Introduction
منذ عام 1973 كان نموذج زرع الكلى في الفئران أداة بحث قيمة، ولكن أعاقت المسائل التقنية استخدامه على نطاق واسع. على مر السنين العديد من الصحف قد نشرت تفصيل التحسينات / التحسينات على هذا الإجراء. كنموذج للأوعية دموية في المقام الأول زرع الأعضاء الصلبة هذا الإجراء هو على الارجح في المرتبة الثانية بعد منتبذ نموذج زرع القلب الذي ابتكر أيضا من قبل المختبر روسيل في 1973 6. كلا النموذجين تصلح للبحث في الاستجابات رفض خيفي، وتطوير وظيفة الكسب غير المشروع تأخر وإصابة نقص التروية ضخه.
واحدة من القضايا الأكثر شيوعا ليتم الإبلاغ مع زرع الكلى هي معدلات عالية نسبيا من تخثر الشرايين 4،5،7 التي مررنا بها أيضا في مختبرنا. لذلك شرعنا في إجراء استعراض أدبيات تشكيل خثرة وربما العثور على سبب هذه المشكلة التقنية ووضع أيضاحل ممكن. السبب الأكثر احتمالا لتجلط الدم هو مسار متعرج إلى حد ما يأخذ الدم من الشريان الأورطي المتلقي، في الشريان الأورطي الكلوي المانحة ثم إلى الشريان الكلوي المانحة. هذا المسار يسبب اضطرابات في الشريان الكلوي الذي يمكن أن يؤدي إلى تنشيط صفائح الدم وتشكيل خثرة. استنادا إلى الملاحظات الأخيرة والبحث من المؤلفات ذات الصلة 8-14 توصلنا مع تقنية جديدة التي قللت تجلط الدم إلى 0٪.
تقنية الموضحة هنا تختلف من التقنيات ذكرت سابقا في تشكيل الشرايين الكعب والقدم صفعة المرافق التي تحسن تدفق الدم ويقلل بشكل ملحوظ تشكيل خثرة. وشكلت صفعة بقسمة الشريان الأورطي الأشعة تحت الكلى في وجه الفوهة الشرايين الكلوية في زاوية أقل من 45 درجة إلى المحور الطولي من الشريان الأبهر (الشكل 1A و 1B). هذه النتائج في الكفة تقريبا 2mm و في الطول. يتم تشكيل كاريل التصحيح وريدي من قبل transecting صالوريد ENAL في IVC وبالتالي زيادة قطر الكفة. والأشعة تحت الكلى المانحة البطن الشريان الأورطي الكعب والقدم صفعة هو anastomosed نهاية إلى الجانب إلى الشريان الأورطي البطني المستفيدة والوريد الكلوي المانحة / IVC التصحيح هو anastomosed نهاية إلى الجانب إلى المستلم في البطن الأجوف السفلي الأجوف (IVC) . ثم يتم عرض الحالب إلى ويرتكز إلى المثانة كما وصفها هان وآخرون 3.
لهذه الدراسة زراعة غير المعالجة مع أوقات نقص التروية الدافئ فقط (أي، لا نقص التروية الباردة) ومقارنة. في هذه الحالة يشير نقص التروية الدافئ إلى الوقت من وقف تدفق الدم عبر الكلى المانحة (الخطوة 1.11 أدناه) وضخه من الكسب غير المشروع في المتلقي (الخطوة 2.11 أدناه). يشير نقص التروية الباردة إلى الوقت الذي الكلى لا perfused ويتم الاحتفاظ في التخزين البارد حتى بداية إجراء عملية الزرع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم شراء جميع الفئران من مختبر جاكسون (بار هاربور، ME)، ويوجد تحت ظروف خالية الممرض في جامعة كولورادو دينفر، مرفق مركز باربرا ديفيس الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة وبموافقة من جامعة كولورادو دينفر IACUC.
1. المانحة الكلى الحصاد
- تعقيم جميع الأدوات، وارتداء القفازات المعقمة في جميع أنحاء الداخلي والحفاظ على مجال معقم. أداء جميع العمليات الجراحية باستخدام مجهر التشغيل.
