Protocol
1. الاستنساخ المؤتلف البلازميدات ترميز لaECM البروتينات
- تصميم تسلسل الأحماض الأمينية في المجال الوظيفي (على سبيل المثال، مجال ملزم الخلية ويكرر مثل الإيلاستين). تقييد مواقع تصميم المرافقة ينتهي من المجالات الوظيفية لتسهيل استخدام البرمجيات الحرة وفقا لتعليمات برمجيات الاستنساخ الفرعية (على سبيل المثال، http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). هنا، حدد تقييد مواقع فريدة غير موجودة في المجال الوظيفي لحصر الهضم إلى المواقع المقصودة. اختيار تقييد مواقع التي تظهر في موقع استنساخ متعددة (MCS) من ناقلات المضيف (على سبيل المثال، pET22b (+)) لاستنساخ الفرعي.
- عكس ترجمة تسلسل الأحماض الأمينية في تسلسل النوكليوتيدات باستخدام مواقع مجانية وفقا لتعليمات البرنامج. (على سبيل المثال، http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). هي الأمثل ضمان الكودونات لE. تستضيف القولونية.
- الجينات في المصالح يمكن أن يكون الشرائيةأليغنوكليوتيد] الذين تقطعت بهم السبل إد تجاريا واحدة كما (أي إذا كان أليغنوكليوتيد] <100 زوج قاعدي (بي بي)) وأداء الصلب الحمض النووي (راجع الخطوة 1.4) للحد من التكاليف. على خلاف ذلك، لجينات أكبر من 100 سنة مضت، يمكن شراؤها من خلال الشركات التجارية.
- الصلب DNA من أليغنوكليوتيد]
- يصلب oligomers DNA للحصول على تسلسل الجين المطلوب. حل [أليغنوكليوتيد DNA في منطقة عازلة قليل وحدات الحمض النووي (10 ملي تريس: 2-الأمينية-2- (hydroxymethyl) -propan-1،3-ديول، ودرجة الحموضة 8.0 وتصفيتها) إلى تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
- إضافة 4 ميكرولتر من كل قليل وحدات إلى 32 ميكرولتر من العازلة الصلب DNA (10 ملي تريس، 100 ملي كلوريد الصوديوم و 100 نانومتر MgCl 2) لتحقيق ما مجموعه 40 ميكرولتر خليط.
- غلي كوب من الماء باستخدام موقد وتزج الخليط لمدة 5 دقائق، 95 ° C. إزالة كوب ويبرد تدريجيا كامل أنشئت في مربع الستايروفوم O / N. تم مطوع وoligomers ونحن على استعداد لعملية الهضم.
ملاحظة: pET22b (+) ناقلات بلازميد هو الأمبيسلين المقاومة للمضادات الحيوية، ويحتوي على-6X صاحب العلامة في محطة سي. و6X-صاحب العلامة الموجودة في pET22b (+) يسمح لنا لاستخدام الموسومة صاحب الأجسام المضادة للتعرف على البروتين المستهدف عبر النشاف الغربي في الخطوة 7. - إضافة 6X صبغ التحميل لكل خليط الهضم. تشغيل مخاليط الهضم بما في ذلك بشكل منفصل سلم DNA على 1،2٪ الاغاروز المواد الهلامية التي تحتوي على الحمض النووي DNA وصمة عار للأشعة فوق البنفسجية الفلورسنت لمدة 1 ساعة على 100 V. تصور 1.2٪ DNA agarose هلام مع إضاءة ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
- شريحة هلام لاستخراج منتجات DNA هضم باستخدام أدوات تنقية جل التجاري. Elutالبريد باستخدام الحد الأدنى من حجم عمود لتحقيق تركيز الحمض النووي الحد الأدنى من 50-100 نانوغرام / ميكرولتر.
- الجمع بين هذا الجين من الاهتمام بالتسلسل ligating إدراج DNA هضمها (مثل الإيلاستين يكرر أو خلية ملزم المجالات التي حصلت عليها الصلب DNA) في ناقلات البلازميد باستخدام T4 يغاز استخدام الوصفة التالية: (2 ميكرولتر من ناقلات، 1 ميكرولتر من T4 يغاز، 1.5 ميكرولتر من T4 العازلة الربط، س ميكرولتر من إدراج، 10.5-X ميكرولتر الماء لمجموع مزيج 15 ميكرولتر). احتضان الخليط ربط في RT لمدة 2 ساعة.
ملاحظة: التركيز المولي ناقلات لادخال ينبغي تعديلها لتحسين كفاءة الربط. حجم إدراج صفها بأنها x في صفة يعتمد على تركيز الحمض النووي مزال من الخطوة 1.7. - ذوبان الجليد E. القولونية DH5α الخلايا المختصة كيميائيا (أو أي سلالة الاستنساخ) على الجليد. لوحات دافئ 2xYT أجار (الجدول 1) التي تحتوي على الأمبيسلين (25 ميكروغرام / مل) إلى 37 درجة مئوية.
- تحويل الخلايا باستخدامالحرارة صدمة:
- قسامة 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة في نظيفة، قبل المبردة أنابيب متناهية الصغر الطرد المركزي. ماصة 5 ميكرولتر (ما بين 100 إلى 100 خريج نانوغرام) من خليط ربط إلى الخلايا، pipetting بلطف صعودا وهبوطا لخلط. ترك الخليط على الجليد لمدة 20 دقيقة.
