Protocol
1. Kloning af rekombinant plasmider, der koder for aECM Proteiner
- Designe aminosyresekvensen af det funktionelle domæne (f.eks cellebindende domæne og elastin-lignende gentagelser). Design restriktionssteder der flankerer enderne af de funktionelle domæner for at lette subkloning ved anvendelse af fri software ifølge softwareinstruktioner (f.eks http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Her vælge unikke restriktionssteder, der ikke er til stede i det funktionelle domæne at begrænse nedbrydning til de tilsigtede steder. Vælg restriktionssteder, der vises i det multiple kloningssted (MCS), i værtsvektoren (f.eks pET22b (+)) for sub-kloning.
- Reverse translate aminosyresekvensen i nucleotidsekvensen ved anvendelse gratis hjemmesider ifølge softwareinstruktioner. (F.eks http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Sikrer codoner er optimeret for E. coli værter.
- Gen af interesse kan være Purchased kommercielt som enkeltstrengede oligonukleotider (dvs. hvis oligonucleotider <100 basepar (bp)) og udføre DNA annealing (se trin 1.4) for at reducere omkostningerne. Ellers for gener større end 100 bp, de kunne købes gennem kommercielle selskaber.
- DNA annealing af oligonukleotiderne
- Anneale de DNA-oligomerer for at opnå den ønskede gensekvens. Opløs DNA-oligonukleotider i en DNA-oligomer-buffer (10 mM Tris: 2-amino-2- (hydroxymethyl) propan-1,3-diol, pH 8,0, filtreret) til en slutkoncentration på 1 pg / pl.
- Tilsættes 4 pi af hver oligomer til 32 pi DNA annealing buffer (10 mM Tris, 100 mM NaCl og 100 nM MgCI2) for at opnå en samlet 40 pi blanding.
- Koge et bægerglas med vand med en varmeplade, og nedsænke blandingen i 5 min, 95 ° C. Fjern bægeret og gradvist køle hele sat op i en Styrofoam box O / N. Oligomererne er blevet annealet og er klar til fordøjelsen.
BEMÆRK: pET22b (+) plasmid vektor er ampicillin antibiotikaresistente og indeholder et 6x-His-tag ved C-terminalen. 6x-His-tag til stede i pET22b (+) tillader os at bruge hans-mærkede antistoffer til at identificere målproteinet via Western blotting i trin 7. - Tilføj 6x loading dye til hver fordøjelse blanding. Kør fordøjelsen blandinger separat indbefatter en DNA-stige på 1,2% DNA agarosegeler indeholdende en UV-fluorescerende DNA-farve i 1 time ved 100 V. visualisere 1,2% DNA agarosegel med et UV-lys illuminator.
- Skær gelen at udtrække fordøjede DNA-produkter under anvendelse af kommercielle geloprensning kits. Elute ved hjælp af den mindste mængde for den kolonne for at opnå en DNA-koncentration på 50-100 ng / ul minimum.
- Kombiner genet af interesse sekventielt ved at ligere fordøjede DNA-insert (dvs. elastin gentagelser eller cellebindende domæner opnået ved DNA annealing) i plasmidvektoren under anvendelse af T4-ligase ved anvendelse af følgende opskrift: (2 pi vektor, 1 pi T4-ligase, 1,5 pi T4 ligeringspuffer, x pi insert, 10,5-x pi vand til en samlet 15 pi blanding). Inkubér ligeringsblandingen ved stuetemperatur i 2 timer.
BEMÆRK: molære koncentration af vektor til at indsætte bør varieres for at optimere ligering effektivitet. Volumen af insert beskrevet som x i opskriften afhænger af den eluerede DNA-koncentration fra trin 1.7. - Thaw E. coli DH5a kemisk kompetente celler (eller enhver kloning stamme) på is. Varm 2xYT agarplader (tabel 1) indeholdende ampicillin (25 ug / ml) til 37 ° C.
- Transformere cellerne under anvendelsevarmechok:
- Portion 50 pi kompetente celler i rene, pre-kølede mikro-centrifugerør. Afpipetteres 5 pi (mellem 100 pg til 100 ng) af ligeringsblandingen ind i cellerne, pipettering forsigtigt op og ned for at blande. Lad blandingen på is i 20 minutter.
- Nedsænkes mikro-centrifugerør indeholdende celleblandingen i et 42 ° C vandbad i 2 minutter og vendte tilbage til på is i 2 min. Tid nedsænkningen varighed for at minimere varmeskader til cellerne.
