Protocol
1. Kloning av rekombinante plasmider som koder for aECM Proteiner
- Utforme aminosyresekvensen av den funksjonelle domene (f.eks celle-bindende domene og elastin-lignende gjentagelser). Design restriksjonsseter flankerer endene av funksjonelle domener til rette sub-kloning ved hjelp av fri programvare i henhold til bruksanvisningen for programvaren (f.eks http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Her velger unike restriksjonsseter som ikke er til stede i den funksjonelle domene å begrense fordøyelsen til de tiltenkte områder. Velg restriksjonssetene som vises i multiple kloningssete (MCS) i verts vektor (f.eks pET22b (+)) for sub-kloning.
- Omvendt sette aminosyresekvens i nukleotidsekvensen ved å bruke frie nettsteder i henhold til programinstruksjoner. (F.eks http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Sørg kodonene er optimalisert for E. coli-verter.
- Gen av interesse kan være Purchased kommersielt som enkelt-trådede oligonukleotider (dvs. hvis oligonukleotidene <100 basepar (bp)) og utføre DNA gløding (se trinn 1.4) for å redusere kostnadene. Ellers for gener som er større enn 100 bp, de kan kjøpes gjennom kommersielle selskaper.
- DNA annealing av oligonukleotider
- Gløding DNA-oligomerer for å oppnå den ønskede gensekvensen. Oppløs DNA-oligonukleotider i en oligomer DNA-buffer (10 mM Tris: 2-amino-2- (hydroksymetyl) -propan-1,3-diol, pH 8,0, filtrert) til en sluttkonsentrasjon på 1 pg / pl.
- Tilsett 4 ul av hver oligomer i 32 ul av DNA-sammensmeltningsbuffer (10 mM Tris, 100 mM NaCl og 100 nM MgCl2) for å oppnå et totalt 40 pl blanding.
- Kok et begerglass med vann ved bruk av en varmeplate og dyppe blandingen i 5 min, 95 ° C. Fjern begeret og gradvis kjøles hele satt opp i en isoporboks O / N. Oligomerene har blitt glødet og er klar for fordøyelsen.
MERK: pET22b (+) plasmid vektor er ampicillin antibiotika-resistente og inneholder 6x His-tag ved C-terminus. Den 6x-His tag stede i pET22b (+) tillater oss å bruke Hans-merket antistoffer for å identifisere målet protein via western blotting i trinn 7. - Legg 6x lasting fargestoff til hver fordøyelsen blanding. Kjør fordøyelse blandinger hver for seg, inkludert en DNA-stige på 1,2% DNA agarosegeler inneholdende en UV-fluorescent DNA flekk i 1 time ved 100 V. visualisere DNA 1,2% agarose-gel med en UV-lys illuminator.
- Skjær gel til å trekke fordøyd DNA-produkter ved hjelp av kommersiell gel rensing kits. Elute ved hjelp av det minste volum for kolonnen for å oppnå et minimum DNA-konsentrasjon på 50 til 100 ng / mL.
- Kombiner genet av interesse sekvensielt ved å ligere det spaltede DNA-innskuddet (dvs., elastin gjentar eller cellebindende domener oppnådd ved DNA annealing) inn i plasmid-vektoren ved anvendelse av T4-ligase ved hjelp av følgende oppskrift: (2 ul vektor, 1 pl av T4-ligase, 1,5 ul T4 ligeringsbuffer, x pl innsats, 10,5-x pl vann for totalt 15 pl blanding). Inkuber ringsblandingen ved romtemperatur i 2 timer.
MERK: Molar konsentrasjon av vektoren for å sette inn bør varieres for å optimalisere effektiviteten ligering. Volum av innsatsen beskrevet som x i oppskriften er avhengig av det eluerte DNA-konsentrasjonen fra trinn 1.7. - Thaw E. coli DH5a kjemisk kompetente celler (eller en hvilken som helst kloning belastning) på is. Varm 2 x YT agarplater (Tabell 1) inneholdende ampicillin (25 ug / ml) til 37 ° C.
- Transformere celler ved hjelpheat shock:
- Delmengde 50 mL av kompetente celler i rene, pre-kjølte mikro-sentrifugerør. Pipetter 5 ul (fra 100 pg til 100 ng) av ligeringsblandingen inn i cellene, pipettering forsiktig opp og ned for å blande. La blandingen på is i 20 min.