- تزج الأنبوب الصغير الطرد المركزي التي تحتوي على خليط الخلية في 42 ° C حمام الماء لمدة 2 دقيقة، وعاد إلى على الجليد لمدة 2 دقيقة. الزمنية مدة الغمر لتقليل الضرر الحرارة إلى الخلايا.
- إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الاعلام SOC (الجدول 1) في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز لمدة 1 ساعة.
- نشر 50 500 ميكرولتر من الخليط خلية / ربط على لوحة أجار 2xYT الذي تم قبل استعد لRT، التي تحتوي على الأمبيسلين (25 ميكروغرام / مل)، واحتضان لوحات رأسا على عقب عند 37 درجة CO / N (12-16 ساعة) .
- في اليوم التالي، واختيار المستعمرات DNA من لوحة أجار باستخدام نصائح ماصة نظيفة. تنمو المستعمرات في 5 مل من 2YT وسائل الإعلام (الجدول 1) التي تحتوي على الأمبيسلين (25 ميكروغرام / مل) O / N عند 37 درجة CO / N (12-16 ساعة) مع اهتزاز (225 دورة في الدقيقة).
- في اليوم التالي، واستخدام عدة البلازميد العزلة لاستخراج البلازميدات DNA لكل مستعمرة التقطت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل الحمض النووي مع 50 ميكرولتر من الماء.
- إجراء اختبار هضم مع الانزيمات تقييد استخدام الوصفة التالية: (DNA 5 ميكرولتر 0.2 ميكرولتر من كل انزيم التقييد، 1 ميكرولتر 10X تقييد العازلة انزيم وأعلى حتى الماء لمجموع مزيج 10 ميكرولتر)، واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية للكشف عن المستعمرات التي تحتوي على الأرجح إدراج وتعمل على 1،2٪ هلام الاغاروز DNA كما في الخطوة 1.6.
ملاحظة: عند الهضم، وربط الناجح يجب النتائج في شريطين، واحد لكل من النواقل وإدراج والتي تتوافق مع الوزن الجزيئي لكل منهما (الشكل 1). - إرسال المستعمرات المحتمل لتسلسل الحمض النووي باستخدام T7 المروج إلى الأمام والاشعال على التعاقب التجارية عكس.
معشوقة = "jove_title"> 2. التحول المؤتلف البلازميد إلى الجرثومي التعبير المضيف
- من النتيجة التسلسل، حدد مستعمرة الذي تم ligated بنجاح واستخدام البلازميد الحمض النووي للتحول إلى E. المضيف التعبير القولونية.
- ذوبان الجليد E. القولونية سلالة التعبير (BL21 (DE3) pLysS) على الجليد. وفي الوقت نفسه، لوحات أجار الحارة التي تحتوي على الأمبيسلين (25 ميكروغرام / مل)، والكلورامفينيكول (34 ميكروغرام / مل) إلى RT.
ملاحظة: البلازميد pLysS موجودة في البكتيريا سلالة BL21 (DE3) pLysS يحتوي على الجينات المقاومة الكلورامفينيكول. يحتوي البلازميد pLysS على كاظمة الجينات T7 وهو ما يعبر عنه بشكل جوهري للحد من التعبير المتسرب من البروتين aECM. الكلورامفينيكول ضروري لتحديد للبكتيريا الخلايا التي تحتوي على pLysS خلال الثقافة. - كرر الخطوة 1.10 للحصول على تحويل E. خلايا القولونية التي هي على استعداد للتعبير عن البروتينات الاصطناعية. التفاف لوحات أجار في Parafilm وتخزين رأسا على عقب في 4 6؛ C لمدة تصل إلى واحد.
3. التعبير البكتيرية من البروتينات aECM
- انظر الشكل 2، واختيار مستعمرة من لوحة أجار تحولت مع طرف ماصة وتطعيم إلى 10 مل من معقم رائع مرق (TB) وسائل الاعلام (الجدول 1) تحتوي على كل الأمبيسلين والمضادات الحيوية الكلورامفينيكول في أنبوب الاختبار. احتضان هذه الثقافة المبتدئين في 37 ° CO / N (12-16 ساعة) مع اهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة.
- نقل 10 مل من ثقافة المبتدئين إلى 1 L سائل الإعلام TB جديدة ومعقمة تستكمل مع نفس المضادات الحيوية في قارورة 3 L مخروطي. احتضان الثقافة في 37 ° C مع اهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة لمدة 2-3 ساعة ومراعاة الكثافة البصرية للثقافة (OD 600) وصلت 0،6-0،8 قبل pipetting 1 مل من ثقافة إلى كوفيت فارغة للقراءة. حفظ 1 مل من ثقافة قبل الاستقراء لتوصيف SDS-PAGE.
- لقياس OD 600 من ثقافة الخلية، وإعداد 1 قنينة من وسائل الإعلام السل في كفيتلقياس فارغ. بشكل منفصل، ونقل 1 مل من ثقافة من قارورة الثقافة في كفيت جديدة فارغة. قياس الكثافة البصرية للثقافة استخدام الطيف ضد السيطرة فارغة في أحد الامتصاصية من 600 نانومتر.