- Tilsættes 500 pi SOC medium (tabel 1) ind i mikro-centrifugerør og inkuberes ved 37 ° C under omrystning i 1 time.
- Spred 50 500 pi af celle / ligeringsblandingen på en 2 x YT agar plade, der er blevet præ-opvarmet til stuetemperatur, indeholdende ampicillin (25 ug / ml) og inkuberes pladerne på hovedet ved 37 ° CO / N (12-16 timer) .
- Den næste dag, pluk DNA kolonier fra agarpladen hjælp rene pipettespidser. Grow kolonierne i 5 ml 2YT medier (tabel1) indeholdende ampicillin (25 ug / ml) O / N ved 37 ° CO / N (12-16 timer) med rystning (225 rpm).
- Den følgende dag bruge et plasmid isolation kit til at udtrække DNA-plasmider for hver koloni plukket ifølge producentens protokol. Eluering af DNA'et med 50 pi vand.
- Udføre en test fordøje med restriktionsenzymer under anvendelse af følgende opskrift: (5 pi DNA, 0,2 ul af hver restriktionsenzym, 1 pi 10x restriktionsenzym buffer og påfyld vand for i alt 10 pi blanding), inkuberes i 2 timer ved 37 ° C til screening for kolonier, som sandsynligvis indeholder indsatsen og køre på 1,2% DNA agarosegel som i trin 1.6.
BEMÆRK: Ved fordøjelse, en succesfuld ligation bør resultater i to bands, en hver for vektor og insert, der svarer til deres respektive molekylvægt (figur 1). - Send de sandsynlige kolonier for DNA-sekventering under anvendelse af T7 promotor forward og reverse primere til kommercielle sequencere.
- Fra sekventering resultat, vælg koloni, der er blevet succesfuldt ligeret og bruge DNA-plasmid til transformation i en E. coli ekspressionsvært.
- Thaw E. coli ekspression stammen (BL21 (DE3) pLysS) på is. I mellemtiden, varme agarplader indeholdende ampicillin (25 ug / ml) og chloramphenicol (34 ug / ml) til RT.
BEMÆRK: pLysS-plasmidet er til stede i bakterier stamme BL21 (DE3) pLysS indeholder et chloramphenicolresistensgen. Den pLysS-plasmidet indeholder en T7-repressor-gen, som udtrykkes konstitutivt at begrænse utætte ekspression af aECM proteinet. Chloramphenicol er nødvendigt at selektere for bakterieceller, der indeholder pLysS under dyrkning. - Gentag trin 1.10 for at få omdannet E. coli celler, der er klar til at udtrykke de kunstige proteiner. Wrap agarplader i Parafilm og gemme hovedet i 4 6; C i op til en måned.
3. Bakteriel ekspression af aECM Proteins
- Der henvises til figur 2, vælge en koloni fra den transformerede agarplade med en pipettespids og inokulering i 10 ml sterile Terrific Broth (TB) medier (tabel 1) indeholdende både ampicillin og chloramphenicol antibiotika i et reagensglas. Inkuber denne starterkultur ved 37 ° CO / N (12-16 timer) med rystning ved 225 rpm.
- Overførsel 10 ml af starterkulturen i 1 liter frisk og sterile TB medium suppleret med de samme antibiotika i en 3 L Erlenmeyer-kolbe. Inkuber kulturen ved 37 ° C under omrystning ved 225 rpm i 2-3 timer, og observere den optiske densitet af kulturen (OD600) nåede 0,6-0,8 ved at pipettere 1 ml af kulturen i en tom kuvette til læsning. Spar 1 ml kultur før induktion til SDS-PAGE karakterisering.
- For at måle OD600 på cellekulturen, forberede 1 hætteglas af TB medier i en kuvettefor en tom måling. Separat, overføres 1 ml kultur fra dyrkningskolben ind i en ny tom kuvette. Mål den optiske densitet af kulturen ved anvendelse af et spektrofotometer mod blanketten kontrol ved en absorbans på 600 nm.
- Gemme prøven (efterfølgende SDS-PAGE analyse) ved at overføre de 1 ml af kulturen prøven i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, centrifugeres ved 12.000 xg i 2 min, og dekanter supernatanten.
- Inducere kultur med isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) til en slutkoncentration på 1 mM, og der inkuberes ved 37 ° C under omrystning ved 225 rpm i yderligere 4 timer. Spare 1 ml kultur i slutningen af induktion ved 4 timer til SDS-PAGE karakterisering.
