Protocol
AECM Proteinler için rekombinant kodlayan plazmidlerin yapılması Vektör 1. Klonlama
- Fonksyonel (örneğin, hücre bağlama alanı ve elastin-benzeri tekrarlar) amino asit dizisini tasarımı. Fonksiyonel etki uçlarını yan Tasarım kısıtlama siteleri alt klonlama yazılımı talimatlarına göre özgür yazılım kullanarak (örn http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/) kolaylaştırmak için. Burada, planlanan bölgelere sindirimi sınırlandırmak için işlevsel bir etki mevcut değildir tek bir sınırlandırma bölgesine seçin. Çoklu klonlama yerinin ana vektörün (MCS) görünür kısıtlama bölgelerini seç (örn, pET22b (+)) alt-klonlama için.
- Yazılım talimatlarına göre ücretsiz web sitelerini kullanarak nükleotid dizisi içine amino asit dizisini çevirmek Ters. (Örneğin, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Emin olun kodonları E. için optimize edilmiştir E. coli ana.
- Ilgi Gen purchas olabilired, ticari olarak, tek sarmal kollu oligonükleotitlere, ve DNA tavlama yerine (oligonükleotidler <100 baz çifti (bp) ise, yani,) (adım 1.4) maliyetini azaltmak için. Aksi takdirde, 100 bp daha büyük genler için, onlar ticari şirketler aracılığıyla satın alınabilir.
- Oligonükleotidlerin DNA tavlama
- Istenen gen sekansı elde etmek için, DNA oligomerleri yeniden birleşir. 1 ug / ul nihai konsantrasyona (süzüldü, 2-amino-2- (hidroksimetil) -propan-1,3-diol, pH 8.0, 10 mM Tris), bir DNA oligomeri tamponu DNA oligonükleotidleri çözülür.
- Toplam 40 ul karışım elde etmek için, DNA bağlanma tamponu 32 ul (10 mM Tris, 100 mM NaCI, 100 nM MgCl2), her bir oligomerin 4 ul ekleyin.
- Bir ocak gözünü kullanılarak suyun beher kaynatılır ve 5 dakika, 95 ° C'de karışım bırakın. Beher çıkarın ve yavaş yavaş strafor kutu O / N kurmak bütününü serin. oligomerleri tavlanmış ve sindirim hazır edilmiştir.
Not: pET22b (+) plazmid vektörü ampisilin antibiyotiklere dirençli ve C-termininde bir 6x-His etiketi içerir. PET22b (+) mevcut 6x-His etiketi 7. adımda western blotting ile hedef proteini tanımlamak için His-etiketli antikorlar kullanmamızı sağlar. - Her sindirim karışımı 6x yükleme boyası ekleyin. Ayrıca 100 V Visualize bir UV ışık ışığı ile% 1.2 DNA, agaroz jel, 1 saat boyunca bir UV floresan DNA leke ihtiva eden% 1.2 agaroz jelleri üzerinde, DNA, bir DNA merdiveni de dahil olmak üzere sindirim karışımları çalıştırın.
- Ticari jel arıtma kitleri kullanılarak sindirilmiş DNA ürünleri ayıklamak için jel dilimleyin. Elute 50-100 ng / ul arasında en az bir DNA konsantrasyonu elde etmek için sütun için minimum hacim kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
- Sindirilmiş DNA inserti bağlanarak İlgi sırasıyla geni birleştirin (örneğin, DNA, tavlama ile elde elastin tekrarlar ya da hücre bağlama alanları), aşağıdaki tarifi kullanarak, T4 ligaz kullanılarak plazmid vektörüne (vektör 2 ul T4 ligaz 1 ul, T4 ligasyon tampon maddesi, x, ul ilavenin, 1.5 ul, toplam 15 ul karışım 10.5-X ul su). 2 saat boyunca oda sıcaklığında Ligasyon karışımı inkübe edin.
Not: ekleme vektörün molar konsantrasyonu ligasyonu verimliliğini optimize etmek üzere, çeşitlendirilebilir gerekir. Tarifte X olarak adlandırılan parçanın hacmi adım 1.7 taşınan bir DNA konsantrasyonuna bağlıdır. - Çözülme E. E. coli DH5α kimyasal olarak kompetan hücreler (veya herhangi bir klonlama suşu) buz üzerinde. Sıcak eden 2xYT agar plakaları ampisilin (25 ug / ml) ihtiva eden (Tablo 1) 37 ° C arasındadır.
- Kullanılarak hücrelerini dönüştürmekısı şoku:
- Kısım, temiz, önceden soğutulmuş mikro santrifüj tüplerine yetkin hücre 50 ul. Pipet 5 ul hücre içine ligasyon karışımının (100 ug ng ila 100 arası), pipetleme hafifçe yukarı ve aşağı karıştırın. 20 dakika boyunca buz karışımı bırakın.
- 2 dakika için 42 ° C su banyosu içinde hücre karışımı ihtiva eden mikro santrifüj tüpü daldırın ve 2 dakika süreyle buz üzerinde döndü. Hücrelere ısı hasarı en aza indirmek için daldırma süresini zaman.