- حفظ العينة (لاحقا تحليل SDS-PAGE) عن طريق نقل 1 مل من عينة الثقافة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 2 دقيقة، وصب طاف.
- حمل الثقافة مع الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى تركيز النهائي من 1 ملم واحتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 225 دورة في الدقيقة لساعة أخرى 4. حفظ 1 مل من ثقافة في نهاية الحث على 4 ساعات لتوصيف SDS-PAGE.
- حصاد الخلايا عن طريق تحويل الثقافة إلى 1 L زجاجات الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف، تزن الكريات الخلايا و resuspend في TEN العازلة (1 M تريس، 0.01 M EDTA، 0.1 M كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة = 8.0) في 0.5 غرام / مل.
4. تحلل من الثقافات البكتيرية
- تجميد زراعة الخلايا إعادة علقت في -80 درجة CO / N. ذوبان الجليد في زراعة الخلايا المجمدة في حمام مائي عند RT أو على الجليد لليز الخلايا. إضافة 10 ميكروغرام / مل ديوكسي ريبونيوكلياز I (الدناز I)، 10 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز A (ريبونوكلياز I)، و 50 ميكروغرام / مل phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF)، في حين الذوبان والتجانس الحل مع التحريك البطيء.
- بعد أن يتم إذابة جميع الخلايا معلق، وضبط حل لدرجة الحموضة 9.0 لزيادة ذوبانية البروتين في الماء 12. إضافة 6 قطرة N هيدروكسيد الصوديوم الحكمة مع التحريك على الجليد لتحقيق الاتساق متجانسة. ليز بسبب عرقلة بالموجات فوق الصوتية لمدة 20 دقيقة على الجليد باستخدام 2 مم طرف شقة، 5 ثانية النبض.
- أجهزة الطرد المركزي في حل الخلية في 12000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. طاف لنقل نظيفة، وزجاجة فارغة وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تنقية في وقت لاحق.
- وفي الوقت نفسه، resuspend الكرية الخلية مرة أخرى مع TEN العازلة وإعادة التجميد في -80 ° C. إلىتحلل الخلية كاملة، تكرار تجميد / الذوبان وصوتنة العملية تصل إلى ثلاثة أضعاف. وفر 20 المحللة خلية ميكرولتر لتوصيف SDS-PAGE.
5. تنقية aECM البروتينات عن طريق معكوس الانتقال الدراجات
- جمع المحللة الخلية من الخطوة 4.3، والشروع في تنقية البروتينات aECM باستخدام ITC، مماثلة لتلك المستخدمة لتنقية البروتينات القائم على الإيلاستين 21. وسوف يتم دورات مع درجات حرارة مختلفة والتي هي 4 ° C (المشار إليها باسم "الباردة") و 37 ° C (المشار إليها باسم "الحارة") دورات على التوالي.
- تقسيم المحللة الخلية إلى 50 مل زجاجات الطرد المركزي، وأجهزة الطرد المركزي في 40000 x ج لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية. وينبغي أن يكون ظهور بيليه الخلية البني الداكن وتبدو سيلان.
- إزالة طاف بواسطة pipetting للحصول على فصل نظيف من بيليه. جمع طاف في زجاجات الطرد المركزي نظيفة وإضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 1 M (بحد أقصى 3 M). دافئالحل إلى 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع اهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: سيتم إضافة كلوريد الصوديوم تؤدي إلى الانتقال من عنصر الإيلاستين من دون التسبب تجميع aECM. وطاف تتحول العكرة. إذا كان تركيز بروتين عالية بما فيه الكفاية، يمكن أن ينظر البروتين رغوي الأبيض على الجانبين من القمقم أجهزة الطرد المركزي. - أجهزة الطرد المركزي لطاف من الخطوة 5.3 في 40000 x ج لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. صب طاف. سحق بيليه باستخدام ملعقة معدنية و resuspend بت بيليه في الماء المقطر تعقيمها المثلج (50 ملغ / مل) مع التحريك القوي O / N عند 4 درجة مئوية باستخدام شريط مغناطيسي واللوحة. بيليه يجب أن تتفكك.
- كرر الخطوات من 5،2-5،4 لمدة ثلاث إلى خمس مرات أخرى للحصول على نقاء أعلى من البروتين.
- بعد دورة النهائية للتنقية، تحلية الحل البروتين dialyzing ضد الماء المقطر عند 4 درجات مئوية. Dialyze حل البروتين ضد الماء لمدة 2-3 أيام مع التغييرات في الماء كل 4ساعة أو 8 ساعات لO / N. وفر 20 ميكرولتر من البروتين النقي لSDS-PAGE ويجفد بقية البروتين النقي وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
6. توصيف aECM البروتينات عن طريق SDS-PAGE الكهربائي
- إعداد 12٪ هلام SDS-PAGE (إذا كان الوزن الجزيئي كبير، استخدم 8٪ الهلام SDS-PAGE للانفصال أفضل). إضافة 2X العازلة تحميل SDS على كل عينة، تسخين العينات لمدة 10 دقيقة في 100 درجة مئوية وتشغيل عينات على هلام لمدة 1 ساعة على 100 V أو حتى سلم البروتين الموافق الوزن الجزيئي للبروتين aECM تصل إلى منتصف هلام.