- جراحيا إزالة الكلى الماوس المانحة من-تخدير بنتوباربيتال (60mg / كغ IP) الجهات المانحة. تأكد عمق التخدير بواسطة إصبع القدم قرصة، ومراقبة معدل التنفس.
- مقطع الفراء ثم لشل حركة الماوس بنسبة 4 في اتجاه والقيود. تحضير الجلد مع بوفيدون اليود وثنى الماوس بطريقة عقيمة.
- جعل 2 سم خط الوسط شق البطن الرأسي ودخول تجويف البطن. سحب الأمعاء متفوق وتخريج ذلكإلى صدره. الحفاظ على الأمعاء ملفوفة في الشاش المعقم رطبة طوال الإجراء.
- تحديد هوية السفن البطن كبيرة وتعبئتهم، وتحديد أي فروع أسفل الظهر وإما يكوي أو ligate لهم 10/0 النايلون خياطة.
- على الفور البعيدة في الأوعية الكلوية اليسرى ندف الوريد الأجوف السفلي (IVC) والشريان الأورطي البطني (AA) وبصرف النظر عن طريق تشريح حادة على مدى ما يقرب من 2mm و. Ligate مع 10/0 النايلون وتقسيم الشرايين الصغيرة وفروع وريدية من الأوعية الكلوية.
- الآن فصل الوريد الكلوي من الشريان الكلوي بعناية من قبل تشريح حادة من هذه الهياكل. وهذا يسمح لخلق دقيق للرقعة كاريل في نهاية القريبة من الوريد الكلوي، والتي سيتم استخدامها لتشكيل مفاغرة نهاية إلى جنب إلى المستلمين IVC.
- تحديد وligate وتقسيم السفن الكظرية اليسرى. هذا يسمح بالوصول إلى الشريان الأورطي الكظري ويتم وضع خياطة 6-0 الحرير حول الشريان الأورطي في إطار التحضير للربط، ولكن ليست مرتبطة في الوقت الحالي. تعبئة الكلى والسفن والحالب من بها أمام المحيطة بها. تدوير الكلى إلى اليمين وligate / تقسيم أي فروع الخلفي. ثم تعود الكلى إلى اليسار.
- الآن توجيه الانتباه إلى الحالب. من دون إزعاج نقير كلوي تحرير الحالب من المناطق المحيطة بها أمام مع الحرص على الحفاظ على الأوعية الحالب. تقسيم الحالب في مستوى الأسهري. الكلى جاهز الآن للشفاء.
- حقن ببطء 300 وحدة من الهيبارين في IVC القاصي وبالتالي heparinizing الجهة المانحة. التعادل لأسفل الخيط الحرير 6-0 وضعت حول AA الكظري ويروي الكلية اليسرى عن طريق الشريان الأورطي البطني البعيدة مع 0.8ml من الحل الهيبارين المالحة (100 U / مل).
- مرة واحدة لم تعد نضح إنشاء كاريل التصحيح وريدي فورا للقضاء على ارتجاعي في الكلى. سحب الوريد الكلوي نحو الكلى وكشف عن AA والشريان الكلوي تحت.
- تقسيم الشريان الأورطي المجاور للالشريان الكلوي خلق كعب والبريد الكفة كما هو مبين في الشكل 1. إزالة الكلى والسفن والحالب من الجهة المانحة.
- إزالة الكلى مباشرة إلى مستلم معدة سلفا (0 دقيقة البارد الوقت نقص التروية) أو تخزينها في 4 درجة مئوية في حل من اختيار لوقت محدد مسبقا حتى وقت الزرع. الموت الرحيم الجهات المانحة التي exsanguanation وخلع عنق الرحم. إجمالي الوقت للتعافي الكلى المانحة تقريبا. 15-20 دقيقة.
2. الكلى زراعة تقنية
- تخدير الماوس المتلقي مع بنتوباربيتال (60mg / كغ جرعة أولية IP، من 25mg جرعة تكميلية / كغ IP إذا لزم الأمر). تأكد عمق التخدير بواسطة إصبع القدم قرصة، ومراقبة معدل التنفس. مقطع الفراء ثم شل الماوس بنسبة 4 في اتجاه والقيود وتطبيق مرهم للعين للعيون. تحضير الجلد مع بوفيدون اليود وثنى الماوس بطريقة عقيمة.