- Cellerne høstes ved at overføre kulturen til 1 L centrifugeflasker og centrifugeres ved 12.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, vejes cellepellets og resuspender i TEN-buffer (1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl, pH = 8,0) ved 0,5 g / ml.
4. Lyse af bakteriekulturer
- Frys resuspenderet cellekultur ved -80 ° CO / N. Optø den frosne cellekultur i et vandbad ved stuetemperatur eller på is for at lysere cellerne. Tilsæt 10 ug / ml Deoxyribonuclease I (DNase I), 10 ug / ml ribonuclease A (RNase I), og 50 ug / ml phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), mens optøning og homogenisere opløsningen med langsom omrøring.
- Efter at alle resuspenderede celler optøs, justere opløsningen til pH 9,0 til forøgelse af opløseligheden protein i vand 12. Tilføje 6 N NaOH dråbevis under omrøring på is for at opnå en homogen konsistens. Lyse af ultralyd forstyrrelser i 20 minutter på is ved hjælp af en 2 mm diameter flad spids, 5 sek puls.
- Centrifuger cellen opløsning ved 12.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Supernatanten overføres til en ren, tom flaske og opbevares ved 4 ° C i oprensning senere.
- I mellemtiden resuspender cellepelleten igen med TEN-buffer og re-fryse ved -80 ° C. Tilkomplet cellelyse, gentag frysning / optøning og ultralydsbehandling proces op til tre gange. Spar 20 pi cellelysat til SDS-PAGE karakterisering.
5. Oprensning af aECM proteiner under anvendelse Inverse Transition Cycling
- Sammenstiller cellelysatet fra trin 4.3 og fortsætte til oprense aECM proteiner under anvendelse af ITC svarende til den, der anvendes til oprensning af elastin-baserede proteiner 21. Cyklusser vil ske med de forskellige temperaturer, som er 4 ° C (omtalt som "kolde") og 37 ° C (omtalt som "varm") cyklusserne.
- Split cellelysatet i 50 ml centrifugerør, og der centrifugeres ved 40.000 xg i 2 timer ved 4 ° C. Udseendet af cellepelleten skal være mørk brun og ser løbende.
- Fjern supernatanten ved pipettering at få en ren adskillelse fra pelleten. Opsaml supernatanten i rene centrifugeflasker og tilføj NaCI til en slutkoncentration på 1 M (til maksimalt 3 M). Varmopløsningen til 37 ° C i 2 timer under omrystning ved 225 rpm.
BEMÆRK: Tilsætning af NaCl vil udløse overgangen af elastin komponent i aECM forårsager sammenlægning. Supernatanten vil vende uklar. Hvis proteinkoncentrationen er høj nok, kan hvid skummende protein ses på siderne af centrifugeflaske. - Centrifugeres supernatanten fra trin 5.3 ved 40.000 xg i 2 timer ved 37 ° C. Dekanteres. Knuse pelleten under anvendelse af en metalspatel, og pellet resuspenderes bits i iskoldt autoklaveret destilleret vand (50 mg / ml) med kraftig omrøring O / N ved 4 ° C under anvendelse af en magnetisk omrørerstav og plade. Pillen skal være helt opløst.
- Gentag trin 5.2 5.4 i yderligere tre til fem gange for at opnå en højere renhed af proteinet.
- Efter den sidste cyklus af oprensning, afsalte proteinopløsningen ved at dialysere det mod destilleret vand ved 4 ° C. Dialyse proteinopløsning mod vand i 2-3 dage med ændringer i vand hver 4hr eller 8 timers for O / N. Spar 20 pi af det oprensede protein til SDS-PAGE og lyofiliseres resten af det oprensede protein og opbevares ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.
6. Karakterisering af aECM proteiner under anvendelse SDS-PAGE elektroforese
- Der fremstilles en 12% SDS-PAGE-gel (hvis molekylvægten er stort, bruge 8% SDS-PAGE geler for bedre separation). Tilføj 2x SDS loading buffer til hver prøve, opvarme prøverne i 10 minutter ved 100 ° C og køre prøver på gelen i 1 time ved 100 V indtil proteinet stigen svarende til molekylvægten af aECM proteinet når midten af gel.