- استرداد جل من SDS-PAGE إعداد وإضافة Coomassie الأزرق اللامع وصمة عار (الجدول 2) مع وحدة لغمر هلام لمدة 1 ساعة في طبق بيتري. هلام شطف في حل destaining (الجدول 2) لمدة 5 دقائق على الكرسي الهزاز. تغيير الحل destaining، والاستمرار في يزيل اللون هلام مع هزاز حتى خلفية ركان جل يصبح واضحا. يجب أن تكون العصابات البروتين واضحة للعيان.
- مقارنة بين موقف البروتين المستهدف ضد السلم البروتين لتحديد الوزن الجزيئي للبروتين الهدف.
- لمزيد من تأكيد وجود البروتين المستهدف، نفذ النشاف الغربي كما في الخطوة 7.
7. توصيف aECM البروتينات عن طريق الغربية التنشيف
- تشغيل العينات على 12٪ هلام SDS-PAGE كما في القسم 6 مع أي تلطيخ.
- قطع غشاء النيتروسليلوز إلى حجم أكبر قليلا من هلام SDS-PAGE. قطع 4 قطع من ورق الترشيح لنفس الحجم.
- الرطب قطعة واحدة من ورق الترشيح مع نقل الغربي العازلة (20٪ ت / ت الميثانول، 25 ملي تريس، 190 ملي جليكاين، ودرجة الحموضة 8.3)، ووضع جل SDS-PAGE على رأس ورقة الترشيح، يليه آخر قطعة من ورق الترشيح ، ثم غشاء النيتروسليلوز والنهائية الأخرى قطعتين من ورق الترشيح. هي غارقة ضمان كامل مجموعة المتابعة مع كافية عازلة نقل الغربي.
ملاحظة: يجب أن لا يكون جل وغشاء على اتصال في هذه المرحلة من الوقت والبروتينات يمكن ربط الغشاء عند الاتصال. - نقل البروتينات على غشاء النيتروسليلوز من خلال وضع ورقتين مرشح في وحدة نقل شبه الجافة الغربية، تليها غشاء النيتروسليلوز، ووضع بعناية جل SDS-PAGE داخل وعلى الغشاء، ضع أخيرا اثنين من ورقة الترشيح الرطب الأخيرة على هلام SDS-PAGE. تشغيل نقل الغربية في 45 مللي أمبير، 30 دقيقة. إضافة العازلة إذا الجهد هو أعلى من 30 V.
ملاحظة: يفضل وضع جل SDS-PAGE على الغشاء مع محاولة واحدة وتجنب تحويل هلام لا داعي له على الغشاء كما بروتينات يمكن ربط الغشاء عند الاتصال. - استرداد ومنع غشاء النيتروسليلوز مع عرقلة الحل (5٪ الحليب الخالي من الدسم في برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة وتصفيتها مع ورقة فلتر) لمدة 2 ساعة على RT. التخلص من عازلة تمنع وإضافة PBS لشطف.
ملاحظة: التغيير إلى قفازات جديدة لتجنب تلوث الغشاء مع المتواجد غير المرغوب فيهالإضافية. - احتضان الأساسي لمكافحة صاحب الأجسام المضادة مع التخفيف في برنامج تلفزيوني في 1: 1000 في RT لمدة 1 ساعة مع هزاز. إعداد الخليط في حجم الذي يمكن أن يغرق الغشاء كله، على سبيل المثال، مع نسبة التخفيف 1: 1000، إضافة 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة (تركيز المخزون: 1 ملغ / مل) إلى 999 ميكرولتر PBS ل1 مل مجموع الخليط.
- شطف الغشاء مع 5 مل من PBST (PBS مع 0.1٪ Tween20).
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى البيروكسيديز الحصان الفجل (HRP) مع التخفيف في برنامج تلفزيوني في 1: 5000 في RT لمدة 1 ساعة مع هزاز. إعداد الخليط في حجم الذي يمكن أن يغرق الغشاء كله، على سبيل المثال، مع نسبة التخفيف 1: 5000، إضافة 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة (تركيز المخزون: 1 ملغ / مل) إلى 4999 ميكرولتر PBS ل5 مل مجموع الخليط.
- يغسل الغشاء مع 5 مل من PBST وكرر مرتين.
- تطبيق الركيزة chemiluminescent إلى الغشاء مع حجم لتغطية الغشاء واحتضان باتباع الإرشادات لالركيزة المستخدمة.