- Dypp mikro-sentrifugerør inneholdende celleblandingen i et 42 ° C vannbad i 2 minutter og vendte tilbake til på is i 2 min. Tid nedsenking varighet for å minimere varmeskader på cellene.
- Legg 500 pl SOC-medium (tabell 1) inn i mikro-sentrifugerør og inkuber ved 37 ° C med risting i 1 time.
- Spre 50 500 pl av celle / ligeringsblandingen på en 2 x YT agar-plate som er blitt pre-oppvarmet til romtemperatur, inneholdende ampicillin (25 ug / ml) og inkuber platene opp ned på 37 ° CO / N (12-16 timer) .
- Neste dag, plukke DNA kolonier fra agar plate ved hjelp av rene pipettespisser. Grow koloniene i 5 ml 2YT media (Tabell1) inneholdende ampicillin (25 ug / ml) O / N ved 37 ° CO / N (12-16 timer) med risting (225 rpm).
- Dagen etter, bruk en plasmid isolasjon kit for å trekke ut DNA plasmider for hver koloni plukket henhold til produsentens protokoll. Elueres DNA med 50 ul vann.
- Utføre en test fordøye med restriksjonsenzymer ved hjelp av følgende oppskrift: (5 ul DNA, 0,2 ul av hver restriksjonsenzym, 1 pl 10 x restriksjonsenzymbuffer og topp opp vann for totalt 10 pl blanding), inkuber i 2 timer ved 37 ° C til skjermen for kolonier som sannsynligvis inneholder innsatsen og kjøre på 1,2% DNA agarosegel som i trinn 1.6.
MERK: Ved fordøyelse, en vellykket ligering bør resulterer i to bånd, ett for hver vektor, og innsatsen, som svarer til deres respektive molekylvekt (figur 1). - Send sann kolonier for DNA-sekvensering ved hjelp av T7 promoter forover og bakover primere til kommersielle sequencere.
- Fra sekvense resultat, velger en koloni som har blitt ligert og bruke DNA-plasmid for transformasjon inn i en E. coli uttrykk vert.
- Thaw E. coli-ekspresjonsstamme (BL21 (DE3) pLysS) på is. I mellomtiden, varme-agar-plater inneholdende ampicillin (25 ug / ml) og kloramfenikol (34 ug / ml) til RT.
MERK: pLysS plasmid stede i bakterier stamme BL21 (DE3) pLysS inneholder en kloramfenikol motstand genet. Den pLysS-plasmidet inneholder en T7-repressor-genet, som uttrykkes konstitutivt å begrense utett ekspresjon av aECM protein. Kloramfenikol er nødvendig for å velge for bakterieceller som inneholder pLysS under kultur. - Gjenta steg 1,10 til skaffe forvandlet E. coli-celler som er klar til å uttrykke den kunstige proteiner. Pakk agarplatene i Parafilm og lagre opp-ned i fire 6 C i opptil en måned.
3. Bakteriell Expression of aECM Proteiner
- Se figur 2, velge en koloni fra den transform agar-plate med en pipettespiss og inokuler i 10 ml sterilt Terrific Broth (TB) medium (Tabell 1) inneholdende både ampicillin og kloramfenikol antibiotika i et reagensrør. Inkuber denne startkultur ved 37 ° CO / N (12-16 timer) med risting ved 225 rpm.
- Overfør 10 ml av startkulturen i 1 liter friskt TB og sterile media supplert med de samme antibiotika i en 3 l Erlenmeyerkolbe. Inkuber kulturen ved 37 ° C med risting ved 225 rpm i 2-3 timer og observer den optiske tetthet av kulturen (OD600) nådde 0,6 til 0,8 ved å pipettere 1 ml av kulturen til en tom kyvette for lesing. Lagre en ml kultur før induksjon for SDS-PAGE karakterisering.
- For å måle OD 600 av cellekulturen, forberede en ampulle av TB medier i en kyvettefor en blank måling. Separat, overføre 1 ml kultur fra dyrkningskolben inn i en ny tom kyvette. Måle den optiske tetthet av kulturen ved hjelp av et spektrofotometer mot blindprøve ved en absorbans på 600 nm.
- Sett av prøven (for påfølgende SDS-PAGE-analyse) ved å overføre 1 ml av kulturen prøve til en 1,5 ml mikrosentrifugerør, sentrifuger ved 12 000 xg i 2 min, og dekanter supernatanten.
- Indusere kulturen med isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) til en endelig konsentrasjon på 1 mM og inkuberes ved 37 ° C med risting ved 225 rpm i ytterligere 4 timer. Lagre 1 ml av kulturen i slutten av induksjon ved 4 timer etter SDS-PAGE karakterisering.