- Hent gelen fra SDS-PAGE oprette og tilføje Coomassie Brilliant Blue farvning (tabel 2) med et volumen at oversvømme gelen i 1 time i en petriskål. Skyl gel i en Affarvningsopløsningen (tabel 2) i 5 minutter på en rocker. Ændre Affarvningsopløsningen, og fortsætte med at affarvning af gelen med rocking indtil baggrunden af tHan gel bliver klar. Protein bands skal være klart synlige.
- Sammenlign positionen af målproteinet mod proteinet stigen til bestemmelse af molekylvægten af målproteinet.
- For yderligere at bekræfte tilstedeværelsen af målproteinet, udføre western blotting som i trin 7.
7. Karakterisering af aECM proteiner under anvendelse af Western blot
- Køre prøverne på en 12% SDS-PAGE-gel som i afsnit 6 med nogen farvning.
- Skåret nitrocellulosemembran til en størrelse lidt større end SDS-PAGE-gel. Skær 4 stykker filterpapir til samme størrelse.
- Våd ét stykke filterpapir med Western Transfer Buffer (20% volumen / volumen methanol, 25 mM Tris, 190 mM glycin, pH 8,3), anbringes SDS-PAGE-gel oven på filterpapir, efterfulgt af et andet stykke filtrerpapir Så nitrocellulosemembranen og en afsluttende andre to stykker filterpapir. Sørg hele set-up er neddykket med tilstrækkelig vestlige transfer buffer.
BEMÆRK: gel og membran bør ikke være i kontakt på dette tidspunkt, da proteiner kunne binde til membranen ved kontakt. - Overføre proteinerne onto nitrocellulosemembran ved at placere to filterpapir i en vestlig halvtør overførselsenhed, efterfulgt af nitrocellulosemembran, og anbring forsigtigt SDS-PAGE-gel i og på membranen endelig placere de to sidste vådt filtrerpapir på SDS-PAGE-gel. Kør den vestlige overførsel på 45 mA, 30 min. Tilføj buffer, hvis spændingen er højere end 30 V.
BEMÆRK: Fortrinsvis placere SDS-PAGE-gel på membranen med et forsøg og undgå at flytte gelen unødigt på membranen som proteiner kunne binde til membranen ved kontakt. - Hente og blokere nitrocellulosemembranen med blokerende opløsning (5% fedtfri mælk i PBS pH 7,4, filtreret med filtrerpapir) i 2 timer ved stuetemperatur. Bortskaf blokerende buffer, og der tilsættes PBS at skylle.
BEMÆRK: Skift til nye handsker for at undgå forurening af membranen med uønsket proteins. - Inkuber primære anti-His-antistof med fortynding i PBS ved 1: 1.000 ved stuetemperatur i 1 time med vipning. Klargør en blanding i et volumen, som kan nedsænkes hele membran, for eksempel med fortyndingsforhold 1: 1.000, tilsættes 1 ml af antistof (koncentration af stamopløsning: 1 mg / ml) til 999 pi PBS i en 1 ml totale blanding.
- Skyl membranen med 5 ml PBST (PBS med 0,1% Tween 20).
- Inkuber med sekundært antistof konjugeret til peberrodsperoxidase (HRP) med fortynding i PBS ved 1: 5000 ved stuetemperatur i 1 time med vipning. Klargør en blanding i et volumen, som kan nedsænkes hele membran, for eksempel med fortyndingsforhold 1: 5.000, tilsættes 1 ml af antistof (koncentration af stamopløsning: 1 mg / ml) til 4.999 pi PBS for en 5 ml totale blanding.
- Vask membranen med 5 ml PBST og gentag to gange.
- Påfør kemiluminescerende substrat til membranen med et volumen til at dække membranen og inkuberes ved at følge instruktionerne for det anvendte substrat.