- Mikro santrifüj tüpüne SOC ortamı (Tablo 1) 500 ul ilave edin ve 1 saat boyunca çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin.
- Ampisilin (25 ug / ml) ihtiva eden, oda sıcaklığına önceden ısıtılmış olan bir 2xYT agar plakası üzerine hücre / ligasyon karışımı 50 500 ul yayın ve plakalar 37 ° CO de baş aşağı inkübe / N (12-16 saat) .
- Ertesi gün, temiz pipet uçları kullanılarak agar plakasından DNA kolonileri seçin. (Tablo 2YT ortam 5 ml koloniler büyütün1) ihtiva eden ampisilin (25 ug / ml), O / N) çalkalanarak (225 rpm, 37 ° CO / N- (12-16 saat).
- Ertesi gün, üreticinin protokolüne uygun olarak aldı her koloninin için DNA plazmidleri elde etmek için bir plazmid izolasyon kiti kullanmak. Su, 50 ul DNA Zehir.
- 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edin (5 ul DNA, her biri, sınır enzimi 0.2 ul, toplam 10 ul karışım için 1 ul 10x sınırlayıcı enzim tamponu ve üst kadar su): Bir test, aşağıdaki tarifi kullanarak sınır enzimleri ile sindirmek gerçekleştirme büyük olasılıkla adım 1.6 olarak% 1.2 DNA agaroz jel üzerinde insert ve koşmak ihtiva sömürgeler için ekrana.
NOT: sindirimi üzerine başarılı bir ligasyon gereken iki grup, vektör ve bunların ilgili molekül ağırlığına karşılık gelen insert (Şekil 1) için bir tane, her sonuçlanır. - Ileri T7 promotör kullanılarak DNA dizileme için olası koloniler Gönder ve ticari sequencer için primerler ters.
- Sıralama sonucu itibaren başarıyla bağlandı edilmiş bir koloni seçin ve bir E. dönüşüm için DNA plazmid kullanmak E. coli ekspresyon konakçı.
- Çözülme E. E. coli sentezleme türü buz üzerinde (BL21 (DE3) pLysS). Bu sırada, oda sıcaklığına kadar, ampisilin (25 ug / ml) ve kloramfenikol (34 ug / ml) ihtiva eden sıcak bir agar plakaları.
Not: Bakteri içinde mevcut pLysS plasmidi BL21 (DE3) pLysS, bir kloramfenikol direnç genini ihtiva süzün. pLysS plazmid konstitütif aECM proteininin sızıntılı ekspresyonunu sınırlamak için ifade edilen bir T7 represör geni içermektedir. Kloramfenikol kültür sırasında pLysS içeren bakteri hücreleri seçmek gereklidir. - Adımı yineleyin 1.10 E. dönüştürülmüştür olarak ulaşmak için Yapay proteinleri ifade hazırız coli hücreleri. Parafilm agar plakaları sarın ve 4 baş aşağı saklamak 6; bir ay kadar C.
AECM Proteinlerin 3. Bakteriyel ekspresyon
- , Şekil 2, bir pipet ile transforme agar plakasından bir koloni çekme ve steril Terrific Broth (TB) ortam bir test tüpü içinde ampisilin ve kloramfenikol antibiyotik hem de ihtiva eden (Tablo 1) 10 ml inoküle bakınız. 225 rpm'de çalkalanarak 37 ° de CO / N- (12-16 saat), bu başlatıcı kültür inkübe edin.
- Transfer 3 L'lik Erlenmeyen şişesi aynı antibiyotik ile takviye edilmiş 1 L'lik, taze ve steril TBC ortamı içine başlatıcı kültür 10 mi. 2-3 saat boyunca 225 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de kültür inkübe ve kültür (OD 600), optik yoğunluğunu dikkate okuma için boş bir küvetin içine kültürün 1 ml pipetleme 0,6-0,8 ulaşmıştır. Önceden SDS-PAGE karakterizasyonu için indüksiyon kültürün 1 ml'sinin kaydedin.
- Hücre kültürü OD 600 ölçmek için, bir küvet TB medya 1 flakon hazırlamakBoş bir ölçüm için. Ayrı olarak, bir yeni, boş bir küvet içinde kültür şişesi kültür 1 ml aktarın. 600 nm 'lik bir emişteki boş kontrol karşı bir spektrofotometre kullanılarak kültür optik yoğunluk ölçülür.
- 2 dakika için 12,000 x g'de bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü, santrifüje kültür numune 1 ml aktararak (daha sonra, SDS-PAGE analizi için) örnek kaydedin ve süpernatant süzün.
- 1 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile kültür neden ve başka bir 4 saat boyunca 225 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin. SDS-PAGE karakterizasyonu için 4 saat sonra indüksiyon sonunda kültür 1 ml kaydedin.
- 4 ° C'de 30 dakika boyunca 12,000 xg'de 1 L'lik bir santrifüj şişeleri ve santrifüj kültürünün aktararak hücreleri hasat. Ug / ml 0.5 (pH = 8.0, 1 M Tris, 0.01 M EDTA, 0.1 M NaCl), süpernatant atılır TEN tamponu içinde hücre pelletleri ve tekrar süspansiyon tartın.
Bakteriyel Kültürlerin 4. Liziz
- -80 ° CO / N de yeniden askıya hücre kültürü dondurun. Hücreleri lize etmek için, oda sıcaklığında veya buz üzerinde bir su banyosu içinde dondurulmuş hücre kültürü çözülme. Cozundururken 10 ug / ml Deoksiribonükleaz I (DNase I), 10 ug / ml ribonükleaz A (RNaz I) 'in ve 50 ug / ml fenilmetilsülfonil florid (PMSF) ilave edin ve yavaş karıştırma ile çözelti homojenleştirilir.
- Tüm yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler çözündürüldü sonra, su 12 içerisindeki protein çözünürlüğünü artırmak için, pH 9.0 çözeltisi ayarlayın. Homojen bir kıvam elde etmek için buz üzerinde karıştırılarak akıllıca 6 N NaOH damla ekleyin. 2 mm çapında yassı uç, 5 sn darbe kullanılarak buz üzerinde 20 dakika boyunca ultrasonik parçalama ile lizleyin.
- 4 ° C'de 30 dakika boyunca 12,000 x g'de hücre çözümü santrifüjleyin. Daha sonra saflaştırma için 4 ° C sıcaklıkta, bir temiz, boş bir şişe ve mağaza süpernatant aktarın.
- Bu arada, -80 ° C TEN tamponu ve yeniden dondurma ile tekrar hücre pelletini. Içinüç kez tam hücre parçalama, tekrar donma / çözülme ve sonication süreci kadar. SDS-PAGE karakterizasyonu için 20 ul hücre lizatı kaydedin.
Ters Geçiş Bisiklet kullanarak aECM Proteinlerin 5. saflaştırılması
- Aşama 4.3 hücre lizatı harmanlayın ve elastin tabanlı proteinler 21 saflaştırılması için kullanılana benzer ITC kullanılarak aECM proteinlerini saflaştırmak için devam edin. Döngüleri 4 ° C olan, farklı sıcaklıklarda yapılabilir ve 37 ° C ("soğuk" olarak anılacaktır), sırasıyla devir ("sıcak" olarak anılacaktır).
- 4 ° C'de 2 saat süre ile 40.000 x g, hücre 50 ml'lik santrifüj şişeler içine lizat ve santrifüj Böl. Hücre pelet görünümü koyu kahverengi olmalı ve akıntısı görünmelidir.
- Pelet temiz bir ayrılık almak için pipetleme süpernatantı. Temiz santrifüj şişelerine supernatant toplamak ve (3 M maksimum) 1 M bir son konsantrasyona kadar NaCl ilave edin. Sıcak225 rpm'de çalkalanarak, 2 saat boyunca 37 ° C'ye kadar bir çözüm.
NOT: NaCl ilavesi aECM neden agregasyon elastin bileşeninin geçişi tetikler. süpernatant bulanık dönecek. Protein konsantrasyonu yeterince yüksek olduğunda, beyaz köpüklü bir proteini santrifüj şişenin yanlarında görülebilir. - 37 ° C 'de 2 saat süre ile 40,000 x g de aşama 5.3 süpernatant santrifüjleyin. Süpernatant Durusu. Metal bir spatula kullanılarak pelet ezmek ve manyetik bir karıştırma çubuğu ve plaka kullanılarak 4 ° C'de kuvvetli karıştırma O / N buz soğukluğunda otoklava damıtılmış su içinde pelet bitleri (50 mg / ml) yeniden süspanse edin. Pelet tamamen çözündürülmelidir.
- Tekrarlayın protein yüksek saflıkta elde etmek için 5.2 başka 3-5 kez 5.4 adımları.
- Saflaştırılmadan son çevriminden sonra, 4 ° C sıcaklıkta bulunan damıtılmış suyun karşı diyaliz protein çözeltisi desalt. Su, her 4 değişikliklerle 2-3 gün suya karşı protein çözeltisi Dialyzesaat ya da O / N 8 saat. SDS-PAGE için saflaştırılmış protein 20 ul kaydedin ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de saflaştırılmış protein ve mağaza geri kalanı liyofilize.
SDS-PAGE elektroforezi kullanılarak aECM Proteinlerin 6. Karakterizasyonu
- (Moleküler ağırlığı büyük ise, daha iyi bir ayrılması için% 8 SDS-PAGE jellerinin kullanın), bir% 12 SDS-PAGE jeli hazırlayın. , Her bir örnek için 2 x SDS yükleme tamponu ekleyin ısı örnekleri 10 dakika boyunca 100 ° C 'de ve çalışma örnekleri jel üzerinde, 1 saat boyunca 100 V'ta ya aECM proteininin molekül ağırlığına tekabül eden bir protein merdiveni orta ulaşıncaya kadar Jel.
- Ayarlamak SDS-PAGE jelin almak ve bir Petri kabı içinde, 1 saat boyunca jel daldırın bir hacmi ile Coomassie Parlak Mavi leke (Tablo 2) ekleyin. Bir rocker 5 dakika boyunca bir destaining solüsyonu (Tablo 2) durulayın jel. Destaining çözümü değiştirin ve t arka kadar sallanan ile jel destain devamO Jel netleşiyor. Protein bantları açıkça görünür olmalıdır.
- Hedef proteinin moleküler ağırlığı belirlemek için, protein merdiveni karşı hedef proteinin konumunu Karşılaştırması.
- Bundan başka, hedef proteinin varlığını teyit etmek için, aşama 7'deki gibi Batı blotting işleminin gerçekleştirilmesi.
Western Blot kullanarak aECM Proteinlerin 7. Karakterizasyon
- Bir boyama yöntemi ile, Bölüm 6 'daki gibi bir% 12 SDS-PAGE jeli üzerinde örnekleri çalıştırın.
- SDS-PAGE jeli biraz daha büyük bir boyuta nitroselüloz zar kesilir. Aynı boyuta filtre kağıdı 4 adet kesin.
- Western transfer tamponuna filtre kağıdı ıslak bir parça (% 20 h / h metanol, 25 mM Tris, 190 mM glisin, pH 8.3), filtre kağıdı bir parça ile, ardından filtre kağıdı üstüne SDS-PAGE jeli, yer daha sonra nitroselüloz zara aktarıldı ve filtre kağıdı nihai Diğer iki adettir. Emin olun, tüm set-up yeterli batı aktarım tamponu ile batık.
Not: proteinler temas üzerine membrana bağlanan olabilir gibi jel ve membran zaman bu noktada temas etmemesi gerekmektedir. - Nitroselüloz zar, ardından bir Batı yarı kuru bir transfer ünitesinin içine iki filtre kağıtları yerleştirerek nitroselüloz zar üzerine transfer proteinleri ve dikkatli bir mesafede olan ve membran üzerinde SDS-PAGE jel yer son olarak son iki ıslak filtre kağıdı yer SDS-PAGE jeli. 45 mA, 30 dakika batı transferi çalıştırın. Voltaj daha yüksek 30 V ise tampon ekle
Not: Tercihen bir girişimde membran üzerinde SDS-PAGE jeli yerleştirmek ve proteinler temas üzerine membrana bağlanan olabilir gibi zar üzerinde gereksiz jel çevrilmesini önlemek. - Al ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca (filtre kağıdı ile filtre edildi, PBS pH 7.4 içinde% 5 yağsız süt) çözeltisi bloke ile nitroselüloz zarı bloke eder. Tampon engelleme atınız ve durulama PBS ekleyin.
NOT: Yeni eldiven değiştirin istenmeyen prote ile membran kirletmesini önlemek içinins. - 1 PBS içinde seyreltme ile birincil anti-His antikoru inkübe: 1000, oda sıcaklığında 1 saat boyunca çalkalanarak. 1000 antikoru 1 ul (stok konsantrasyonu: 1 mg / ml) ekleyin: seyreltme oranı 1, örneğin, tüm membran daldırın olabilecek bir hacimde bir karışım hazırlayın, bir 1 ml toplam karışım için 999 ul PBS.
- (% 0.1 Tween 20 ile PBS) PBST 5 ml zar yıkayın.
- 1 PBS içinde seyreltilmesi ile bayırturpu peroksidaz (HRP) konjuge edilmiş ikincil antikor ile inkübe: 5000, oda sıcaklığında 1 saat boyunca çalkalanarak. 5000 antikoru 1 ul (stok konsantrasyonu: 1 mg / ml) ekleyin: seyreltme oranı 1, örneğin, tüm membran daldırın olabilecek bir hacimde bir karışım hazırlayın, 5 ml toplam karışım için 4999 ul PBS.
- PBST 5 ml zar yıkanır ve iki kez tekrarlayın.
- Membran kapak ve kullanılan alt tabaka için yönergeleri izleyerek inkübe hacmi zara kemilüminesan substrat uygulayın.
NOT: Protein tespiti için alt tabakanın hassasiyeti değişebilir, biz sinyallerini artmaz antikor konsantrasyonunu arttırarak olay çok düşük sinyaller için azami hassasiyet ile bir alt tabaka öneririz. - Bir CCD kamera tabanlı görüntüleyici kullanarak chemiluminescent sinyalleri yakalayın. Sinyallerin zayıf ve non-spesifik olup olmadığını birincil ve ikincil antikor seyreltme oranını ayarlayın. Arka sinyal yüksek ise çözümü engelleme uzun kuluçkaya yatmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elastin benzeri tekrarları içeren füzyon proteinleri tasarımında, genel bir elastin içeriğini, füzyon proteininin 18 arasında yeterince büyük bir kısmını muhafaza etmek önemlidir. Bu füzyon proteini yapısı saflaştırılması için ITC kullanmak için, onun elastin gibi özelliklerini muhafaza sağlamaktır. aECM proteinleri tasarımı ve bu bölümde tarif edilen sekanslar, özel olarak Tjin ve ark., 14 tarafından gerçekleştirilen çalışmadan alınmıştır. Bu çalışmada, üç aECM proteinleri başarıyla pET22b (+) sentezleme vektörü içine klonlandı. Sıralı ligasyonu ilk elastin tekrarlar hücre bağlama alanını takarak takip pET vektörü, takın bağlanması ile başladı. Nihayet elastin tekrarların son seti aynı yöntemi kullanarak hücre bağlayıcı etki terminal ucunda yerleştirildi. Rekombinant genler başarılı bir şekilde inşa edilmiş olup olmadığını doğrulamak için, her rekombinant plasmid testi 37 ° 'de 3 saat süre ile, XhoI ve SalI ile sindirilmişC. Şekil 1 testi sindirim sonra DNA eki ve vektör bantlarını gösterir. AECM proteinlerinin her biri için, insert boyutu klonlama gerçekten de başarılı olduğunu teyit genin boyutuna karşılık geldi. DNA dizilimi sayesinde daha ileri doğrulama da sınav sindirim sonuçlarını doğruladı.
Her aECM protein ITC verilen yeterli elastin içeriği mevcut aracılığıyla aECM proteinleri saflaştırmak için başardık. 2, genel arıtma işleminin şematik göstermektedir. O / N kültürü tipik bir başlangıç OD 0.01, 600 1 L sallama şişesi içinde aşılanmıştır. Kültür 3-4 saat sonra 0,6-0,8 arasında OD 600 büyüdü. Protein ifadesi, IPTG 1mM kullanılarak indüklendi. 4 saat sonra, 1.5, tipik OD elde edilir. Bakteri kültürü toplandı ve santrifüje tabi tutuldu. Süpernatan atıldı ve hücre topağı tartılmıştır. Hücre topağı ortalama ağırlığı yaklaşık 3 g / L,kültür. Topak TEN tamponu içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve -80 ° CO / H de donduruldu.
Donma / erime devirine bir dizi hücreleri lize etmek için kullanıldı. dondurma-çözme adımı kabarma ve sonuçta dondurma işlemi sırasında oluşan buz kristalleri nedeniyle kırılma, küçültmek için hücre neden olur. Daha sonra, DNase I ve RNaz tüm DNA ve RNA sindirimi hücre lizatı ilave edildi. PMSF, aynı zamanda protein degradasyonunu minimize etmek için, hücre lisatı ilave edildi, bir proteaz inhibitörüdür. Daha tam bir hücre parçalama sağlamak için, lizat daha sonike edilirken buz üzerinde tutuldu.
Hücre lizatı sonra ITC arıtılmadan 3 döngüsüne tabi tutulmuştur. 3 döngü sonunda, sıcak döngü sonunda pelet tutarlılık bal andıran ve hafif sarı bir renk vardı. Pelet, su ile temas üzerine şeffaf bir açık ve kolayca çalkalanarak önceden soğutulmuş otoklava su içinde çözülmüştür. Saflaştırılmış protein herhangi bir kalıntı s uzaklaştırmak için diyaliz ediliralt. Nihai sıcak döngüsünün sonunda elde edilen protein çözeltisi diyaliz tübü kısa bir uzunlukta transfer edildi (12 kDa moleküler ağırlığa sahip olan kesme). Diyaliz sonunda, protein çözeltisi, temiz 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarıldı ve -20 ° C'de dondurulur. Ertesi gün, dondurulmuş protein çözeltisi su içeriğini çıkarmak için liyofilize edilir. Tipik bir yün benzeri bir görünüme sahip, 3 diyaliz proteinin bir görüntüsünü göstermektedir.
İndüksiyon SDS-PAGE elektroforezi ile analiz edildikten sonra, protein sentezleme gerçekten de bağlı olup olmadığını belirlemek için, numuneler önce toplanan ve. Burada,% 12 SDS-PAGE jeli 20-150 kDa molekül ağırlığına sahip proteinlerin ayrılması için yeterli olmuştur. Moleküler ağırlık, yani,> 100 kDa,% 8 SDS-PAGE jelleri iyi protein ayırma için kullanılabilecek büyük olması halinde., Şekil 4 'bağlı sa tahmin edilen molekül ağırlığı ile yoğun bir protein bandı gösterirmple (şerit 2). Saflaştırma başlamadan önce, tipik olarak, SDS-PAGE analizi, protein ekspresyonu hemen sonra uygulandı. Daha sonra, örnekler. Aynı zamanda hedef proteinin etkin bir şekilde saflaştırılmasını sağlamak için SDS-PAGE elektroforezi ile analiz edilebilir saflaştırma işlemi boyunca alınan, Şekil 4 'de 22 kDa'lık (kulvar 4 arasında bir molekül ağırlığına sahip saflaştırılmış bir protein, örneği ihtiva eden bir SDS-PAGE jeli gösterir ), LN-5 aECM 14 karşılık gelir. aECM proteinlerinin tahmini saflık% 90 -95% idi; Bu değer, hedef protein ve SDS jel (Şekil 4, kulvar 4) üzerinde bulunan diğer protein bantlarının bant yoğunluklarına oranlarını karşılaştırılması ile elde edilmiştir. Saflaştırılmış protein gerçekten aECM proteinleri ise Son olarak, belirlemek için, batı lekeleme gerçekleştirildi. Daha sonra, MALDI-TOF da 5 Şekil. Doğru saf malzeme 14 kirlilik içeriğini belirlemek için yapılan th protein saflık gösterir olduŞekil 5A'da, bir SDS-PAGE jeli ile hedef proteinler Col-IV aECM LN-5 aECM varlığını gösteren, Şekil 5B'de western blot, nitroselüloz zarın bir görüntü karşılaştırmak için E üç aECM proteinleri anti kullanarak etiketlendi At turpu peroksidaz (HRP) ile konjüge edilmiş His-tag antikoru -6x. aECM proteinlerin son verimi 120 mg / L ila 60 mg / L arasında değişmektedir.
AECM proteinlerinin Şekil 1. DNA agaroz jel elektroforez. DNA kısıtlama yoluyla inşa Doğrulama nihai aECM proteininin sindirimi% 1.2 DNA agaroz jel üzerinde koştu enzimleri. AECM proteinlerinin her biri için kodlayan rekombinan plazmidler, çift 37 ° C'da 3 st için XhoI ve SalI ile sindirildi insertlerin boyutları her aECM protein geninin boyutuna karşılık gelir (FN910: 1.8kbp, Col-IV: 696 bp, LN-5: 699 bp) ve kullanılan vektörün büyüklüğü pET22b (+) 5.5 kbp olduğunu.
AECM proteinlerinin protein ifadesi, lizis ve saflaştırma Şekil 2. şematik akış. Rekombinant protein ifadesi için temel rehber, küçük kültürüne tek koloni aşılamadan başlayıp 1 L hücre kültürü, hasat ve yeniden süspansiyon haline getirilmesi büyütmek, Protein liziz eklenmiştir. Protein saflaştırma yapay ECM proteinleri içinde mevcut elastin gibi etki LCST'nin davranışını kullanılarak gerçekleştirilmiştir. aECM proteinleri ITC ile saflaştırılır. Birden çok sıcak ve soğuk döngüleri hedef proteinin yüksek saflık elde etmek için yapıldı. Son olarak, hedef protein, su ile diyaliz edilir ve sonraki kullanıma kadar liyofilize edildi. = Gecede "O / N". "S / n" = süpernatant.
Ters Geçiş Bisiklet. Liyofilize LN5-aECM ile saflaştırılmış liyofilize aECM proteininin Şekil 3. Image yün benzeri bir görünüme sahiptir.
AECM protein (LN-5 aECM) Şekil 4., SDS-PAGE jel elektroforezi. Şerit 1 ve 2, önceki ve proteinin indüksiyonundan sonra kültür gösterir. 22 kDa'lık yakınındaki kalın bandının varlığını LN-5 aECM başarılı bir şekilde ifade edildiğini göstermektedir. Şerit 4 ITC 3 turdan sonra saflaştırılmış LN-5 aECM proteini gösterirken Şerit 3 tam hücre lizat gösterir.
AECM proteinlerinin Şekil 5. (A) SDS-PAGE jeli. (B) Col için His-tag 6x için problanan Western BlotIV ve LN-5 aECM proteinleri. Hem Col-IV LN-5 aECM proteinleri C-terminali 6xHis-etiketi ihtiva eder. Saflaştırılmış protein içinde mevcut 6x His-tag temsil eden örnek Col-IV aECM örnek LN-5 aECM 24 kDa için 22 kDa tahmin edilen molekül ağırlığı ile gözlemlenen pozitif kemilüminesans.
| Medya / L | Bileşenler ve talimatlar |
| SOC ortamı | 20 g Tripton |
| 5 g maya hülasası | |
| 0.6 g NaCI | |
| 0.2 g KCI | |
| 940 ml su ekleyin ve otoklav, | |
| daha sonra steril (filtre sterilize) ekleyin | |
| 10 ml 1 M MgCI2 | |
| 10 ml 1 M MgSO 4 | |
| 40 ml% 20 glukoz | |
| 16 gr Tripton | |
| 10 g maya özütü | |
| 5 g NaCI | |
| 15 g Bacto Agar (sadece agar plakası için ek) | |
| Suda çözülür ve 1 L ve otoklav için kontör. | |
| 55 serin agar plakaları hazırlamak için, Antibiyotik ilave edilmeden önce ° C. | |
| Petri kabındaki dökülmesinden önce iyice karıştırın. | |
| Agar katılaşan kadar plakaları soğutun. | |
| Parafilm tabak sarın ve 4 baş aşağı saklamak ° C. | |
| Müthiş Broth (TB) | 12 g Tripton |
| 24 g maya özütü | |
| 4 mi Gliserol | |
| 700 mi su ve otoklav içinde çözülür. | |
| 16.42 g K 2 HPO 4(Merck) | |
| 2.31 gr KH 2 PO 4 (Merck) | |
| Sağlamak için, 300 ml su içinde çözülür ve ayrı olarak otoklava tuzlan tamamen çözülür. | |
| Soğutulduktan sonra orta ve tuzları hem de bir araya getirin. |
Tablo E. için SOC medya, 2xYT medya / agar ve müthiş Broth. Medya için 1. Tarifler E. coli kültürü, moleküler klonlama ve protein ekspresyonu kullanılmıştır.
| Çözüm / L | Bileşenler ve talimatlar |
| Coomassie Parlak Mavi leke | 0.25 gr, Coomassie blueR250 |
| 100 ml buzlu asetik asit | |
| 450 mi metil alkol | |
| 450 ml su | |
| 100 ml buzlu asetik asit | |
| 400 mi metil alkol | |
| 500 ml su |
Tablo leke çözümleri ve SDS-PAGE jeli destain 2. Tarifler. Boyama ve SDS-PAGE kullanılarak karakterizasyon için bir destaining çözümü için Coomassie Parlak mavi R250.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rekombinant protein mühendisliği aşağıdan yukarıya yaklaşımı kullanarak yeni protein malzemeleri oluşturmak için çok yönlü bir tekniktir. Protein bazlı malzemeler ilgi uygulamasına göre birden fazla işlevleri sahip olacak şekilde dizayn uygun olabilir. Nedeniyle klonlanması ve protein ifadesi teknolojileri artan ilerleme için, bir tekrar üretilebilir ve ölçeklenebilir şekilde yapay proteinler çeşitli oluşturmak için göreceli olarak basit (ve uygun maliyetli) olmuştur. elastin-benzeri domen bir saflaştırma etiketi olarak hizmet etmek için, hem de mekanik özellikler kazandırmak için, yapay bir dizi protein dahil edilmiştir. Bir elastin gibi dizisini içeren yapay proteinler, hali hazırda pahalı saflaştırma sütun ve antikorlar için ihtiyacı ortadan kaldırır ITC, kullanılarak saflaştırılabilir.
Bu protokol aECM proteinleri kodlayan rekombinant plazmidler oluşturmak için gereken adımları açıklar. Elastin benzeri tekrarlar için kodlayan genler satın alınmıştır. Içinpolipeptidler gibi elastin gibi oldukça tekrarlanan peptid dizisi, bu yinelemeli yönlü ligasyonu (RDL) stratejiler 22 kullanılabilir, öyle ki klonlama stratejisi tasarlamak için tavsiye edilir. RDL kullanarak, belirli bir zincir uzunluğu ile birlikte tekrarlanan polipeptidler sentezlenebilir ve bu nedenle ilgili genler, kısa monomerler olarak satın alınabilir.
Hem merkezi hücre bağlayıcı alanına modüler değiştirmeyi sağlamak için uçta Çalışmalarımızda, hücre bağlama alanları komşu Nhel kısıtlama sahalarını içermek üzere tasarlanmıştır. Bu benzersiz ve fonksyonel içinde mevcut ya da başka bir ev sahibi vektör çoklu klonlama bölgesinin (MCS) dış olmayan kısıtlama bölgelerini seçmek önemlidir. Bu amaçlanan sitelere girme veya vektör sindirimi sınırlandırmak etmektir. Bazı durumlarda, önceden fonksyonel bölgenin sokulmasından mutagenez kullanılarak konakçı vektörüne yeni bir sınırlı bölgeler elde etmek gerekli olabilir.
BizimKlonlama stratejisi bize kolayca aECM proteinlerin üç çeşidini elde etmek için merkez hücre bağlayıcı etki alanını değiştirmek için izin verdi. Ayrıca bir lizin kalıntısı ekleyerek başlangıç metionin fazla 10 kat protein verimini sonra kaydetti. Protein verimi bu dramatik artış nihai protein verimi 60 mg / L ila 5 mg / L'den yüksek LN-5 aECM protein ile en belirgin olmuştur.
Çeşitli E. E. coli sentezleme ana BL21 (DE3) pLysS, E. karşılaştırıldığında edildi ve coli suşu en iyi protein verimlerini verdi. Protein ekspresyonu daha uzun 4 saat IPTG ile indüklenmiştir zaman protein verimi iyileşme az oldu. 1 mM'den daha büyük IPTG konsantrasyonlarda protein ekspresyonu açısından anlamlı bir fark yoktu. Yakın 0.6 OD uyarılan Ancak, protein ifadesi en yüksek oldu.
ITC kullanılarak aECM proteinlerin etkili bir iyileşme için, santrifüj cihazının sıcaklığının dikkat etmek önemlidir. Sınavaple saflaştırma aşamasından en aECM proteinlerinin maksimal çözünürlüğünü sağlamak için soğuk bir odada (4 ° C) yapıldı. Aynı zamanda gerekli olabilir (4 ° C) önceden chill santrifüj rotor O / N öncesinde soğuk döngüsü. Benzer şekilde, santrifüj rotor protein çözeltisinin sıcaklığı, T, T, yukarıda muhafaza edilmesini sağlamak amacıyla sıcak bir işlemi öncesinde (37 ° C) kadar ön-ısıtılır.
Özet olarak, prosedür tasarımı ve yapay ECM proteinlerini kodlayan klon rekombinant plazmidler açıklanmıştır. Özellikle, ITC kullanılarak aECM proteinlerin ekspresyonu ve saflaştırılması açıklanmıştır. Son olarak, SDS-PAGE elektroforezi ve Western Blot ile aECM proteinlerin karakterizasyonu tanımlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar Milli Eğitim Bakanlığı AcRF Tier 1 (RG41) fon kabul ve Nanyang Teknoloji Üniversitesi tarafından hibe başlatmak istiyorum. Alçak ve Tjin Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur Araştırma Öğrenci Bursu (RSS) tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET22b (+) | Novagen | 69744 | T7 expression vectors with resistance to ampicillin |
| BL21(DE3)pLysS | Invitrogen | C6060-03 | additional antibiotics - chloramphenicol |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction. |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | plasmid isolation kit |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Ampicillin | Affymetrix | 11259 | |
| Chloramphenicol | Affymetrix | 23660 | |
| Zymoclean™ gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | |
| XL10-gold strain | Agilent Technologies | 200315 |
References
- Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. Elastomeric biomaterials for tissue engineering. Prog Polym Sci. 38 (3-4), 584-671 (2013).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 352-366 (2011).
- Kushner, A. M., Guan, Z. Modular Design in Natural and Biomimetic Soft Materials. Angewandte Chemie International Edition. 50 (39), 9026-9057 (2011).
- Gagner, J. E., Kim, W., Chaikof, E. L. Designing protein-based biomaterials for medical applications. Acta Biomater. 10 (4), 1542-1557 (2014).
- Gomes, S., Leonor, I. B., Mano, J. F., Reis, R. L., Kaplan, D. L. Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering. Prog Polym Sci. 37 (1), 1-17 (2012).
- Werkmeister, J. A., Ramshaw, J. A. M. Recombinant protein scaffolds for tissue engineering. Biomedical Materials. 7 (1), 012002 (2012).
- MacNeil, S. Biomaterials for tissue engineering of skin. Materials Today. 11 (5), 26-35 (2008).
- Fong, E., Tirrell, D. A. Collective Cell Migration on Artificial Extracellular Matrix Proteins Containing Full-Length Fibronectin Domains. Advanced Materials. 22 (46), 5271-5275 (2010).
- Ratner, B. D., Bryant, S. J. BIOMATERIALS: Where We Have Been and Where We are Going. Annual Review of Biomedical Engineering. 6 (1), 41-75 (2004).
- Cai, L., Heilshorn, S. C. Designing ECM-mimetic materials using protein engineering. Acta Biomater. 10 (4), 1751-1760 (2014).
- Annabi, N., et al. Elastomeric recombinant protein-based biomaterials. Biochemical Engineering Journal. 77 (0), 110-118 (2013).
- Heilshorn, S. C., DiZio, K. A., Welsh, E. R., Tirrell, D. A. Endothelial cell adhesion to the fibronectin CS5 domain in artificial extracellular matrix proteins. Biomaterials. 24 (23), 4245-4252 (2003).
- Simnick, A. J., Lim, D. W., Chow, D., Chilkoti, A. Biomedical and Biotechnological Applications of Elastin-Like Polypeptides. Polymer Reviews. 47 (1), 121-154 (2007).
- Tjin, M. S., Chua, A. W. C., Ma, D. R., Lee, S. T., Fong, E. Human Epidermal Keratinocyte Cell Response on Integrin-Specific Artificial Extracellular Matrix Proteins. Macromolecular Bioscience. 14 (8), 1125-1134 (2014).
- MacNeil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Kariya, Y., et al. Differential regulation of cellular adhesion and migration by recombinant laminin-5 forms with partial deletion or mutation within the G3 domain of α3 chain. J Cell Biochem. 88 (3), 506-520 (2003).
- Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., Quaranta, V. The LG3 module of laminin-5 harbors a binding site for integrin α3Β1 that promotes cell adhesion, spreading, and migration. J Biol Chem. 276 (35), 33045-33053 (2001).
- Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Current Protocols in Protein Science. , 6.11.1-6.11.16 (2010).
- Keeley, F. Ch. 4. Evolution of Extracellular Matrix.Biology of Extracellular Matrix. , Springer. Berlin Heidelberg. 73-119 (2013).
- Le, D. H. T., et al. Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides. Biomacromolecules. 14 (4), 1028-1034 (2013).
- MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583 (2014).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