- جعل 2 سم خط الوسط شق البطن الرأسي ودخول تجويف البطن. سحب الأمعاءمتفوق وتخريج إلى صدره. الحفاظ على الأمعاء ملفوفة في الشاش المعقم رطبة طوال الإجراء.
- في هذا الوقت إجراء استئصال الكلية اليمنى. Ligate الشريان الكلوي والوريد مع 6-0 خيوط الحرير. استئصال القاصي الكلى إلى الغرز. Ligate الحالب مع 6-0 الحرير ثم تقسيم الأقرب إلى الكلى.
- عزل الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف السفلي (IVC) أدناه الأوعية الكلوية. ضع 4-0 العلاقات القطن حول الأبهر والوريد الأجوف السفلى متفوقة ثم أقل شأنا من موقع مفاغرة. تحديد وligate أي سفن قطني داخل الميدان مع 10-0 النايلون خياطة.
- عقدة العلاقات القطن، لأول مرة أدنى تليها متفوقة. وبهذه الطريقة يتم الاحتفاظ بعض الدم في الشريان الأورطي جعل بضع الأبهر أسهل.
- تشكيل بضع الأبهر بإبرة 30G للدخول إلى تجويف الشريان الأورطي. تمديد شق مع المقص الصغير غرامة على طول حوالي 2mm و.
- جعل حد لمفاغرة جانب الكفة الأبهر المانحة الكعب وأصابع القدمين لالشريان الأورطي المستلم في الشكل التالي. وضع 10-0 النايلون خياطة إقامة غرزة في الشريان الأورطي المانحة وإلى الزاوية السفلية من شق في الشريان الأورطي المتلقي وربطة عنق.
- وضع الثاني 10-0 النايلون مقابل لأول مرة في الشريان الأورطي المانحة والزاوية العليا من شق في الشريان الأورطي البطني وربطة عنق. جعل خط خياطة يمتد من أعلى إلى أدنى في الجدار الجانبي من الشريان الأورطي وربطة عنق ضد غرزة إقامة ضعت سابقا. ثم خياطة الجدار الإنسي بطريقة تشغيل وربطة عنق.
- جعل حد لمفاغرة الجانب من الوريد الكلوي المانحة إلى المستلم IVC في الشكل التالي. ثقب IVC بإبرة 30G وتوسيع شق مع المقص الصغير غرامة. ربط الوريد الكلوي المانحة إلى الزاوية السفلية من شق في IVC مع 10-0 النايلون. جعل خط خياطة تشغيل بين الوريد الكلوي وIVC وربطة عنق.
ملاحظة: من المهم بمكان أيضا أن سمك الكامل يمر من إبرة خياطة بما في ذلك adventit الأوعية الدمويةوحقق الجيش العراقي والبطانية. انقلاب للخارج من حواف يضمن أيضا أن هناك البطانية إلى البطانية الاتصال، والذي يساعد في الختم والشفاء من anastomoses. في حين أن عامل التخثر لوقف نزيف الدم يمكن أن تكون مفيدة للحد من التسريبات، ونحن نوصي بأن الطبيب الجراح بدلا من ذلك الاعتماد على أسلوب جيد. - تأكد من أن anastomoses هي "نظيفة". وهذا يعني، أن الجدران المعارضة لا اشتعلت عند وضع غرز. وهذا يؤدي إلى انقباض كبير في التدفق من شأنها أن تؤدي إلى الكسب غير المشروع فشل وفي الحالات القصوى إلى شلل هند أطرافهم.