BEMÆRK: Underlaget følsomhed over for protein afsløring kan variere, anbefaler vi et substrat med maksimal følsomhed for meget lave signaler i tilfælde stigende antistofkoncentration øger ikke signaler. - Fange de kemiluminescerende signaler under anvendelse af et CCD-kamera baseret imager. Juster det primære og sekundære antistof fortyndingsforhold hvis signalerne er svage og ikke-specifik. Inkuber længere i blokeringsopløsning hvis baggrund signalet er højt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved udformningen fusionsproteiner indeholdende elastin-lignende gentagelser, er det vigtigt at opretholde et samlet indhold elastin, stor nok del af fusionsproteinet 18. Dette er for at sikre, at fusionsproteinkonstruktion bevarer sine elastin-lignende egenskaber, for at kunne bruge ITC til oprensning. Den aECM proteiner design og sekvenserne beskrevet i dette afsnit var specifikt taget fra arbejde af Tjin et al. 14. I dette arbejde blev tre aECM proteiner med succes klonet ind i pET22b (+) ekspressionsvektor. Sekventiel ligering først begyndte med ligering af elastin gentagelser indsætte i pET vektoren efterfulgt af indsættelse af cellebindende domæne. Endelig det sidste sæt elastin repeats blev indsat i den fjerneste del af cellen bindingsdomæne ved anvendelse af den samme metode. At kontrollere, om de rekombinante gener er blevet konstrueret, hver rekombinant plasmid blev test fordøjet med Xhol og Sall for 3 timer ved 37 °C. Figur 1 viser DNA-insert og vektor bånd efter testen fordøjelse. For hver af de aECM proteiner, størrelsen af indsatserne svarede til størrelsen af genet, der bekræfter, at kloning var faktisk en succes. Yderligere kontrol gennem DNA-sekventering bekræftede også de test fordøjelsen resultater.
Vi var i stand til at oprense proteiner aECM gennem ITC får tilstrækkelig elastinindhold stede i hver aECM protein. Figur 2 viser den skematiske af den samlede rensningsproces. O / N-kulturen blev inokuleret i 1 liter rystekolbe med en typisk start OD600 på 0,01. Kulturen voksede til OD600 på 0,6-0,8 efter 3-4 timer. Protein blev induceret ved anvendelse af 1 mM IPTG. Efter 4 timer er typiske OD på 1,5 nået. Bakteriekulturen blev høstet og underkastet centrifugering. Supernatanten blev kasseret, og cellepelleten blev vejet. Den gennemsnitlige vægt af cellepelleten var omkring 3 g / lkultur. Pelleten blev resuspenderet i TEN-buffer og nedfrosset ved -80 ° CO / N.
En række frysning / optøningscykler blev anvendt til at lysere cellerne. Fryse-tø trin forårsager cellen til at kvælde og skrumpe, i sidste ende rev grund iskrystaller dannes under fryseprocessen. Efterfølgende DNase I og RNase I blev tilsat til cellelysatet at fordøje alle DNA og RNA. PMSF er en proteaseinhibitor, der blev også tilsat til cellelysatet at minimere proteinnedbrydning. For yderligere at sikre fuldstændig cellelyse blev lysatet yderligere sonikeret mens holdes på is.
Cellelysatet blev derefter underkastet 3 cyklusser af ITC oprensning. Ved afslutningen af de 3 cyklusser, pelleten ved afslutningen af den varme cyklus lignede honning i konsistens og havde en svag gul farve. Pelleten vendte transparent ved kontakt med vand, og letopløseligt i præ-kølet autoklaveret vand under omrystning. Det oprensede protein dialyseres for at fjerne eventuelle resterende salt. Proteinopløsningen opnået ved afslutningen af den sidste cyklus varme blev overført til en kort længde af dialyserør (med 12 kDa molekylvægt afskåret). Ved afslutningen af dialyse blev proteinopløsningen overført til et rent 50 ml centrifugerør og frosset ved -20 ° C. Den næste dag blev den frosne proteinopløsning lyofiliseret for at fjerne vandindholdet. Figur 3 viser et billede af den dialyserede protein, der har en typisk uld-lignende udseende.
At bestemme, om protein-ekspression faktisk var induceret, udtaget før og efter induktion blev analyseret ved SDS-PAGE elektroforese. Her, 12% SDS-PAGE-gel var tilstrækkelig til at adskille proteiner med molekylvægte på 20-150 kDa. I tilfælde af at molekylvægten er stort, dvs.> 100 kDa, 8% SDS-PAGE geler kan anvendes til bedre proteinseparation. Figur 4 viser et intenst proteinbånd ved den forudsagte molekylvægt i den inducerede sample (bane 2). Typisk blev SDS-PAGE analyse umiddelbart efter proteinekspression inden rensning. Efterfølgende prøver taget gennem oprensningsprocessen kan også analyseres under anvendelse af SDS-PAGE-elektroforese at sikre en effektiv oprensning af målproteinet. Figur 4 viser også en SDS-PAGE gel indeholdende et oprenset protein prøve med en molekylvægt på 22 kDa (bane 4 ), svarende til den LN-5 aECM 14. Den anslåede renhed af de aECM proteinerne var omkring 90% -95%; denne værdi blev afledt ved at sammenligne forholdene mellem de båndintensiteter af målproteinet og andre proteinbånd til stede på SDS-gel (figur 4, bane 4). Endelig, for at afgøre, om det oprensede protein var faktisk de aECM proteiner blev western blotting udført. Efterfølgende blev MALDI-TOF også udført nøjagtigt at bestemme indholdet af det oprensede materiale 14 urenhed. Figur 5 viser proteinrenhed af the tre aECM proteiner med en SDS-PAGE-gel i figur 5A og til at sammenligne med et billede af nitrocellulose membran til western blotting i figur 5B, som viser tilstedeværelsen af målproteinerne Col-IV aECM og LN-5 aECM, tagget ved anvendelse af anti -6x His-tag-antistoffer konjugeret med peberrodsperoxidase (HRP). De endelige udbytter af aECM proteinerne lå mellem 60 mg / l til 120 mg / l.