ملاحظة: حساسية الركيزة لكشف البروتين قد تختلف، ونحن نوصي ركيزة بأقصى قدر من الحساسية لإشارات منخفضة جدا في حالة زيادة تركيز الأجسام المضادة لا يزيد الإشارات. - التقاط إشارات chemiluminescent باستخدام جهاز تصوير كاميرا CCD القائمة. ضبط نسبة الأجسام المضادة تخفيف الابتدائية والثانوية إذا إشارات ضعيفة وغير محددة. احتضان يعد في عرقلة الحل إذا إشارة الخلفية عالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في تصميم البروتينات الانصهار التي تحتوي على تكرار مثل الإيلاستين، فمن المهم للحفاظ على المحتوى الإيلاستين العام، جزء كبير بما فيه الكفاية من البروتين الانصهار 18. هذا هو التأكد من أن بناء البروتين الانصهار يحتفظ خصائص شبيهة الإيلاستين لها، من أجل استخدام ITC لتنقية. تم نقل aECM البروتينات تصميم وتسلسل وصفها في هذا القسم تحديدا من العمل من قبل Tjin وآخرون. (14). وفي هذا العمل، تم استنساخ ثلاثة بروتينات aECM بنجاح في pET22b (+) ناقلات التعبير. بدأت ربط متسلسل أولا مع ligating يكرر الإيلاستين تضاف الى ناقلات الحيوانات الأليفة، وتليها إدراج المجال ملزم الخلية. وأخيرا أدرجت المجموعة الأخيرة من تكرار الإيلاستين في نهاية طرفية المجال ملزم خلية باستخدام نفس الأسلوب. للتحقق إذا كان قد تم بناؤها الجينات المؤتلف بنجاح، كان كل البلازميد المؤتلف اختبار يتفاعل مع XhoI وسالي لمدة 3 ساعة على 37 درجةمعارض C. الشكل 1 إدراج DNA وشرائح ناقلات بعد الاختبار الهضم. لكل من البروتينات aECM، حجم إدراج يتفق مع حجم الجين، مؤكدا أن الاستنساخ كانت ناجحة بالفعل. مزيد من التحقق من خلال تسلسل الحمض النووي أكد أيضا نتائج اختبار الهضم.
كنا قادرين على تنقية البروتينات aECM من خلال ITC نظرا محتوى كاف الإيلاستين الحاضر في كل بروتين aECM الشكل 2 يوضح التخطيطي لعملية تنقية الشاملة. تم تطعيم O / N الثقافة في 1 L هزة القارورة مع انطلاق OD نموذجي 600 من 0.01. نمت ثقافة إلى OD 600 من 0،6-0،8 بعد 3-4 ساعة. وكان المستحث التعبير البروتين باستخدام 1 ملم من IPTG. بعد 4 ساعات، وحقق OD النموذجي 1.5. كان حصادها ثقافة البكتيرية وتعرض لالطرد المركزي. تم تجاهل طاف وكان وزنه بيليه الخلية. كان متوسط وزن بيليه الخلية حوالي 3 ز / L منالثقافة. وكان بيليه إعادة علقت في TEN العازلة وتجميد في -80 درجة CO / N.
واستخدمت سلسلة من دورات تجميد / الذوبان لليز الخلايا. الخطوة تجميد ذوبان الجليد يتسبب في الخلية إلى تضخم وانكماش، وكسر في نهاية المطاف بسبب بلورات الجليد تشكلت خلال عملية التجميد. وفي وقت لاحق، الدناز الأول وريبونوكلياز I أضيفت إلى الخلايا المحللة لهضم كل DNA و RNA. PMSF هو المانع البروتيني، الذي أضاف أيضا إلى المحللة خلية للحد من تدهور البروتين. في حين أن زيادة ضمان كامل تحلل الخلية، وsonicated المحللة كذلك أبقى على الجليد.
وبعد ذلك تعرض المحللة الخلية إلى 3 دورات تنقية ITC. في نهاية 3 دورات، وبيليه في نهاية دورة دافئة تشبه العسل في الاتساق، وكان التلون الأصفر طفيف. تحولت بيليه شفافة على اتصال مع الماء، ويذوب بسهولة في الماء تعقيمها قبل المبردة مع اهتزاز. ومدال البروتين النقي لإزالة أي الصورة المتبقيةبديل. تم نقل الحل البروتين التي تم الحصول عليها في نهاية دورة الدافئة النهائية على طول قصيرة من أنابيب غسيل الكلى (12 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع). في نهاية غسيل الكلى، تم نقل الحل البروتين نظيفة 50 مل أنبوب الطرد المركزي وتجميد في -20 ° C. في اليوم التالي، ومجفف بالتجميد الحل البروتين المجمدة لإزالة محتوى الماء. ويبين الشكل 3 صورة من البروتين مدال، وجود مثل الصوف مظهر نموذجي.
لتحديد ما إذا كان المستحث التعبير البروتين في الواقع، والعينات التي تم جمعها قبل وبعد تحليلها تحريض من قبل SDS-PAGE الكهربائي. هنا، كان 12٪ هلام SDS-PAGE كافية لفصل البروتينات مع الأوزان الجزيئية من 20-150 كيلو دالتون. في حال أن وزن جزيئي كبير، أي> 100 كيلو دالتون، يمكن أن تستخدم 8٪ الهلام SDS-PAGE لأفضل فصل البروتين. ويبين الشكل 4 الفرقة البروتين مكثفة في الوزن الجزيئي وتوقع في سا يسببهاmple (حارة 2). عادة، تم إجراء تحليل SDS-PAGE مباشرة بعد تعبير البروتين قبل بدء تنقية. وفي وقت لاحق، ان عينات اخذت خلال عملية تنقية ويمكن أيضا أن يتم تحليلها باستخدام SDS-PAGE الكهربائي لضمان تنقية فعالة من البروتين المستهدفة. ويبين الشكل 4 أيضا جل SDS-PAGE تحتوي على عينة البروتين المنقى مع الوزن الجزيئي لل22 كيلو دالتون (حارة 4 )، المقابلة لLN-5 aECM 14. وكان نقاء المقدرة للبروتينات aECM حوالي 90٪ -95٪. وقد استمدت هذه القيمة من خلال مقارنة نسب شدة الفرقة من البروتين المستهدفة وشرائح البروتين الأخرى الموجودة على هلام SDS (الشكل 4، حارة 4). وأخيرا، لتحديد ما إذا كان البروتين المنقى في الواقع بروتينات aECM، تم إجراء النشاف الغربي. وفي وقت لاحق، تم تنفيذ MALDI-TOF أيضا إلى تحديد دقيق لمحتوى الشوائب من المواد النقية 14 ويبين الشكل 5 نقاء البروتين من اله ثلاثة بروتينات aECM مع جل SDS-PAGE في الشكل 5A ومقارنة ضد صورة للغشاء النيتروسليلوز لالنشاف الغربي في الشكل 5B، والتي تبين وجود البروتينات المستهدفة العقيد-IV aECM وLN-5 aECM، الموسومة استخدام الألغام المضادة -6x الأجسام المضادة صاحب العلامة مترافق مع الخيل الفجل البيروكسيد (HRP). وتراوحت غلة النهائية من البروتينات aECM بين 60 ملغ / لتر إلى 120 ملغم / لتر.
الشكل 1. DNA هلام الاغاروز الكهربائي للبروتينات aECM. التحقق من البروتين aECM النهائي DNA يبني من خلال تقييد الانزيمات ركض الهضم على 1.2٪ هلام الاغاروز DNA. البلازميدات المؤتلف ترميز لكل من البروتينات aECM تم هضمها مزدوجة مع XhoI وسالي لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية. أحجام إدراج تتوافق مع حجم كل aECM بروتين الجين (FN910: 1.8 KBP، العقيد-IV: 696 سنة مضت، LN-5: 699 بي بي) وحجم ناقلات pET22b (+) المستخدمة هي 5.5 KBP.
الشكل 2. تدفق تخطيطي للتعبير البروتين، تحلل وتنقية البروتينات aECM. الدليل الأساسي لالمؤتلف تعبير البروتين، بدءا من تلقيح مستعمرة واحدة في الثقافة الصغيرة وتصل إلى 1 L الثقافة والحصاد وإعادة التعليق الخلايا، تليها البروتين تحلل. وقد أجريت تنقية البروتين من خلال استخدام السلوك LCST من المجالات مثل الإيلاستين موجودة في البروتينات ECM الاصطناعية. ويتم تنقية البروتينات aECM عبر ITC. تم تنفيذ دورات الباردة والدافئة متعددة لتحقيق نقاء عالية من البروتين المستهدف. وأخيرا، تم مدال البروتين الهدف بالماء ومجفف بالتجميد حتى استخدامها مرة أخرى. "O / N" = بين عشية وضحاها. "ق / ن" = طاف.
r.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 3. صورة من مجفف بالتجميد البروتين aECM تنقيته بواسطة معكوس الانتقال ركوب الدراجات. المجففة بالتبريد LN5-aECM لها مظهر يشبه الصوف.
الرقم 4. SDS-PAGE الكهربائي للهلام من البروتين aECM (LN-5 aECM). لين 1 و 2 يبين الثقافة قبل وبعد البروتين الاستقراء. وجود عصابة سميكة قرب 22 كيلو دالتون يظهر أن أعرب عن LN-5 aECM بنجاح. لين 3 يبين المحللة خلية كاملة في حين حارة 4 يبين النقي LN-5 بروتين aECM بعد 3 دورات من مركز التجارة الدولية.
الرقم هلام 5. (A) SDS-PAGE من البروتينات aECM. (B) لطخة غربية بحثها عن 6X صاحب العلامة لالعقيد-IV وLN-5 aECM البروتينات. كل من العقيد-IV وLN-5 aECM البروتينات تحتوي على C-محطة 6xHis العلامة. التوهج الايجابي الملحوظ في الوزن الجزيئي وتوقع في 22 كيلو دالتون لعينة LN-5 aECM و 24 كيلو دالتون لعينة العقيد-IV aECM تمثل 6X صاحب العلامة الموجودة في البروتين النقي.
