. Críticamente el brillo de la tinción 7-AAD es muy sensible a la concentración de células. El uso de un sistema de conteo de células automatizado puede ayudar a garantizar que las concentraciones celulares son consistentes en todas las muestras en cada paso en el proceso. Otro punto importante es la longitud de tiempo que las células se exponen a BrdU. Pequeñas variaciones pueden traducen en diferencias considerables, por lo que es importante que todas las muestras se incuban con BrdU precisamente al mismo tiempo. Por último, es importante para titular anticuerpos para obtener la tinción óptima y esto se debe repetir cada vez que se cambia un lote. Si todos los pasos se siguen de manera consistente y concentraciones de células mantienen constantes, entonces este method permitirá fiable el seguimiento de las células a través del ciclo celular sin la necesidad de sincronización. También hay un amplio margen para modificar este método para adaptarse a tipos celulares particulares y abordar cuestiones específicas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC BrdU Flow Kit BD Biosciences 552598 Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm
Buffer (referred to as Fixation Buffer)
BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus BD Biosciences 561651 Referred to as Permeabilization buffer
BD Perm/Wash Buffer BD Biosciences 554723 Referred to as Wash buffer
DNase Sigma D-4513
BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes BD Biosciences 352008
BD Pharmingen Stain Buffer BD Biosciences 554656
BD LSR FORTESSA flow cytometer BD Biosciences FORTESSA
Pipetman Gilson P2, P20, P100, P1000
RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml Lonza 12-167F
DPBS Lonza 17-512F
Fetal Bovine Serum FisherBiotec FBS-7100113
L-Glutamine Sigma G7513-100ML
5-Bromo-2′-deoxyuridine Sigma B5002-1G
Falcon TC 150 cm2 vented Flasks BD Biosciences 355001
Pipettes 25 ml Greiner 760180
Aersol Pipettes 200 µl Interpath 24700
Aersol Pipettes 1 ml Interpath 24800
Centrifuge Spintron GT-175R
CO2 incubator Binder C 150
AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody Cell Signalling 9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb Cell Signalling 2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb Cell Signalling 2348S
NALM6  DSMZ ACC-128

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
  2. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  3. Harper, J. W., Elledge, S. J. The DNA damage response: ten years after. Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).
  4. Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).
  5. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218, 474-475 (1982).
  6. Carayon, P., Bord, A. Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA. Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).
  7. Gonchoroff, N. J., et al. S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment. Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).
  8. Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells. Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).
  9. Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).
  10. Hendzel, M. J., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106, 348-360 (1997).
  11. Draetta, G., Beach, D. Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement. Cell. 54, 17-26 (1988).
  12. Saunders, P. O., et al. RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine. Oncogene. (2012).
  13. Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester. Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).
  14. Beck, H. P. Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine. Cytometry. 2, 170-174 (1981).
  15. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  16. Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells. Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).
  17. Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67. Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).
  18. Danova, M., et al. Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors. Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).
  19. Juan, G., et al. Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis. Cytometry. 32, 71-77 (1998).
  20. Langan, T. J., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).
  21. Kues, W. A., et al. Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).
  22. Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization. Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).
Seguimiento temporal de la progresión del ciclo celular El uso de citometría de flujo sin la necesidad de sincronización
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Welschinger, R., Bendall, L. J. Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization. J. Vis. Exp. (102), e52840, doi:10.3791/52840 (2015).More

Welschinger, R., Bendall, L. J. Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization. J. Vis. Exp. (102), e52840, doi:10.3791/52840 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter