Protocol
1. שיבוט של רקומביננטי פלסמידים קידוד לחלבונים aECM
- לעצב את רצף החומצות האמיניות של תחום הפונקציונלי (למשל, תחום מחייב תא וחוזר כמו אלסטין). אתרי הגבלת עיצוב איגוף הקצוות של תחומים הפונקציונליים כדי להקל על שימוש בתוכנה חופשית בהתאם להוראות תוכנת שיבוט-משנה (לדוגמא, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). כאן, בחר אתרי הגבלה ייחודיים שאינם קיים בתחום הפונקציונלי להגביל עיכול לאתרים המיועדים. בחר אתרי הגבלה המופיעים באתר השיבוט מרובה (MCS) של וקטור המארח (למשל, pET22b (+)) למשנה שיבוט.
- הפוך לתרגם את רצף חומצות אמינו לתוך רצף נוקליאוטידים באמצעות אתרים בחינם על פי הוראות תוכנה. (למשל, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). קודונים להבטיח מותאמים E. מארחי coli.
- גן של עניין יכול להיות purchasoligonucleotides אד מסחרי יחיד שנתקע (כלומר, אם oligonucleotides <100 זוגות בסיסים (BP)) ולבצע חישול DNA (ראה שלב 1.4) כדי להפחית את העלות. אחרת, לגנים גדולים יותר מ -100 נ"ב, הם יכולים לרכוש דרך חברות מסחריות.
- חישול DNA של oligonucleotides
- לחשל oligomers DNA כדי להשיג את רצף הגן הרצוי. ממיסים oligonucleotides דנ"א במאגר oligomer DNA (10 מ"מ טריס: 2-אמינו-2- (hydroxymethyl) -propan-1,3-דיאול, pH 8.0, מסונן) לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / μl.
- הוסף 4 μl של כל oligomer 32 μl של חיץ חישול DNA (10 מ"מ טריס, 100 מ"מ NaCl 100 ננומטר וMgCl 2) כדי להשיג כוללת תערובת 40 μl.
- מרתיחים כוס מים באמצעות פלטה חשמלית ולטבול את התערובת ל5 דקות, 95 מעלות צלזיוס. הסר את הכוס ולקרר את כל להגדיר בתיבת קלקר O / N בהדרגה. Oligomers כבר מרותק ומוכנים לעיכול.
הערה: pET22b (+) וקטור פלסמיד הוא עמיד לאנטיביוטיקה אמפיצילין ומכיל 6x-תג בC-הסופי. 6x-התג הנוכחי בpET22b (+) מאפשר לנו להשתמש בנוגדנים מתויגים כדי לזהות את חלבון המטרה באמצעות מערבי סופג בשלב 7. - להוסיף צבע טעינת 6x לכל תערובת עיכול. הפעל את תערובות העיכול בנפרד כוללים סולם DNA בג'ל agarose DNA של 1.2% המכיל DNA כתם UV-ניאון עבור שעה 1 ב 100 V. דמיין 1.2% ג'ל agarose DNA עם הפנס אור UV.
- פורסים את ג'ל לחלץ מוצרי DNA מתעכלים באמצעות ערכות טיהור ג'ל המסחרי. Elutדואר באמצעות הנפח המינימאלי לטור כדי להשיג ריכוז ה- DNA מינימום של 50-100 ng / μl.
- מערבבים את הגן של ריבית על ידי רצף ligating להכניס DNA מתעכל (כלומר, חוזר אלסטין או תחומים תא מחייב מתקבלים על ידי חישול DNA) לתוך וקטור פלסמיד באמצעות האנזים T4 באמצעות המתכון הבא: (2 μl של וקטור, μl 1 של האנזים T4, 1.5 μl של חיץ קשירת T4, x μl של הכנס, 10.5 x-מים μl לסך תערובת 15 μl). דגירה את תערובת קשירה ב RT עבור שעה 2.
הערה: ריכוז טוחן של וקטור להכניס צריכה להיות מגוון כדי לייעל את יעילות קשירה. נפח של הכנס תאר כx במתכון תלוי בריכוז ה- DNA eluted מצעד 1.7. - ההפשרה E. קולי תאי DH5α כימיים מוסמך (או כל זן שיבוט) על קרח. צלחות אגר 2xYT החם (טבלה 1) המכילה אמפיצילין (25 מיקרוגרם / מיליליטר) עד 37 מעלות צלזיוס.
- להפוך את התאים באמצעותהלם חום:
- Aliquot 50 μl של תאים המוסמכים לתוך צינורות נקיים, טרום צוננים מיקרו צנטריפוגות. μl פיפטה 5 (בין 100 עמ '100 ng) של תערובת קשירה לתאים, pipetting בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב. השאר את התערובת על קרח למשך 20 דקות.
- לטבול את צינור מיקרו צנטריפוגות המכיל התערובת של התאים באמבט מים 42 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות וחזר לעל קרח למשך 2 דקות. זמן משך הטבילה כדי למזער נזקי חום לתאים.
- הוסף 500 μl של תקשורת SOC (טבלת 1) לתוך צינור מיקרו צנטריפוגות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רעד במשך שעה 1.
- מורחים 50 500 μl של תערובת תא / קשירה על צלחת אגר 2xYT כי כבר מראש לחמם RT, המכיל אמפיצילין (25 מיקרוגרם / מיליליטר) ודגירה צלחות הפוכה ב 37 מעלות CO / N (12-16 שעות) .
- למחרת, לאסוף מושבות DNA מהצלחת אגר באמצעות טיפים פיפטה נקיים. לגדול המושבות ב 5 מיליליטר של תקשורת 2YT (טבלה 1) המכיל אמפיצילין (25 מיקרוגרם / מיליליטר) O / N ב 37 מעלות CO / N (12-16 שעות) עם (סל"ד רועד 225).
- למחרת, השתמש בערכת בידוד פלסמיד כדי לחלץ את פלסמידים DNA לכל מושבה הרימה על פי הפרוטוקול של היצרן. Elute DNA עם 50 μl של מים.
- לבצע בדיקה לעכל עם אנזימי הגבלת שימוש במתכון הבא: (DNA 5 μl, 0.2 μl של כל אנזים הגבלה, חיץ 1 μl 10x הגבלת אנזים ומים העליונים לסך תערובת 10 μl), דגירה של השעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס למסך למושבות שעשויות לכלול את הכנס ולרוץ על 1.2% ג'ל agarose DNA כמו בשלב 1.6.
הערה: לאחר העיכול, קשירה מוצלחת צריכים תוצאות בשתי להקות, אחד עבור כל וקטור ולהוסיף שמתאימים למשקל המולקולרי שלהם (איור 1). - שלח הסבירות מושבות לרצפי DNA באמצעות אמרגן T7 קדימה ולהפוך פריימרים לsequencers המסחרי.
ילדה = "jove_title"> 2. הפיכתו של רקומביננטי פלסמיד למארח ביטוי בקטריאלי
- מהתוצאה הרצף, בחר מושבה שכבר ligated בהצלחה ולהשתמש בפלסמיד דנ"א להפיכה ה מארח ביטוי coli.
- ההפשרה E. זן ביטוי coli (BL21 (DE3) pLysS) על קרח. בינתיים, צלחות אגר חמות המכילות אמפיצילין (25 מיקרוגרם / מיליליטר) וchloramphenicol (34 מיקרוגרם / מיליליטר) לRT.
הערה: פלסמיד pLysS הנוכחי בחיידקים להתאמץ BL21 (DE3) pLysS מכילה גן התנגדות chloramphenicol. פלסמיד pLysS מכיל גן מדכא T7 אשר בא לידי ביטוי constitutively להגביל ביטוי דולף של חלבון aECM. Chloramphenicol יש צורך לבחור לתאי חיידקים המכילים pLysS בתרבות. - חזור על שלב 1.10 להשיג הפך E. תאי coli כי הם מוכנים לבטא את החלבונים המלאכותיים. לעטוף צלחות אגר בParafilm ולאחסן הפוך ב 4 6; C עד חודש אחד.
3. ביטוי של חלבונים בקטריאלי aECM
- עיין באיור 2, פיק מושבה מהצלחת אגר הפכה עם קצה פיפטה ולחסן לתוך 10 מיליליטר של תקשורת סטרילית נהדר מרק (TB) (טבלה 1) המכילה את שני אמפיצילין ואנטיביוטיקה chloramphenicol במבחנה. דגירה תרבות המתנע זה על 37 מעלות CO / N (12-16 שעות) עם רעד ב225 סל"ד.
- העברה 10 מיליליטר של תרבות המתנע לתקשורת שחפת 1 ליטר טרי וסטרילי בתוספת אותה האנטיביוטיקה בבקבוק 3 L Erlenmeyer. דגירה התרבות על 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 225 סל"ד במשך 2-3 שעות ולבחון את הצפיפות האופטית של התרבות (OD 600) הגיע .6-0.8 ידי pipetting 1 מיליליטר של התרבות לתוך קובט ריק לקריאה. חוסכים 1 מיליליטר של התרבות לפני הגיוס לאפיון SDS-עמוד.
- כדי למדוד OD 600 של תרבית התאים, להכין בקבוקון 1 של תקשורת שחפת בקובטלמדידה ריקה. בנפרד, להעביר 1 מיליליטר של תרבות מהבקבוק התרבות לקובט הריק חדש. מדוד את הצפיפות האופטית של התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר נגד השליטה ריקה בספיגה של 600 ננומטר.
- שמור את המדגם (לניתוח SDS-עמוד שלאחר מכן) על ידי העברת 1 מיליליטר של מדגם התרבות לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר, צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 2 דקות, ולמזוג supernatant.
- לגרום לתרבות עם איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לריכוז סופי של 1 מ"מ ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 225 סל"ד עוד 4 שעות. חוסכים 1 מיליליטר של תרבות בסוף האינדוקציה ב 4 שעות לאפיון SDS-עמוד.
- קציר התאים על ידי העברת התרבות לבקבוקי צנטריפוגות 1 ליטר ו צנטריפוגות ב XG 12,000 למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant, לשקול את כדורי תא וגלול בעשרה חיץ (1 M טריס, 0.01 M EDTA, 0.1 מ 'NaCl, pH = 8.0) ברמה של 0.5 גר' / מיליליטר.
4. תמוגה של תרבויות חיידקים
- להקפיא את תרבות התא מחדש המושעה ב -80 CO ° / N. להפשיר את תרבות תאים קפואה באמבט מים ב RT או על קרח כדי lyse התאים. הוסף 10 מיקרוגרם / מיליליטר Deoxyribonuclease אני (DNase אני), 10 מיקרוגרם / מיליליטר Ribonuclease (RNase אני), ומיקרוגרם 50 / מיליליטר phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) תוך הפשרה וhomogenize הפתרון עם ערבוב איטי.
- לאחר כל תאי resuspended הם הפשירו, להתאים את הפתרון ל- pH 9.0 להגדיל את מסיסות החלבון במים 12. הוסף 6 ירידת N NaOH חכמה עם ערבוב על קרח כדי להשיג עקביות הומוגנית. Lyse על ידי שיבוש קולי במשך 20 דקות על קרח באמצעות קצה 2 מ"מ קוטר שטוח, 5 שניות דופק.
- צנטריפוגה פתרון התא ב XG 12,000 למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את supernatant ל, בקבוק ריק נקי וחנות על 4 מעלות צלזיוס לטיהור מאוחר יותר.
- בינתיים, resuspend התא גלולה שוב עם עשרה חיץ ומחדש הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס. לתמוגה מלאה התא, הקפאה / הפשרה חוזרת וsonication תהליך עד שלוש פעמים. חסוך 20 lysate תא μl לאפיון SDS-עמוד.
5. טיהור החלבונים aECM שימוש הפוך מעבר רכיבה על אופניים
- איסוף lysate התא מהשלב 4.3 ולהמשיך לטהר את חלבוני aECM באמצעות ITC, דומה לזה המשמש לטיהור חלבונים מבוסס אלסטין 21. מחזורים ייעשו עם הטמפרטורות שונות שהם 4 ° C (המכונה "קר") ו- 37 ° C (המכונה "חמים") מחזורי בהתאמה.
- פיצול lysate התא לתוך 50 מיליליטר בקבוקי צנטריפוגות, וצנטריפוגות ב 40,000 XG לשעה 2 ב 4 מעלות צלזיוס. המראה של התא גלולה צריך להיות בצבע חום כהה ולחפש נזלת.
- הסר את supernatant ידי pipetting כדי לקבל הפרדה נקייה מגלולה. לאסוף את supernatant בבקבוקי צנטריפוגות נקיים ולהוסיף NaCl לריכוז סופי של 1 M (עד למקסימום של 3 מ '). חםהפתרון ל -37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 עם רעד ב225 סל"ד.
הערה: תוספת של NaCl תפעיל את המעבר של רכיב אלסטין של הצבירה גורמת aECM. Supernatant יהפוך עכור. אם ריכוז החלבון הוא גבוה מספיק, חלבון מוקצף לבן ניתן לראות בצדדים של בקבוק צנטריפוגות. - צנטריפוגה supernatant משלב 5.3 ב40,000 XG לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant. לרסק את הכדור בעזרת מרית מתכת וresuspend הביטים גלולה בautoclaved מים מזוקקים קר כקרח (50 מ"ג / מיליליטר) עם O ערבוב נמרץ / N ב 4 ° C באמצעות סרגל מערבבים מגנטי וצלחת. גלולה צריכה להיות נמסה לגמרי.
- חזור על שלבים 5.2-5.4 לשלוש עד חמש פעמים נוספות כדי להשיג טוהר גבוה יותר של החלבון.
- לאחר המחזור האחרון של טיהור, desalt פתרון החלבון על ידי dialyzing זה נגד מים מזוקקים ב 4 מעלות צלזיוס. Dialyze פתרון חלבון נגד מים במשך 2-3 ימים עם שינויים במים כל 4שעות או 8 שעות לO / N. חסוך 20 μl של החלבון המטוהר לSDS-PAGE וLyophilize שאר החלבון והחנות המטוהרים ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
6. אפיון של החלבונים aECM שימוש SDS-PAGE אלקטרופורזה
- הכן 12% ג'ל SDS-עמוד (אם המשקל המולקולרי גדול, להשתמש בג'לים SDS-עמוד 8% להפרדה טובה יותר). הוסף חוצץ טעינת SDS 2x מדגם זה, לחמם את הדגימות למשך 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס ולהפעיל דגימות על הג'ל לשעה 1 ב 100 V או עד סולם החלבון המתאים למשקל המולקולרי של חלבון aECM מגיע אמצע ג'ל.
- אחזר את הג'ל מSDS עמוד-להגדיר ולהוסיף Coomassie כתם כחול מבריק (טבלה 2) עם נפח כדי להטביע את הג'ל לשעה 1 בצלחת פטרי. ג'ל שטיפה בתמיסת destaining (טבלה 2) במשך 5 דקות על כיסא נדנדה. לשנות את פתרון destaining, וימשיך destain ג'ל עם נדנדה עד שהרקע של tהוא ג'ל הופך ברור. להקות חלבון צריכה להיות ברור לעין.
- להשוות את מעמדו של חלבון המטרה נגד סולם החלבון כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של חלבון המטרה.
- כדי לאשר את קיומו של חלבון המטרה נוסף, לבצע מערבי סופג כמו בשלב 7.
7. אפיון של החלבונים aECM שימוש סופג מערבי
- הפעל את הדגימות על 12% ג'ל SDS-עמוד כאמור בסעיף 6 ללא הכתמה.
- חותך קרום nitrocellulose לגודל מעט גדול יותר מג'ל SDS-עמוד. חותך 4 חתיכות של נייר סינון באותו הגודל.
- חתיכה אחת רטובה של נייר סינון עם הצפת העברה המערבית (20% מתנול / V V, 25 מ"מ טריס, 190 מ"מ גליצין, pH 8.3), הנח את ג'ל SDS-עמוד על גבי נייר הסינון, ואחריו פיסת נייר סינון נוספת , אז קרום nitrocellulose וסופי שתי חתיכות של נייר סינון אחרות. ודא ההגדרה כולו שקועה עם חיץ העברה מערבי מספיק.
הערה: ג'ל והקרום לא צריך להיות במגע בנקודת זמן זו כחלבונים יכולים להיקשר לממברנה במגע. - העבר את החלבונים על הממברנה nitrocellulose על ידי הצבת שני מסמכי מסנן ליחידה מערבית חצי יבש העברה, ואחריו את קרום nitrocellulose, ומניח בזהירות את ג'ל SDS-עמוד ובעל הקרום, ולבסוף מניח את נייר הסינון האחרון שני הרטוב ב ג'ל SDS-עמוד. הפעל את ההעברה המערבית ב 45 מילי-אמפר, 30 דקות. הוסף חוצץ אם מתח גבוה מ -30 V.
הערה: רצוי למקם את ג'ל SDS-PAGE על הממברנה עם ניסיון אחד ולהימנע מהעברת ג'ל שלא לצורך על קרום חלבונים יכולים להיקשר לממברנה במגע. - אחזר ולחסום את קרום nitrocellulose עם פתרון החסימה (5% חלב דל שומן בpH 7.4 PBS, מסונן עם נייר סינון) לשעה 2 ב RT. השלך חיץ החסימה ולהוסיף PBS לשטוף.
הערה: שינוי לכפפות חדשות, כדי למנוע זיהום הקרום עם הגנה של מחזור לא רצויתוספות. - דגירה הנוגדן הראשוני נגדו בדילול PBS ב 1: 1,000 ב RT עבור שעה 1 עם נדנדה. הכן תערובת בנפח שיכול להטביע את כל הקרום, למשל, עם יחס דילול 1: 1,000, להוסיף 1 μl של נוגדן (ריכוז מניות: 1 מ"ג / מיליליטר) עד 999 μl PBS לתערובת כוללת של 1 מיליליטר.
- יש לשטוף את הממברנה עם 5 מיליליטר של PBST (PBS עם 0.1% Tween20).
- דגירה עם נוגדנים משני מצומדת לperoxidase סוס-צנון (HRP) בדילול PBS ב 1: 5000 ב RT עבור שעה 1 עם נדנדה. הכן תערובת בנפח שיכול להטביע את כל הקרום, למשל, עם יחס דילול 1: 5,000, להוסיף 1 μl של נוגדן (ריכוז מניות: 1 מ"ג / מיליליטר) ל4,999 μl PBS לתערובת כוללת של 5 מיליליטר.
- לשטוף את הממברנה עם 5 מיליליטר של PBST וחזור פעמיים.
- החל מצע chemiluminescent הקרום בהיקף כדי לכסות את הקרום ודגירה על ידי ביצוע ההוראות למצע בשימוש.
הערה: הרגישות של המצע לגילוי חלבון עשויה להשתנות, אנו ממליצים מצע עם רגישות מקסימלי לאותות נמוכים מאוד במקרה הגדלת ריכוז נוגדנים אינו מגביר אותות. - ללכוד את אותות chemiluminescent באמצעות תרמי מבוסס מצלמת CCD. התאם את יחס דילול נוגדן הראשוני ומשניים אם אותות חלשים ואינם ספציפיים. דגירה ארוכה יותר בחסימת פתרון אם אות רקע היא גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעיצוב חלבוני היתוך המכילים חזרות כמו אלסטין-, חשוב לשמור על תכולת האלסטין כוללת, מספיק חלק גדול של חלבון ההיתוך 18. זו היא להבטיח כי מבנה חלבון ההיתוך שומר מאפיינים כמו אלסטין-, על מנת להשתמש ITC לטיהור. העיצוב והרצפים המתוארים בסעיף זה חלבוני aECM נלקחו במיוחד מהעבודה על ידי et al Tjin. 14. בעבודה זו, שלושה חלבוני aECM היו משובטים בהצלחה לוקטור ביטוי pET22b (+). קשירה רציפה החלה ראשונה עם ligating חוזר אלסטין להכניס לתוך וקטור PET, ואחרי החדרת תחום מחייב התא. לבסוף הסט האחרון של חזרות אלסטין הוכנסו בסוף המסוף של תחום מחייב התא על ידי שימוש באותה השיטה. כדי לוודא אם הגנים רקומביננטי נבנו בהצלחה, כל פלסמיד רקומביננטי מבחן מתעכל עם XhoI וסאלי לשעה 3 ב 37 מעלותג איור 1 מציג את תוסף ה- DNA ולהקות וקטור לאחר עיכול המבחן. לכל אחד מחלבוני aECM, גודל מוסיף תואם את גודלו של הגן, המאשר כי השיבוט היה מוצלח מאוד. אימות נוספת באמצעות רצפי DNA גם אישרה את תוצאות מבחן העיכול.
הצלחנו לטהר את חלבוני aECM דרך ITC ניתנו נוכחי תוכן אלסטין מספיק בכל חלבון aECM. איור 2 מציג את סכמטי של תהליך הטיהור הכולל. O התרבות / N הייתה מחוסנת בבקבוק 1 ליטר עם לרעוד OD התחלה טיפוסי 600 של 0.01. התרבות גדלה OD 600 של 0.6-.8 לאחר 3-4 שעות. ביטוי חלבון היה מושרה באמצעות 1 מ"מ של IPTG. לאחר 4 שעות, OD הטיפוסי של 1.5 מושגת. תרבות החיידקים נקצרה ונתונים לצנטריפוגה. Supernatant הושלך ותא גלולה נשקל. המשקל הממוצע של התא גלולה היה כ -3 g / L שלתרבות. גלולה הייתה מחדש תלויה בעשרה חיץ וקפוא בCO -80 ° / N.
סדרה של הקפאה / הפשרה מחזורים שימשה לlyse התאים. הצעד להקפיא להפשיר גורם תא להתנפח ולהתכווץ, סופו של דבר לשבור בשל גבישי קרח שנוצרו במהלך תהליך ההקפאה. בהמשך לכך, אני DNase וRNase אני נוספו לlysate התא לעכל את כל ה- DNA ו- RNA. PMSF הוא מעכבי פרוטאז, שגם התווסף לlysate התא כדי למזער פירוק חלבונים. תוך כדי להבטיח תמוגה תא שלמה נוסף, lysate היה sonicated נוסף כל הזמן על קרח.
Lysate התא היה אז נתון 3 מחזורים של טיהור ITC. בסופו של 3 המחזורים, גלולה בסוף המחזור החם דמתה דבש בעקביות והיה צבע צהוב קל. גלולה הפכה שקופה במגע עם מים, ונמסה בקלות במים autoclaved טרום צוננים עם רעד. החלבון המטוהר הוא dialyzed להסיר כל של שיירalt. פתרון החלבון המתקבל בסופו של המחזור החם הסופי הועבר לאורך קצר של צינורות דיאליזה (עם 12 משקל מולקולרי kDa מנותק). בסופו של הדיאליזה, פתרון החלבון הועבר לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר נקי וקפוא ב -20 ° C. למחרת, פתרון החלבון הקפוא היה lyophilized כדי להסיר את תוכן המים. איור 3 מראה תמונה של חלבון dialyzed, בעל חזות טיפוסית כמו צמר-.
כדי לקבוע אם ביטוי החלבון היה מושרה אכן, דגימות שנאספו לפני ואחרי הגיוס נותחו על ידי אלקטרופורזה SDS-עמוד. כאן, 12% ג'ל SDS-PAGE היה מספיק כדי להפריד בין חלבונים עם משקולות מולקולריות של kDa 20-150. במקרה שהמשקל המולקולרי הוא גדול, כלומר,> 100 kDa, ג'לי SDS-עמוד 8% יכול לשמש להפרדת חלבון טובה יותר. איור 4 מראה להקת חלבון אינטנסיבית במשקל המולקולרי חזה בsa המושרהmple (מסלול 2). בדרך כלל, SDS-PAGE ניתוח בוצע מייד לאחר ביטוי חלבון לפני הטיהור מתחילה. בהמשך לכך, דגימות שנלקחו בתהליך הטיהור יכול גם להיות מנותח באמצעות אלקטרופורזה SDS-PAGE כדי להבטיח טיהור יעילה של חלבון המטרה. איור 4 מראה גם ג'ל SDS-עמוד המכיל מדגם חלבון מטוהר עם משקל מולקולרי של 22 kDa (מסלול 4 ), המקביל לLN-5 aECM 14. טוהר המשוער של חלבוני aECM היה כ -90% -95%; ערך זה נגזר על ידי השוואת יחסים של עוצמות הלהקה של חלבון המטרה ולהקות חלבון אחרים הנמצאות על ג'ל SDS (איור 4, מסלול 4). לבסוף, כדי לקבוע אם החלבון המטוהרים היה אכן חלבוני aECM, מערבי סופג בוצע. בהמשך לכך, MALDI-TOF גם בוצע על מנת לקבוע במדויק את תוכן הטומאה של החומר המטוהר 14. איור 5 מראה את טוהר החלבון של השלוש aECM חלבוני דואר עם ג'ל SDS-עמוד באיור 5 א 'ולהשוות נגד דמותו של קרום nitrocellulose למערבי סופג באיור 5, המראה את הנוכחות של חלבוני היעד Col-IV aECM וLN-5 aECM, מתויגים באמצעות אנטי -6x נוגדנים שלו-התג מצומדות עם סוס הצנון Peroxidase (HRP). התשואות הסופיות של חלבוני aECM נעו בין 60 מ"ג / ליטר 120 מ"ג / ליטר.
אלקטרופורזה באיור 1. DNA agarose ג'ל של חלבוני aECM. אימות של חלבון aECM סופי הבונה DNA באמצעות אנזימי הגבלת העיכול רץ על 1.2% ג'ל agarose DNA. פלסמידים רקומביננטי קידוד עבור כל אחד מחלבוני aECM היו מתעכלים כפולים עם XhoI וסאלי לשעה 3 ב 37 ° C. הגדלים של מוסיף מתאים לגודלו של כל גן חלבון aECM (FN910: 1.8 KBP, Col-IV: 696 נ"ב, LN-5: 699 נ"ב) ואת הגודל של הווקטור pET22b (+) המשמש הוא 5.5 KBP.
איור 2. זרימה סכמטי לביטוי חלבון, תמוגה והטיהור של חלבוני aECM. המדריך הבסיסי לביטוי חלבון רקומביננטי, החל מהחיסון של מושבה אחת לתרבות קטנה ובהיקף של עד 1 ליטר תרבות, קציר וresuspending של תאים, אחרי תמוגה חלבון. טיהור חלבון בוצעה באמצעות התנהגות של תחומים כמו אלסטין-הווה בחלבוני ECM המלאכותיים LCST. חלבוני aECM הם מטוהרים באמצעות ITC. מחזורים קרים וחמים מרובים בוצעו כדי להשיג טוהר גבוה חלבון המטרה של. לבסוף, חלבון המטרה היה dialyzed עם מים וlyophilized עד לשימוש נוסף. "O / N" = הלילה. "S / n" = supernatant.
r.within עמודים = "תמיד"> 
תמונת איור 3. חלבון aECM lyophilized מטוהר על ידי הפוך מעבר רכיבה על אופניים. Lyophilized LN5-aECM של יש מראה כמו צמר-.
ג'ל אלקטרופורזה 4. SDS-עמוד איור של חלבון aECM (LN-5 aECM). ליין 1 ו -2 תערוכות תרבות לפני ואחרי גיוס חלבון. נוכחות של להקה עבה ליד 22 kDa מראה כי aECM LN-5 באה לידי הביטוי בהצלחה. ליין 3 מציג את lysate התא המלא בזמן מסלול 4 תערוכות LN-5 חלבון aECM המטוהר לאחר 3 מחזורים של ITC.
ג'ל 5. (א) SDS-עמוד איור של חלבוני aECM. כתם מערבי חקר ל6x-התג לCol (ב)חלבוני -IV וLN-5 aECM. שני חלבוני Col-IV וLN-5 aECM מכילים C-הסופי 6xHis-תג. chemiluminescence החיובית שנצפתה במשקל המולקולרי חזה ב 22 kDa למדגם LN-5 aECM ו -24 kDa למדגם Col-IV aECM מייצגים-תג 6x הנוכחי בחלבון המטוהר.
| תקשורת / L | רכיבים והוראות |
| תקשורת SOC | 20 גרם Tryptone |
| תמצית שמרים 5 גרם | |
| 0.6 גרם NaCl | |
| 0.2 גרם KCl | |
| להוסיף וחיטוי במיליליטר המים 940, | |
| לאחר מכן להוסיף סטרילי (מסנן מעוקר) | |
| 10 מיליליטר 1 M MgCl 2 | |
| 10 מיליליטר 1 M MgSO 4 | |
| גלוקוז 40 מיליליטר 20% | |
| 16 גרם Tryptone | |
| תמצית שמרים 10 גרם | |
| 5 גרם NaCl | |
| 15 גרם Bacto אגר (בנוסף רק לצלחת אגר) | |
| מתמוסס במים וראש עד 1 ליטר וחיטוי. | |
| כדי להכין צלחות אגר, מגניבים 55 ° C לפני התוספת של אנטיביוטיקה. | |
| מערבבים היטב לפני המזיגה בצלחת פטרי. | |
| לקרר את הצלחות עד אגר הוא התגבש. | |
| לעטוף צלחות בParafilm ולאחסן הפוך ב 4 מעלות צלזיוס. | |
| מרק נהדר (TB) | 12 גרם Tryptone |
| תמצית שמרים 24 גרם | |
| גליצרול 4 מיליליטר | |
| מתמוסס במים ומיליליטר 700 החיטוי. | |
| 16.42 גרם K 2 4 HPO(Merck) | |
| KH 2.31 גר '2 PO 4 (Merck) | |
| מלחים מתמוססים במים ומיליליטר 300 החיטוי בנפרד, על מנת להבטיח מתמוססים באופן מלא. | |
| לשלב את שני בינוני ומלחים לאחר הקירור. |
טבלת 1. מתכונים לתקשורת SOC, 2xYT תקשורת / אגר ונהדרת מרק. מדיה עבור E. תרבות coli המשמשת בשיבוט מולקולרי וביטוי חלבון.
| פתרון / L | רכיבים והוראות |
| כתם הכחול מבריק Coomassie | 0.25 גרם Coomassie blueR250 |
| 100 חומצה אצטית קרחונית מיליליטר | |
| אלכוהול 450 מיליליטר מתיל | |
| מיליליטר מים 450 | |
| 100 חומצה אצטית קרחונית מיליליטר | |
| אלכוהול 400 מיליליטר מתיל | |
| 500 מיליליטר מים |
טבלה 2. מתכונים לפתרונות להכתים וdestain ג'ל SDS-עמוד. הכחול R250 מבריק Coomassie מכתים ופתרון destaining לאפיון באמצעות SDS-עמוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנדסת חלבון רקומביננטי היא טכניקה צדדי כדי ליצור חומרי חלבון רומן באמצעות גישה מלמטה למעלה. יכולים להיות מתוכננים חומרים מבוססי החלבון יש פונקציות מרובות, מותאם בהתאם ליישום של עניין. בשל התקדמות גוברת בטכנולוגיות שיבוט וביטוי חלבון, זה הפך להיות יחסית פשוט (וחסכוני) כדי ליצור מגוון של חלבונים מלאכותיים באופן שחזור וניתן להרחבה. תחום כמו אלסטין-כבר שולב במספר החלבונים המלאכותיים, שישמש כתג טיהור, כמו גם להעניק תכונות מכאניות. חלבונים מלאכותיים המכילים רצף כמו אלסטין-יכולים להיות מטוהרים בקלות באמצעות ITC, אשר מבטל את הצורך בעמודות טיהור יקרות ונוגדנים.
פרוטוקול זה מתאר את השלבים לבניית פלסמידים רקומביננטי קידוד לחלבונים aECM. הגנים מקודדים לחזרות כמו אלסטין-נרכשו. לרצף הפפטיד חוזר מאוד כמו אלסטין כמו פוליפפטידים, מומלץ לתכנן את אסטרטגית השיבוט כזה שניתן להשתמש בי אסטרטגיות קשירה כיוונית רקורסיבית (RDL) 22. באמצעות RDL, פוליפפטידים חוזרים עם אורך שרשרת ספציפי יכולים להיות מסונתזים ולכן הגנים של עניין ניתן לרכוש כמונומרים קצרים.
בעבודה שלנו, תחומים מחייבים תא נועדו להכיל אתרי הגבלת איגוף NheI בשני הקצוות כדי לאפשר החלפה מודולרית של התחום מחייב תא המרכזי. חשוב לבחור אתרי הגבלה, כי הם ייחודיים ואינם נוכחים בתחום התפקודי או במקום אחר מחוץ לאתר מרובה השיבוט (MCS) של וקטור המארח. זה הוא להגביל את העיכול של הכנס או וקטור לאתרים המיועדים. במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך להציג אתרי הגבלה חדשים בוקטור המארח באמצעות mutagenesis לפני החדרת תחום הפונקציונלי.
שלנואסטרטגית שיבוט אפשרה לנו לשנות את תחום התא המרכזי מחייב להשיג שלוש גרסאות של חלבוני aECM בקלות. אנחנו גם ציינו כי הכנסת שאריות ליזין לאחר מתיונין מתחיל עלה תשואת חלבון על ידי יותר מ פי 10. עלייה דרמטית זו בתשואת חלבון הייתה בולטת ביותר עם LN-5 חלבון aECM, שבו תשואת החלבון הסופית עלתה מ 5 מ"ג / L 60 מ"ג / ליטר.
א השונים מארחי ביטוי coli הושוו, וBL21 (DE3) pLysS E. זן coli נתן תשואות החלבון הטובות ביותר. השיפור בתשואת חלבון היה מינימאלי, כאשר ביטוי חלבון היה מושרה עם IPTG ליותר מ -4 שעות. לא היה הבדל משמעותי בביטוי חלבון בריכוזים IPTG גדולים מ -1 מ"מ. עם זאת, ביטוי חלבון היה הגבוה ביותר כאשר מושרה בOD קרוב יותר ל -0.6.
להתאוששות יעילה של חלבוני aECM באמצעות ITC, חשוב לשים לב לטמפרטורה של מנגנון צנטריפוגות. לבחינהple, רוב השלבים לטיהור בוצעו בחדר קר (4 מעלות צלזיוס), כדי להבטיח מסיסות המרבית של חלבוני aECM. זה יכול להיות גם צורך מראש צינה ל( 4 ° C) O הרוטור צנטריפוגות / N לפני המחזור הקר. כמו כן, הרוטור צנטריפוגות היה מחומם מראש ל( 37 ° C) לפני המחזור החם כדי להבטיח שהטמפרטורה של פתרון החלבון נשמרה מעל T T.
לסיכום, הנהלים לעצב ופלסמידים רקומביננטי שיבוט קידוד חלבוני ECM מלאכותיים מתוארים. בפרט, הביטוי והטיהור של חלבוני aECM באמצעות ITC מפורטים. לבסוף, אפיון של חלבוני aECM באמצעות אלקטרופורזה SDS-PAGE ומערבי סופג תואר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות מימון ממשרד חינוך AcRF Tier 1 (RG41) ולהתחיל את המענק מהאוניברסיטה הטכנולוגית נניאנג. נמוך וTjin ממומנים על ידי מלגת סטודנט המחקר (RSS) מהאוניברסיטה הטכנולוגית נניאנג, סינגפור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET22b (+) | Novagen | 69744 | T7 expression vectors with resistance to ampicillin |
| BL21(DE3)pLysS | Invitrogen | C6060-03 | additional antibiotics - chloramphenicol |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction. |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | plasmid isolation kit |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Ampicillin | Affymetrix | 11259 | |
| Chloramphenicol | Affymetrix | 23660 | |
| Zymoclean™ gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | |
| XL10-gold strain | Agilent Technologies | 200315 |
References
- Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. Elastomeric biomaterials for tissue engineering. Prog Polym Sci. 38 (3-4), 584-671 (2013).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 352-366 (2011).
- Kushner, A. M., Guan, Z. Modular Design in Natural and Biomimetic Soft Materials. Angewandte Chemie International Edition. 50 (39), 9026-9057 (2011).
- Gagner, J. E., Kim, W., Chaikof, E. L. Designing protein-based biomaterials for medical applications. Acta Biomater. 10 (4), 1542-1557 (2014).
- Gomes, S., Leonor, I. B., Mano, J. F., Reis, R. L., Kaplan, D. L. Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering. Prog Polym Sci. 37 (1), 1-17 (2012).
- Werkmeister, J. A., Ramshaw, J. A. M. Recombinant protein scaffolds for tissue engineering. Biomedical Materials. 7 (1), 012002 (2012).
- MacNeil, S. Biomaterials for tissue engineering of skin. Materials Today. 11 (5), 26-35 (2008).
- Fong, E., Tirrell, D. A. Collective Cell Migration on Artificial Extracellular Matrix Proteins Containing Full-Length Fibronectin Domains. Advanced Materials. 22 (46), 5271-5275 (2010).
- Ratner, B. D., Bryant, S. J. BIOMATERIALS: Where We Have Been and Where We are Going. Annual Review of Biomedical Engineering. 6 (1), 41-75 (2004).
- Cai, L., Heilshorn, S. C. Designing ECM-mimetic materials using protein engineering. Acta Biomater. 10 (4), 1751-1760 (2014).
- Annabi, N., et al. Elastomeric recombinant protein-based biomaterials. Biochemical Engineering Journal. 77 (0), 110-118 (2013).
- Heilshorn, S. C., DiZio, K. A., Welsh, E. R., Tirrell, D. A. Endothelial cell adhesion to the fibronectin CS5 domain in artificial extracellular matrix proteins. Biomaterials. 24 (23), 4245-4252 (2003).
- Simnick, A. J., Lim, D. W., Chow, D., Chilkoti, A. Biomedical and Biotechnological Applications of Elastin-Like Polypeptides. Polymer Reviews. 47 (1), 121-154 (2007).
- Tjin, M. S., Chua, A. W. C., Ma, D. R., Lee, S. T., Fong, E. Human Epidermal Keratinocyte Cell Response on Integrin-Specific Artificial Extracellular Matrix Proteins. Macromolecular Bioscience. 14 (8), 1125-1134 (2014).
- MacNeil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Kariya, Y., et al. Differential regulation of cellular adhesion and migration by recombinant laminin-5 forms with partial deletion or mutation within the G3 domain of α3 chain. J Cell Biochem. 88 (3), 506-520 (2003).
- Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., Quaranta, V. The LG3 module of laminin-5 harbors a binding site for integrin α3Β1 that promotes cell adhesion, spreading, and migration. J Biol Chem. 276 (35), 33045-33053 (2001).
- Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Current Protocols in Protein Science. , 6.11.1-6.11.16 (2010).
- Keeley, F. Ch. 4. Evolution of Extracellular Matrix.Biology of Extracellular Matrix. , Springer. Berlin Heidelberg. 73-119 (2013).
- Le, D. H. T., et al. Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides. Biomacromolecules. 14 (4), 1028-1034 (2013).
- MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583 (2014).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