- Høste cellene ved å overføre kulturen til en L-sentrifugeflasker og sentrifuger ved 12 000 xg i 30 min ved 4 ° C. Kast supernatanten, veie cellepelletene og resuspender i TEN buffer (1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl, pH = 8,0) ved 0,5 g / ml.
4. lysis av bakteriekulturer
- Fryse den re-suspendert cellekultur ved -80 ° CO / N. Tine frosne cellekultur i et vannbad ved romtemperatur eller på is for å lysere cellene. Tilsett 10 ug / ml deoksyribonuklease I (DNase I), 10 ug / ml ribonuklease A (RNase I), og 50 ug / ml fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), mens tining og homogenisere oppløsningen med langsom omrøring.
- Etter at alle resuspenderte celler tines, justere løsningen til pH 9,0 for å øke proteinløseligheten i vann 12. Tilsett 6 N NaOH dråpevis under omrøring på is for å oppnå en homogen konsistens. Lyse ved ultralyd avbrudd i 20 minutter på is ved å bruke en 2 mm diameter flat spiss, 5 sek puls.
- Sentrifuger celleløsning ved 12 000 xg i 30 min ved 4 ° C. Overfør supernatanten til et rent, tom flaske og oppbevar ved 4 ° C for rensing senere.
- Samtidig cellepelleten suspenderes på nytt med TEN buffer og re-fryse ved -80 ° C. Tilfullstendig cellelyse, gjenta fryse / tine og sonikasjonsprosessen opptil tre ganger. Spar 20 mL cellelysat for SDS-PAGE karakterisering.
5. Rensing av aECM Proteiner Bruke Inverse Transition Sykling
- Sammenstille cellelysatet fra trinn 4.3 og fortsett å rense aECM proteiner ved anvendelse av ITC, lik den som brukes for rensing av elastin-baserte 21 proteiner. Sykluser vil bli utført med de forskjellige temperaturer som er 4 ° C (referert til som "kald") og 37 ° C (referert til som "varm") sykluser respektivt.
- Splitte cellelysatet til 50 ml sentrifugerør, og sentrifuger ved 40.000 xg i 2 timer ved 4 ° C. Utseendet på cellepellet skal være mørk brun og ser rennende.
- Fjern supernatanten ved pipettering for å få en ren atskillelse fra pelleten. Samle supernatanten i ren sentrifugeflasker og legge NaCl til en sluttkonsentrasjon på 1 M (til et maksimum på 3 M). Varmløsningen på 37 ° C i 2 timer med risting ved 225 rpm.
MERK: Tilsetning av NaCl vil utløse overgangen av elastin komponenten av aECM forårsaker aggregering. Supernatanten vil slå grumset. Hvis proteinkonsentrasjonen er høy nok, kan hvit skummende protein ses på sidene av sentrifugeflaske. - Sentrifuger supernatanten fra trinn 5,3 ved 40.000 xg i 2 timer ved 37 ° C. Dekanter supernatanten. Knus pellet ved hjelp av en metallspatel og resuspender pelleten i biter iskaldt autoklaveres destillert vann (50 mg / ml) med kraftig omrøring O / N ved 4 ° C ved anvendelse av en magnetisk rørestav og plate. Pelleten må være fullstendig oppløst.
- Gjenta trinn 5.2 til 5.4 i ytterligere tre til fem ganger for å oppnå en høyere renhet av proteinet.
- Etter den siste syklus av rensing, avsalte proteinoppløsningen ved å dialysere den mot destillert vann ved 4 ° C. Dialyser protein løsning mot vann i 2-3 dager med endringer i vann hver 4hr eller 8 timer for O / N. Lagre 20 ul av det rensede protein for SDS-PAGE og lyofilisere resten av det rensede protein og oppbevar ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
6. Karakterisering av aECM Proteiner Bruke SDS-PAGE elektroforese
- Tilbered en 12% SDS-PAGE-gel (hvis molekylvekten er stor, å bruke 8% SDS-PAGE-geler for bedre separasjon). Legg 2x SDS ladningsbuffer til hver prøve, varme opp prøvene i 10 minutter ved 100 ° C og kjøre prøvene på gelen i 1 time ved 100 V eller til proteinet stigen svarende til molekylvekten av proteinet aECM når midten av gel.
- Hente gel fra SDS-PAGE sette opp og legge Coomassie Brilliant Blue flekk (tabell 2) med et volum å senke gel for en time i en petriskål. Skyll gel i en avfarging oppløsning (tabell 2) i 5 minutter på en vugge. Endre avfarging løsning, og fortsette å destain gelen med gående til bakgrunnen for than gel blir klart. Proteinbånd skal være godt synlig.
- Sammenligne posisjonen til målproteinet mot proteinet stigen for å bestemme molekylvekten av målproteinet.
- For å bekrefte tilstedeværelsen av målproteinet ytterligere, utføre Western-blotting som i trinn 7.
7. Karakterisering av aECM Proteiner Bruke Western Blotting
- Kjør prøvene på en 12% SDS-PAGE gel som i § 6 uten flekker.
- Kutt nitrocellulosemembran til en størrelse litt større enn SDS-PAGE gel. Skjær fire stykker av filterpapir til samme størrelse.
- Våt ett stykke av filterpapir med Western overføringsbuffer (20% volum / volum metanol, 25 mM Tris, 190 mM glysin, pH 8,3), sett SDS-PAGE gel på toppen av filterpapir, etterfulgt av et stykke filterpapir Da nitrocellulosemembranen og en avsluttende andre to stykker av filterpapir. Sikre at hele oppsettet er under vann med tilstrekkelig vestlig overføringsbuffer.
MERK: gelen og membranen bør ikke være i kontakt på dette tidspunkt proteiner som kan bindes til membranen ved kontakt. - Overfør proteinene skje på nitrocellulosemembran ved å plassere to filterpapir i en western halvtørr overføringsenhet, etterfulgt av nitrocellulosemembran, og nøye plasser SDS-PAGE-gel i og på membranen, til slutt plassere siste to vått filterpapir SDS-PAGE gel. Kjør den vestlige overføring på 45 mA, 30 min. Legg buffer hvis spenningen er høyere enn 30 V.
MERK: Fortrinnsvis plasserer SDS-PAGE gel på membranen med ett forsøk og unngå å forskyve gelen unødvendig på membranen som proteiner kan bindes til membranen ved kontakt. - Hente og blokkere nitrocellulosemembranen med blokkeringsløsning (5% ikke-fettholdig melk i PBS pH 7,4, filtrert med filterpapir) i 2 timer ved RT. Avhende blokkeringsbuffer og legge PBS å skylle.
MERK: Bytt til nye hansker for å unngå forurensing membranen med uønsket beskyttins. - Inkuber primære anti-His-antistoff med fortynning i PBS ved 1: 1000 ved RT i 1 time med gynge. Lag en blanding i et volum som kan senke hele membranen, for eksempel med fortynningsforholdet 1: 1000, tilsett 1 pl antistoff (lager konsentrasjon: 1 mg / ml) til 999 ul PBS i en 1 ml total blanding.
- Skyll membranen med 5 ml PBST (PBS med 0,1% Tween 20).
- Inkuber med sekundært antistoff konjugert til pepperrot-peroksidase (HRP) med fortynning i PBS ved 1: 5000 ved RT i 1 time med gynge. Lag en blanding i et volum som kan senke hele membranen, for eksempel med fortynningsforholdet 1: 5000, tilsett 1 pl antistoff (lager konsentrasjon: 1 mg / ml) til 4999 mL PBS i en 5 ml total blanding.
- Vask membranen med 5 ml PBST, og gjentar to ganger.
- Anvende den kjemiluminescerende substrat til membranen med et volum til å dekke membranen og inkuber ved å følge instruksjonene til substratet benyttet.
MERK: Underlaget følsomhet for protein deteksjon kan variere, anbefaler vi et substrat med maksimal følsomhet for svært lave signaler i tilfelle øke antistoffkonsentrasjonen øker ikke signaler. - Fange kjemiluminiscerende signaler ved hjelp av en CCD-kamera basert imager. Juster den primære og sekundære antistoff fortynningsforhold hvis signalene er svake og ikke-spesifikke. Inkuber lenger i blokkeringsløsning hvis bakgrunnssignalet er høyt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I utformingen av fusjonsproteiner inneholdende elastin-lignende gjentagelser, er det viktig å opprettholde en samlet elastin innhold, stor nok andel av fusjonsproteinet 18. Dette er for å sikre at fusjonsproteinet konstruksjon beholder sine elastin-lignende egenskaper, for å kunne bruke ITC for rensing. Den aECM proteiner design og sekvenser som er beskrevet i denne delen ble spesielt tatt fra arbeid av Tjin et al. 14. I dette arbeidet ble tre aECM proteiner lykkes klonet inn i pET22b (+) uttrykk vektor. Sekvensiell ligation først begynte med å ligere elastin gjentar sette inn i pET vektor, etterfulgt av å sette inn cellebindingsdomene. Endelig er det siste settet av elastin gjentar ble innsatt ved den terminale ende av cellebindende domene til ved hjelp av samme metode. For å kontrollere om de rekombinante gener har blitt konstruert, hver rekombinant plasmid ble test fordøyd med XhoI og Sali for 3 timer ved 37 °C. Figur 1 viser DNA-innskuddet og vektor band etter testen fordøyelsen. For hver av de aECM proteiner, størrelsen av innsatsene samsvarer med størrelsen av genet, noe som bekrefter at kloning faktisk var vellykket. Ytterligere bekreftelse gjennom DNA-sekvensering også bekreftet test fordøyelsen resultater.
Vi var i stand til å rense aECM proteinene gjennom ITC gis tilstrekkelig elastin innhold tilstede i hver aECM protein. Figur 2 viser skjematisk av den totale renseprosessen. O / N-kultur ble inokulert i en ristekolbe l med en typisk start OD600 på 0,01. Kulturen vokste til OD 600 av 0,6-0,8 etter 3-4 timer. Protein-ekspresjon ble indusert ved anvendelse av 1 mM IPTG. Etter 4 timer er typisk OD på 1,5 oppnådd. Den bakteriekultur ble høstet og underkastet sentrifugering. Supernatanten ble kastet og cellepelleten ble veiet. Den gjennomsnittlige vekten av cellepelleten var omtrent 3 g / literkultur. Pelleten ble resuspendert i TEN buffer og frosset ved -80 ° CO / N.
En serie av fryse / opptiningssykluser ble brukt for å lysere cellene. Den fryse-tine-trinn fører til at cellen til å svelle og krympe til slutt å bryte på grunn av iskrystaller som dannes under fryseprosessen. Deretter DNase I og RNase I ble tilsatt til cellelysatet å fordøye alle DNA og RNA. PMSF er en protease-inhibitor, som også ble tilsatt til cellelysatet å minimalisere proteinnedbrytingen. For ytterligere å sikre fullstendig cellelyse, ble lysatet ytterligere sonikert mens holdt på is.
Cellelysatet ble deretter utsatt for tre sykluser med ITC rensing. Ved slutten av de tre sykluser, pelleten ved enden av den varme syklusen lignet honning i konsistens og hadde en svak gul farge. Pelleten viste transparente ved kontakt med vann, og lett oppløses i pre-avkjølt vann autoklaveres med risting. Det rensede protein ble dialysert for å fjerne eventuelle gjenværende salt. Proteinløsningen som oppnås ved slutten av den siste syklus varme ble overført til en kort lengde av dialyserør (med 12 kDa molekylvekt cut off). Ved slutten av dialyse ble proteinoppløsningen overføres til et rent 50 ml sentrifugerør og frosset ved -20 ° C. Den neste dag, den frosne proteinoppløsningen ble lyofilisert for å fjerne vanninnholdet. Figur 3 viser et bilde av den dialyserte protein, som har en typisk ull-lignende utseende.
For å fastslå om protein-ekspresjon ble indusert faktisk ble prøver oppsamlet før og etter induksjon ble analysert ved SDS-PAGE elektroforese. Her, 12% SDS-PAGE-gel var tilstrekkelig til å separere proteiner med molekylvekter på 20-150 kDa. I det tilfelle at molekylvekten er stor, det vil si,> 100 kDa, 8% SDS-PAGE-geler kan brukes for å bedre proteinseparasjon. Figur 4 viser en intens proteinbånd ved den forutsagte molekylvekt i den induserte SAmple (spor 2). Vanligvis ble SDS-PAGE analyse utført umiddelbart etter protein expression før rensing starter. Deretter ble prøver tatt gjennom renseprosessen kan også analyseres ved hjelp av SDS-PAGE-elektroforese for å sikre effektiv rensing av målproteinet. Figur 4 viser også en SDS-PAGE-gel inneholdende et renset protein prøve med en molekylvekt på 22 kDa (felt 4 ), svarende til LN-5 aECM 14. Estimert renhet aECM proteinene var omtrent 90% -95%; denne verdi ble utledet ved å sammenligne forhold av båndintensitetene av målproteinet og andre proteinbånd som er tilstede på SDS-gel (figur 4, spor 4). Til slutt, for å bestemme om det rensede protein var faktisk aECM proteinene, ble Western blotting utført. Deretter ble MALDI-TOF også utført for å bestemme nøyaktig den forurensningsinnholdet i det rensede materialet. 14 Figur 5 viser protein renhet the tre aECM proteiner med en SDS-PAGE-gel i figur 5A, og til å sammenligne et bilde av den nitrocellulosemembran for Western-blotting på figur 5B, som viser tilstedeværelsen av målproteinene Col-IV aECM og LN-5 aECM, merket ved hjelp av anti -6x His-tag antistoffer konjugert med hest-reddik (HRP). De endelige utbytter av proteinene aECM varierte mellom 60 mg / l til 120 mg / l.
Figur 1. DNA agarosegelelektroforese av aECM proteiner. Verifikasjon av endelige aECM protein DNA konstruerer gjennom restriksjonsenzymer fordøyelsen kjørte på 1,2% DNA agarosegel. Rekombinante plasmider som koder for hver av de aECM proteiner ble dobbeltfordøyet med Xhol og Sall i 3 timer ved 37 ° C. Størrelsene på innsatsene tilsvarer størrelsen på hver aECM protein gen (FN910: 1.8kbp, Col-IV: 696 bp, LN-5: 699 bp), og størrelsen på vektoren pET22b (+) som anvendes er 5,5 kbp.
Figur 2. Skjematisk strømmer for proteinekspresjon, lysis og rensing av proteiner aECM. Den grunnleggende guide for rekombinant proteinekspresjon, fra inokulering av en enkelt koloni til små kultur og skalere opp til 1 liter kultur, høsting og resuspendering av celler, etterfulgt av protein lyse. Proteinrensing ble utført ved hjelp av LCST oppførsel av elastin-lignende domener som er tilstede i de kunstige ECM-proteiner. De aECM proteiner blir renset via ITC. Flere kalde og varme ble utført for å oppnå en høy renhet av målproteinet. Endelig ble målproteinet dialyseres med vann og frysetørkes inntil videre anvendelse. "O / N" = over natten. "S / n" = supernatant.
Figur 3. Bilde av frysetørret aECM protein renset ved Inverse Transition Sykling. Lyofiliserte LN5-aECM har en ull-lignende utseende.
Figur 4. SDS-PAGE-gel elektroforese av aECM protein (LN-5 aECM). Spor 1 og 2 viser kultur før og etter induksjon protein. Tilstedeværelse av et tykt bånd nær 22 kDa viser at LN-5 aECM ble vellykket uttrykt. Kolonne 3 viser hele cellelysatet mens felt 4 viser den rensede LN-5 aECM protein etter 3 sykluser med ITC.
Figur 5. (A) SDS-PAGE-gel av aECM proteiner. (B) Western blot undersøkt for 6x His-tag for Col-iv Og LN-5 aECM proteiner. Begge Col-IV og LN-5 aECM proteiner inneholder C-terminalen 6xHis-tag. Positive kjemiluminescens observert ved den forutsagte molekylvekt på 22 kDa for prøve LN-5 aECM og 24 kDa for prøve Col-IV aECM representerer 6x His-tag er tilstede i det rensede protein.
| Media / L | Komponenter og instruksjoner |
| SOC media | 20 g Tryptone |
| 5 g Gjærekstrakt | |
| 0,6 g NaCl | |
| 0,2 g KCl | |
| Legg til og autoklav i 940 ml vann, | |
| deretter legge steril (filter sterilisert) | |
| 10 ml 1 M MgCl2 | |
| 10 ml 1 M MgSO4 | |
| 40 ml 20% glukose | |
| 16 g Tryptone | |
| 10 g Gjærekstrakt | |
| 5 g NaCl | |
| 15 g Bacto Agar (tillegg bare for agar plate) | |
| Oppløses i vann og fylle opp til en L og autoklav. | |
| For å forberede agarskåler, kule til 55 ° C før tilsetning av antibiotika. | |
| Bland godt før du helle i petriskål. | |
| Kule platene før agar er stivnet. | |
| Pakk plater i Parafilm og lagre opp-ned i fire ° C. | |
| Terrific buljong (TB) | 12 g Tryptone |
| 24 g Gjærekstrakt | |
| 4 ml Glyserol | |
| Oppløses i 700 ml vann og autoklav. | |
| 16,42 g K 2 HPO 4(Merck) | |
| 2,31 g KH 2PO 4 (Merck) | |
| Oppløses i 300 ml vann og autoklav separat, for å sikre at saltene er fullstendig oppløst. | |
| Kombinere både medium og salter etter avkjøling. |
Tabell 1. Oppskrifter på SOC media, 2xYT media / agar og Terrific buljong. Media for E. coli kultur brukes i molekylær kloning og protein uttrykk.
| Løsning / L | Komponenter og instruksjoner |
| Coomassie Brilliant Blue flekken | 0,25 g Coomassie blueR250 |
| 100 ml Iseddiksyre | |
| 450 ml metyl alkohol | |
| 450 ml vann | |
| 100 ml Iseddiksyre | |
| 400 ml metyl alkohol | |
| 500 ml vann |
Tabell 2. Oppskrifter på løsninger for å flekke og destain SDS-PAGE gel. Coomassie Brilliant Blue R250 til farging og avfarging løsning for karakterisering ved hjelp av SDS-PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rekombinant protein engineering er en allsidig teknikk for å skape nye protein materialer ved hjelp av en bottom-up tilnærming. De protein-baserte materialer kan være konstruert for å ha flere funksjoner, skreddersydd i henhold til anvendelsen av interesse. På grunn av økende utvikling i kloning og proteinekspresjon teknologi er det blitt forholdsvis enkel (og kostnadseffektivt) for å skape en rekke kunstige proteiner på en reproduserbar og skalerbar måte. Den elastin-lignende domene er blitt innarbeidet i en rekke kunstige proteiner, for å tjene som en rense tag, samt for å gi mekaniske egenskaper. Kunstige proteiner som inneholder en elastin-lignende sekvens kan lett renses ved hjelp av ITC, noe som eliminerer behovet for kostbare rense kolonner og antistoffer.
Denne protokollen beskriver fremgangsmåten for å konstruere rekombinante plasmider som koder for aECM proteiner. Gener som koder for de elastin-lignende gjentar ble kjøpt. Forsterkt repeterende peptid-sekvens som elastin som polypeptider, er det anbefalt å utforme kloningsstrategien slik at rekursive retningsbestemt ligerings (RDL) strategier kan brukes 22. Ved å bruke RDL, kunne repetitive polypeptider med en bestemt kjedelengde syntetiseres og derfor gener av interesse kan kjøpes som korte monomerer.
I vårt arbeid, ble cellebindende domener er utformet for å inneholde flankerer NheI restriksjonsseter i begge ender for å tillate modul bytte av det sentrale cellebindende domene. Det er viktig å velge restriksjonsseter som er unike og ikke er tilstede i den funksjonelle domene eller et annet sted utenfor det multiple kloningssete (MCS) i vertsvektor. Dette er for å begrense nedbrytning av innsatsen eller vektor til de tilsiktede områder. I noen tilfeller kan det være nødvendig å innføre nye restriksjonsseter i vertsvektor ved hjelp av mutagenese før innsetting av den funksjonelle domenet.
Vårkloning strategi tillater oss å lett endre den sentrale cellebindende domene for å oppnå tre varianter av aECM proteiner. Vi har også bemerket at innføring av en lysinrest etter start Metionin økte proteinutbytte med mer enn 10 ganger. Denne dramatiske økning i proteinutbytte var mest tydelig med LN-5 aECM protein, hvor den endelige proteinutbytte økes fra 5 mg / l til 60 mg / l.
Various E. coli-ekspresjonsverter ble sammenlignet, og BL21 (DE3) pLysS E. coli stamme ga de beste proteinutbytter. Forbedringen i Proteinutbyttet var minimal ved protein-ekspresjon ble indusert med IPTG i mer enn 4 timer. Det var ingen signifikant forskjell i proteinekspresjon ved IPTG-konsentrasjoner som er større enn 1 mm. Imidlertid var protein ekspresjon høyest når de induseres ved OD nærmere 0,6.
For effektiv gjenvinning av aECM proteiner ved anvendelse av ITC, er det viktig å merke seg at temperaturen i sentrifugen anordningen. For eksamenpel fleste rensetrinn ble utført i et kaldt rom (4 ° C) for å sikre maksimal løselighet av de aECM proteiner. Det kan også være nødvendig å forhåndskjøle til (4 ° C) sentrifugerotoren O / N før den kalde syklusen. Likeledes sentrifugerotoren var forhåndsoppvarmet til (37 ° C) før den varme syklus for å sikre at temperaturen i proteinoppløsningen ble opprettholdt over sin T t.