| وسائل الإعلام / L | مكونات والتعليمات |
| وسائل الاعلام SOC | 20 ز تريبتون |
| 5 ز خلاصة الخميرة | |
| 0.6 غرام كلوريد الصوديوم | |
| 0.2 ز بوكل | |
| إضافة والأوتوكلاف في 940 مل من الماء، | |
| ثم إضافة المعقم (فلتر تعقيم) | |
| 10 مل 1 M MgCl 2 | |
| 10 مل 1 M MgSO 4 | |
| 40 مل 20٪ غلوكوز | |
| 16 ز تريبتون | |
| 10 جم مستخلص الخميرة | |
| 5 ز كلوريد الصوديوم | |
| 15 غرام Bacto آجار (إضافة فقط لوحة أجار) | |
| تذوب في الماء وأعلى ما يصل إلى 1 L الأوتوكلاف و. | |
| لإعداد لوحات أجار، باردة إلى 55 ° C قبل إضافة المضادات الحيوية. | |
| خلط جيدا قبل صب في طبق بيتري. | |
| تبريد اللوحات حتى توطد أجار. | |
| التفاف لوحات في Parafilm وتخزين رأسا على عقب في 4 ° C. | |
| مرق رائع (TB) | 12 غرام تريبتون |
| 24 ز خلاصة الخميرة | |
| 4 مل الجلسرين | |
| تذوب في 700 مل من الماء والأوتوكلاف. | |
| 16.42 ز K 2 هبو 4(ميرك) | |
| 2.31 ز KH 2 PO 4 (ميرك) | |
| وحلت تماما تذوب في 300 مل من الماء والأوتوكلاف على حدة، لضمان الأملاح. | |
| الجمع بين كل من أملاح المتوسطة وبعد التبريد. |
الجدول 1. وصفات لوسائل الإعلام SOC، 2xYT وسائل الإعلام / أجار ورائع مرق. وسائل الإعلام لE. ثقافة القولونية المستخدمة في الاستنساخ الجزيئي والبروتين التعبير.
| الحل / L | مكونات والتعليمات |
| Coomassie وصمة عار الزرقاء الرائعة | 0.25 ز Coomassie blueR250 |
| 100 مل حامض الخليك الجليدي | |
| 450 مل ميثيل الكحول | |
| 450 مل من الماء | |
| 100 مل حامض الخليك الجليدي | |
| 400 مل ميثيل الكحول | |
| 500 مل من الماء |
الجدول 2. وصفات لحلول وصمة عار ويزيل اللون هلام SDS-PAGE. Coomassie بريليانت الأزرق R250 لتلطيخ وحل destaining لتوصيف باستخدام SDS-PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المؤتلف هندسة البروتينات هي تقنية متعددة لخلق مواد جديدة البروتين باستخدام نهج من أسفل إلى أعلى. ويمكن تصميم المواد القائمة على البروتين لديهم وظائف متعددة، مصممة خصيصا وفقا لطلب من الفائدة. نتيجة لزيادة التقدم في تقنيات الاستنساخ والبروتين التعبير، فقد أصبح من السهل نسبيا (وفعالة من حيث التكلفة) لخلق مجموعة متنوعة من البروتينات الاصطناعية بطريقة متكررة ومتدرجة. وقد أدرجت المجال مثل الإيلاستين في عدد من البروتينات الاصطناعية، لتكون بمثابة علامة التنقية، فضلا عن منح الخواص الميكانيكية. البروتينات الاصطناعية التي تحتوي على تسلسل مثل الإيلاستين يمكن تنقيته بسهولة باستخدام ITC، مما يلغي الحاجة للأعمدة تنقية مكلفة والأجسام المضادة.
يصف هذا البروتوكول الخطوات لبناء البلازميدات المؤتلف ترميز للبروتينات aECM. تم شراؤها الجينات التي تكود لتكرار مثل الإيلاستين. إلىالمتكرر للغاية تسلسل الببتيد البروتينية مثل الإيلاستين مثل، فمن المستحسن لتصميم استراتيجية الاستنساخ بحيث ربط الاتجاه عودي (RDL) الاستراتيجيات التي يمكن استخدامها 22. باستخدام RDL، البروتينية المتكررة مع مدة محددة سلسلة يمكن توليفها وبالتالي جينات الفائدة يمكن شراؤها كما أحادية قصيرة.
في عملنا، وقد صممت المجالات ملزم خلية لاحتواء المرافقة تقييد مواقع NheI على كلا الطرفين للسماح للمبادلة وحدات من المجال ملزم الخلية المركزية. من المهم تحديد المواقع قيود التي هي فريدة من نوعها وغير موجودة في المجال الوظيفي أو أي مكان آخر خارج موقع استنساخ متعددة (MCS) من ناقلات المضيف. هذا هو لحصر الهضم من إدراج أو متجه إلى المواقع المقصودة. في بعض الحالات، قد يكون من الضروري إدخال تقييد مواقع جديدة في ناقلات المضيف باستخدام الطفرات قبل الإدراج في المجال الوظيفي.
لناسمحت استراتيجية استنساخ لنا لتغيير بسهولة المجال المركزي ملزم خلية للحصول على ثلاثة أنواع من البروتينات aECM. لاحظنا أيضا أن إدخال بقايا يسين بعد زيادة الميثيونين بدءا العائد البروتين بأكثر من 10 أضعاف. وكانت هذه الزيادة الهائلة في إنتاج البروتين الأكثر وضوحا مع LN-5 aECM البروتين، حيث ارتفع العائد البروتين النهائي من 5 ملغ / لتر إلى 60 ملغ / L.
مختلف E. وتمت مقارنة القولونية المضيفين التعبير، وBL21 (DE3) pLysS E. أعطى سلالة القولونية أفضل العوائد البروتين. كان التحسن في العائد البروتين الحد الأدنى عندما كان المستحث البروتين التعبير مع IPTG لمدة أطول من 4 ساعات. لم يكن هناك اختلاف كبير في تعبير البروتين في تركيزات IPTG أكبر من 1 ملم. ومع ذلك، كان تعبير البروتين أعلى عندما يتسبب في OD أقرب إلى 0.6.