Figur 1. DNA agarosegelelektroforese af aECM proteiner. Verifikation af endelige aECM protein DNA-konstruktioner gennem restriktionsenzymer fordøjelsen modtog 1,2% DNA agarosegel. Rekombinante plasmider, der koder for hver af de aECM proteiner blev dobbelt fordøjet med Xhol og Sall i 3 timer ved 37 ° C. Størrelserne af indsatsene svarer til størrelsen af hver aECM proteingen (FN910: 1.8kbp, Col-IV: 696 bp, LN-5: 699 bp) og størrelsen af vektoren pET22b (+) anvendes, er 5,5 kbp.
Figur 2. Skematisk flow for proteinekspression, lysis og oprensning af aECM proteiner. Den grundlæggende vejledning til rekombinant proteinekspression, startende fra inokulering af en enkelt koloni til små kultur og skalere op til 1 l kultur, høst og resuspendering af celler, efterfulgt af protein lysis. Proteinoprensning blev udført ved hjælp af LCST adfærd elastin-lignende domæner er til stede i de kunstige ECM-proteiner. De aECM proteiner oprenses via ITC. Multiple kolde og varme cykler blev udført for at opnå en høj renhed af målproteinet. Endelig blev målproteinet dialyseret med vand og lyofiliseret indtil videre anvendelse. "O / N" = natten over. "S / n" = supernatant.
Figur 3. Billede af frysetørret aECM protein renses ved Inverse Transition Cykling. Frysetørret LN5-aECM har en uld-lignende udseende.
Figur 4. SDS-PAGE-gelelektroforese af aECM protein (LN-5 aECM). Bane 1 og 2 viser kultur før og efter protein induktion. Tilstedeværelse af en tyk bånd nær 22 kDa viser, at LN-5 aECM held blev udtrykt. Bane 3 viser den fulde cellelysat mens bane 4 viser den oprensede LN-5 aECM protein efter 3 cykler af ITC.
Figur 5. (A) SDS-PAGE-gel af aECM proteiner. (B) Western blot probet for 6x His-tag for Col-IV Og LN-5 aECM proteiner. Både Col-IV og LN-5 aECM proteiner indeholder C-terminal 6xHis-tag. Positive kemiluminescens observeret ved den forudsagte molekylvægt på 22 kDa for prøve LN-5 aECM og 24 kDa for prøve Col-IV aECM repræsenterer 6x His-mærke til stede i det rensede protein.
| Medier / L | Komponenter og instruktioner |
| SOC medier | 20 g Trypton |
| 5 g gærekstrakt | |
| 0,6 g NaCl | |
| 0,2 g KCI | |
| Tilføj og autoklave i 940 ml vand, | |
| derefter tilføje sterile (filtersteriliseret) | |
| 10 ml 1 M MgCl2 | |
| 10 ml 1 M MgSO4 | |
| 40 ml 20% glucose | |
| 16 g trypton | |
| 10 g gærekstrakt | |
| 5 g NaCl | |
| 15 g Bacto Agar (tilsætning kun for agarplade) | |
| Opløses i vand, og top op til 1 L og autoklave. | |
| For at fremstille agarplader, afkøl til 55 ° C før tilsætning af antibiotika. | |
| Bland godt før hælde i petriskål. | |
| Køle pladerne indtil agar størknet. | |
| Wrap plader i Parafilm og gemme hovedet i 4 ° C. | |
| Terrific Broth (TB) | 12 g trypton |
| 24 g gærekstrakt | |
| 4 ml Glycerol | |
| Opløses i 700 ml vand og autoklaver. | |
| 16,42 g K 2 HPO 4(Merck) | |
| 2,31 g KH 2 PO 4 (Merck) | |
| Opløses i 300 ml vand og autoklaver separat, for at sikre salte er helt opløst. | |
| Kombinere både medium og salte efter afkøling. |
Tabel 1. Opskrifter til SOC medier, 2xYT media / agar og Terrific Broth. Media for E. coli kultur, der anvendes i molekylær kloning og proteinekspression.