I sammendraget, til prosedyrene designe og klone rekombinante plasmider som koder kunstige ECM proteiner er beskrevet. Spesielt er ekspresjon og rensing av proteiner ved anvendelse av aECM ITC skissert. Endelig karakterisering av de aECM proteiner ved anvendelse av SDS-PAGE-elektroforese og Western-blotting ble beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke midler fra Kunnskapsdepartementet AcRF Tier 1 (RG41) og starte opp bevilgning fra Nanyang Technological University. Lav og Tjin er finansiert av Forsknings Student Scholarship (RSS) fra Nanyang Technological University, Singapore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET22b (+) | Novagen | 69744 | T7 expression vectors with resistance to ampicillin |
| BL21(DE3)pLysS | Invitrogen | C6060-03 | additional antibiotics - chloramphenicol |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | 1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction. |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | plasmid isolation kit |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Ampicillin | Affymetrix | 11259 | |
| Chloramphenicol | Affymetrix | 23660 | |
| Zymoclean™ gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | |
| XL10-gold strain | Agilent Technologies | 200315 |
References
- Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. Elastomeric biomaterials for tissue engineering. Prog Polym Sci. 38 (3-4), 584-671 (2013).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 352-366 (2011).
- Kushner, A. M., Guan, Z. Modular Design in Natural and Biomimetic Soft Materials. Angewandte Chemie International Edition. 50 (39), 9026-9057 (2011).
- Gagner, J. E., Kim, W., Chaikof, E. L. Designing protein-based biomaterials for medical applications. Acta Biomater. 10 (4), 1542-1557 (2014).
- Gomes, S., Leonor, I. B., Mano, J. F., Reis, R. L., Kaplan, D. L. Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering. Prog Polym Sci. 37 (1), 1-17 (2012).
- Werkmeister, J. A., Ramshaw, J. A. M. Recombinant protein scaffolds for tissue engineering. Biomedical Materials. 7 (1), 012002 (2012).
- MacNeil, S. Biomaterials for tissue engineering of skin. Materials Today. 11 (5), 26-35 (2008).
- Fong, E., Tirrell, D. A. Collective Cell Migration on Artificial Extracellular Matrix Proteins Containing Full-Length Fibronectin Domains. Advanced Materials. 22 (46), 5271-5275 (2010).
- Ratner, B. D., Bryant, S. J. BIOMATERIALS: Where We Have Been and Where We are Going. Annual Review of Biomedical Engineering. 6 (1), 41-75 (2004).
- Cai, L., Heilshorn, S. C. Designing ECM-mimetic materials using protein engineering. Acta Biomater. 10 (4), 1751-1760 (2014).
- Annabi, N., et al. Elastomeric recombinant protein-based biomaterials. Biochemical Engineering Journal. 77 (0), 110-118 (2013).
- Heilshorn, S. C., DiZio, K. A., Welsh, E. R., Tirrell, D. A. Endothelial cell adhesion to the fibronectin CS5 domain in artificial extracellular matrix proteins. Biomaterials. 24 (23), 4245-4252 (2003).
- Simnick, A. J., Lim, D. W., Chow, D., Chilkoti, A. Biomedical and Biotechnological Applications of Elastin-Like Polypeptides. Polymer Reviews. 47 (1), 121-154 (2007).
- Tjin, M. S., Chua, A. W. C., Ma, D. R., Lee, S. T., Fong, E. Human Epidermal Keratinocyte Cell Response on Integrin-Specific Artificial Extracellular Matrix Proteins. Macromolecular Bioscience. 14 (8), 1125-1134 (2014).
- MacNeil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Kariya, Y., et al. Differential regulation of cellular adhesion and migration by recombinant laminin-5 forms with partial deletion or mutation within the G3 domain of α3 chain. J Cell Biochem. 88 (3), 506-520 (2003).
- Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., Quaranta, V. The LG3 module of laminin-5 harbors a binding site for integrin α3Β1 that promotes cell adhesion, spreading, and migration. J Biol Chem. 276 (35), 33045-33053 (2001).
- Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Current Protocols in Protein Science. , 6.11.1-6.11.16 (2010).
- Keeley, F. Ch. 4. Evolution of Extracellular Matrix.Biology of Extracellular Matrix. , Springer. Berlin Heidelberg. 73-119 (2013).
- Le, D. H. T., et al. Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides. Biomacromolecules. 14 (4), 1028-1034 (2013).
- MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583 (2014).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