لاسترداد الفعال للبروتينات aECM باستخدام ITC، فمن المهم أن نلاحظ أن درجة حرارة جهاز الطرد المركزي. للامتحانسبيل، تم تنفيذ معظم الخطوات تنقية في غرفة باردة (4 ° C) لضمان الذوبان القصوى من البروتينات aECM. قد يكون من الضروري أيضا إلى ما قبل البرد إلى (4 ° C) في أجهزة الطرد المركزي الدوار O / N قبل دورة الباردة. وبالمثل، كان الدوار الطرد المركزي قبل تسخينها إلى (37 ° C) قبل دورة الحارة لضمان درجة حرارة حل البروتين واستمر فوق T تي في.
وباختصار، فإن الإجراءات لتصميم وصفت البلازميدات المؤتلف استنساخ ترميز البروتينات ECM الاصطناعية. على وجه الخصوص، ويرد التعبير وتنقية البروتينات aECM باستخدام ITC. أخيرا، وصفت توصيف البروتينات aECM باستخدام الكهربائي SDS-PAGE والغربية التنشيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أن نعترف التمويل من وزارة التربية والتعليم AcRF الفئة 1 (RG41) وبدء منحة من جامعة نانيانغ التكنولوجية. ويتم تمويل منخفضة وTjin من قبل منحة بحثية طالب (RSS) من جامعة نانيانغ التكنولوجية، سنغافورة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET22b (+) | Novagen | 69744 | T7 expression vectors with resistance to ampicillin |
| BL21(DE3)pLysS | Invitrogen | C6060-03 | additional antibiotics - chloramphenicol |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction. |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | plasmid isolation kit |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Ampicillin | Affymetrix | 11259 | |
| Chloramphenicol | Affymetrix | 23660 | |
| Zymoclean™ gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | |
| XL10-gold strain | Agilent Technologies | 200315 |
References
- Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. Elastomeric biomaterials for tissue engineering. Prog Polym Sci. 38 (3-4), 584-671 (2013).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 352-366 (2011).
- Kushner, A. M., Guan, Z. Modular Design in Natural and Biomimetic Soft Materials. Angewandte Chemie International Edition. 50 (39), 9026-9057 (2011).
- Gagner, J. E., Kim, W., Chaikof, E. L. Designing protein-based biomaterials for medical applications. Acta Biomater. 10 (4), 1542-1557 (2014).
- Gomes, S., Leonor, I. B., Mano, J. F., Reis, R. L., Kaplan, D. L. Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering. Prog Polym Sci. 37 (1), 1-17 (2012).
- Werkmeister, J. A., Ramshaw, J. A. M. Recombinant protein scaffolds for tissue engineering. Biomedical Materials. 7 (1), 012002 (2012).
- MacNeil, S. Biomaterials for tissue engineering of skin. Materials Today. 11 (5), 26-35 (2008).
- Fong, E., Tirrell, D. A. Collective Cell Migration on Artificial Extracellular Matrix Proteins Containing Full-Length Fibronectin Domains. Advanced Materials. 22 (46), 5271-5275 (2010).
- Ratner, B. D., Bryant, S. J. BIOMATERIALS: Where We Have Been and Where We are Going. Annual Review of Biomedical Engineering. 6 (1), 41-75 (2004).
- Cai, L., Heilshorn, S. C. Designing ECM-mimetic materials using protein engineering. Acta Biomater. 10 (4), 1751-1760 (2014).
- Annabi, N., et al. Elastomeric recombinant protein-based biomaterials. Biochemical Engineering Journal. 77 (0), 110-118 (2013).
- Heilshorn, S. C., DiZio, K. A., Welsh, E. R., Tirrell, D. A. Endothelial cell adhesion to the fibronectin CS5 domain in artificial extracellular matrix proteins. Biomaterials. 24 (23), 4245-4252 (2003).
- Simnick, A. J., Lim, D. W., Chow, D., Chilkoti, A. Biomedical and Biotechnological Applications of Elastin-Like Polypeptides. Polymer Reviews. 47 (1), 121-154 (2007).
- Tjin, M. S., Chua, A. W. C., Ma, D. R., Lee, S. T., Fong, E. Human Epidermal Keratinocyte Cell Response on Integrin-Specific Artificial Extracellular Matrix Proteins. Macromolecular Bioscience. 14 (8), 1125-1134 (2014).
- MacNeil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Kariya, Y., et al. Differential regulation of cellular adhesion and migration by recombinant laminin-5 forms with partial deletion or mutation within the G3 domain of α3 chain. J Cell Biochem. 88 (3), 506-520 (2003).
- Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., Quaranta, V. The LG3 module of laminin-5 harbors a binding site for integrin α3Β1 that promotes cell adhesion, spreading, and migration. J Biol Chem. 276 (35), 33045-33053 (2001).
- Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Current Protocols in Protein Science. , 6.11.1-6.11.16 (2010).
- Keeley, F. Ch. 4. Evolution of Extracellular Matrix.Biology of Extracellular Matrix. , Springer. Berlin Heidelberg. 73-119 (2013).
- Le, D. H. T., et al. Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides. Biomacromolecules. 14 (4), 1028-1034 (2013).
- MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583 (2014).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