| Løsning / L | Komponenter og instruktioner |
| Coomassie Brilliant Blue farvning | 0,25 g Coomassie blueR250 |
| 100 ml iseddike | |
| 450 ml methylalkohol | |
| 450 ml vand | |
| 100 ml iseddike | |
| 400 ml methylalkohol | |
| 500 ml vand |
Tabel 2. Opskrifter til løsninger til at plette og affarvning SDS-PAGE-gel. Coomassie Brilliant Blue R250 for farvning og en Affarvningsopløsningen til karakterisering under anvendelse af SDS-PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rekombinant protein engineering er en alsidig teknik til at skabe nye proteinmaterialer ved hjælp af en bottom-up-tilgang. De proteinbaserede materialer kan udformes til at have flere funktionaliteter, som er skræddersyet i overensstemmelse med anvendelsen af interesse. På grund af stigende fremgang i klonings- og protein udtryk teknologier, er det blevet relativt enkle (og omkostningseffektiv) for at skabe en række kunstige proteiner på en reproducerbar og skalerbar måde. Elastin-lignende domæne er blevet indarbejdet i en række kunstige proteiner, som skal fungere som en rensning tag, samt at bibringe mekaniske egenskaber. Kunstige proteiner, der indeholder en elastin-lignende sekvens kan let oprenses ved hjælp af ITC, hvilket eliminerer behovet for dyre rensning kolonner og antistoffer.
Denne protokol beskriver de skridt til at konstruere rekombinante plasmider kodende for aECM proteiner. Gener, der koder for elastin-lignende gentagelser blev købt. Tilhøjrepetitivt peptidsekvens som elastin lignende polypeptider, anbefales det at udforme kloningsstrategien således at rekursive retningsbestemt ligering (RDL) strategier kan anvendes 22. Ved at bruge RDL, kunne gentagne polypeptider med en specifik kædelængde syntetiseres, og derfor gener af interesse kan købes som korte monomerer.
I vores arbejde blev de cellebindende domæner udformet til at indeholde flankerende Nhel restriktionssteder i begge ender til at tillade modulær swapping af den centrale cellebindende domæne. Det er vigtigt at vælge restriktionssteder, der er unikke og ikke er til stede i det funktionelle domæne eller andre steder uden for kloningsstedet (MCS) multiplum af værtsvektoren. Dette er for at begrænse fordøjelse af insertet eller vektor til de tilsigtede steder. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at indføre nye restriktionssteder i værtsvektoren hjælp mutagenese før indsættelse af den funktionelle domæne.
Voreskloningsstrategi tilladt os at let ændre den centrale cellebindende domæne til opnåelse tre varianter af aECM proteiner. Vi bemærkede også, at indsætte en lysinrest efter start Methionin øget proteinindhold med mere end 10-fold. Denne dramatiske stigning i proteinudbytte var mest tydelig med LN-5 aECM proteinet, hvor den endelige protein udbyttet steg fra 5 mg / l til 60 mg / l.
Forskellige E. coli ekspressionsværter blev sammenlignet, og BL21 (DE3) pLysS E. coli-stamme gav de bedste proteinudbytter. Forbedringen i udbytte af protein var minimal, da protein blev induceret med IPTG i mere end 4 timer. Der var ingen signifikant forskel i proteinekspression ved IPTG koncentrationer på mere end 1 mM. Dog proteinekspression var den højeste når induceret ved OD tættere på 0,6.
Til effektiv genvinding af aECM proteiner under anvendelse ITC, er det vigtigt at bemærke temperaturen af centrifugen. For eksamenple, de fleste af de oprensningstrin blev udført i et koldt rum (4 ° C) for at sikre maksimal opløselighed af aECM proteiner. Det kan også være nødvendigt at pre-chill til (4 ° C) i centrifugerotoren O / N forud for kold cyklus. Ligeledes centrifugerotoren var forvarmet til (37 ° C) før den varme cyklus for at sikre, at temperaturen af proteinopløsningen blev opretholdt over dens T t.
Sammenfattende er de procedurer designe og klone rekombinante plasmider kodende kunstige ECM proteiner er beskrevet. Især er det ekspression og oprensning af de aECM proteiner ved hjælp ITC skitseret. Endelig blev karakterisering af aECM proteiner under anvendelse af SDS-PAGE-elektroforese og Western Blotting beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende støtte fra Undervisningsministeriet AcRF Tier 1 (RG41) og opstart bevilling fra Nanyang Technological University. Lav og Tjin finansieres af Research Student Scholarship (RSS) fra Nanyang Technological University, Singapore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET22b (+) | Novagen | 69744 | T7 expression vectors with resistance to ampicillin |
| BL21(DE3)pLysS | Invitrogen | C6060-03 | additional antibiotics - chloramphenicol |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction. |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | plasmid isolation kit |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Ampicillin | Affymetrix | 11259 | |
| Chloramphenicol | Affymetrix | 23660 | |
| Zymoclean™ gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | |
| XL10-gold strain | Agilent Technologies | 200315 |
References
- Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. Elastomeric biomaterials for tissue engineering. Prog Polym Sci. 38 (3-4), 584-671 (2013).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 352-366 (2011).
- Kushner, A. M., Guan, Z. Modular Design in Natural and Biomimetic Soft Materials. Angewandte Chemie International Edition. 50 (39), 9026-9057 (2011).
- Gagner, J. E., Kim, W., Chaikof, E. L. Designing protein-based biomaterials for medical applications. Acta Biomater. 10 (4), 1542-1557 (2014).
- Gomes, S., Leonor, I. B., Mano, J. F., Reis, R. L., Kaplan, D. L. Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering. Prog Polym Sci. 37 (1), 1-17 (2012).
- Werkmeister, J. A., Ramshaw, J. A. M. Recombinant protein scaffolds for tissue engineering. Biomedical Materials. 7 (1), 012002 (2012).
- MacNeil, S. Biomaterials for tissue engineering of skin. Materials Today. 11 (5), 26-35 (2008).
- Fong, E., Tirrell, D. A. Collective Cell Migration on Artificial Extracellular Matrix Proteins Containing Full-Length Fibronectin Domains. Advanced Materials. 22 (46), 5271-5275 (2010).
- Ratner, B. D., Bryant, S. J. BIOMATERIALS: Where We Have Been and Where We are Going. Annual Review of Biomedical Engineering. 6 (1), 41-75 (2004).
- Cai, L., Heilshorn, S. C. Designing ECM-mimetic materials using protein engineering. Acta Biomater. 10 (4), 1751-1760 (2014).
- Annabi, N., et al. Elastomeric recombinant protein-based biomaterials. Biochemical Engineering Journal. 77 (0), 110-118 (2013).
- Heilshorn, S. C., DiZio, K. A., Welsh, E. R., Tirrell, D. A. Endothelial cell adhesion to the fibronectin CS5 domain in artificial extracellular matrix proteins. Biomaterials. 24 (23), 4245-4252 (2003).
- Simnick, A. J., Lim, D. W., Chow, D., Chilkoti, A. Biomedical and Biotechnological Applications of Elastin-Like Polypeptides. Polymer Reviews. 47 (1), 121-154 (2007).
- Tjin, M. S., Chua, A. W. C., Ma, D. R., Lee, S. T., Fong, E. Human Epidermal Keratinocyte Cell Response on Integrin-Specific Artificial Extracellular Matrix Proteins. Macromolecular Bioscience. 14 (8), 1125-1134 (2014).
- MacNeil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Kariya, Y., et al. Differential regulation of cellular adhesion and migration by recombinant laminin-5 forms with partial deletion or mutation within the G3 domain of α3 chain. J Cell Biochem. 88 (3), 506-520 (2003).
- Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., Quaranta, V. The LG3 module of laminin-5 harbors a binding site for integrin α3Β1 that promotes cell adhesion, spreading, and migration. J Biol Chem. 276 (35), 33045-33053 (2001).
- Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Current Protocols in Protein Science. , 6.11.1-6.11.16 (2010).
- Keeley, F. Ch. 4. Evolution of Extracellular Matrix.Biology of Extracellular Matrix. , Springer. Berlin Heidelberg. 73-119 (2013).
- Le, D. H. T., et al. Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides. Biomacromolecules. 14 (4), 1028-1034 (2013).
- MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583 (2014).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