ملاحظة: هناك عامل آخر بالغ الأهمية هو ضمان أن التوتر من خطوط خياطة المفاغرة هو أيضا الأمثل. فضفاضة جدا، وسوف يكون هناك تسرب لا رجعة فيه، وضيق جدا وتضيق لتدفق سيؤدي. إذا على الجانب الشرياني هذا سوف يؤدي ذلك إلى ضعف التروية من الكسب غير المشروع، إذا كان على الجانب الوريدي الكلى ازدحام سيؤدي. - الافراج عن القاصي 4-0 القطن التعادل إعادة إنشاء التدفق الوريدي. مرة واحدة الارقاء من الوريديوقد لوحظ لنا مفاغرة تدريجيا تخفيف الداني التعادل 4-0 القطن ومراقبة مفاغرة شريانية لالارقاء.
- إزالة الروابط القطن من الماوس مرة واحدة وتعتبر كل من anastomoses آمنة. بيرس المثانة مع إبرة 20 G خلق اثنين من الثقوب.
- تمرير نصائح من ملقط المنحنية من خلال الثقوب وسحب الحالب المانحة من خلال المثانة مع ملقط مع نهاية القريبة من الحالب التي ترتكز على جدار المثانة مع اثنين من 10-0 خيوط النايلون. تقليم طول الزائد من الحالب جاحظ من الحفرة الثانية مما يسمح الحالب إلى التراجع داخل المثانة وإغلاق الفتحة مع اثنين من 10-0 خيوط النايلون.
- إرجاع الأمعاء إلى البطن. إغلاق جدار البطن في طبقتين باستخدام 5-0 خياطة الحرير بطريقة قيد التشغيل.
- إدارة بلعة 1.0 مل من العقيمة، محلول ملحي دافئ في البطن كما الانعاش السوائل عند الإغلاق، وحقن 0.8 مل من المعتاد المالحة تحت الجلد بعد العملية. لا supporti أخرىيلزم اتخاذ تدابير هاء أثناء الجراحة.
- استرداد الحيوان على بطانية الاحترار. مجموع وقت زرع تقريبا. 35-45 دقيقة. إدارة المسكنات مثل البوبرينورفين، 0.05 ملغ / كغ، SC، 0.1-0.2 مل في بداية الإجراء وكل 6-12 ساعة لمدة 72 ساعة بعد المرجع.
3. الجزء المقابل استئصال الكلية
- تبعا لمتطلبات البروتوكول، بعد عدة أيام من إجراء عملية الزرع، إجراء استئصال الكلية المقابل تحت التخدير الأيزوفلورين (5٪ الأيزوفلورين استنشاقه لتحريض، 1،5-2،0٪ للصيانة).
- أدخل تجويف البطن وسحب بلطف الأمعاء إلى اليمين الحيوان. فضح الكلية اليسرى وتشريح حادة من اللفافة المحيطة بها.
- Ligate في الشريان الكلوي، الوريد والحالب مع خيوط الحرير 6-0 ثم استئصال الكلى فوق الغرز وإزالة الكلى. إجمالي الوقت المنطوق تقريبا. 10 دقيقة.
4. تقييم الكسب غير المشروع
- مقياس creati المصلتسعة باستخدام طريقة تتجمع القلوية (رد فعل جافي).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذه التقنية الجراحية يسمح لأي بسيطة الكسب غير المشروع دراسات البقاء على قيد الحياة / الرفض، أو بروتوكولات تجريبية معقدة للغاية. في الأرقام أدناه ونحن لشرح مزايا استخدام هذه التقنية المحسنة مفاغرة شريانية. باستخدام هذه التقنية خفضنا بشكل كبير من الإصابة بتجلط الشرايين من 35٪ إلى 0٪ وبالتالي زيادة الإنتاجية. وقد استخدمنا هذه التقنية لأكثر من سنة واحدة مع نفس 0٪ نتيجة تخثر الحفاظ على الشكل 1 يصف طريقة لتشكيل الشرايين الكعب والقدم صفعة الذي هو أساس هذه التقنية الجديدة. توفر هذه صفعة لمفاغرة أطول وأكثر استقامة مسار تدفق الدم إلى الكلى. كل من هذه النقاط يؤدي إلى الاضطراب قلل بشكل كبير مما يقلل من احتمال تنشيط صفائح الدم وتشكيل خثرة.
الشكل 2. تحليل المناعى. (A) الدوري حمض شيف مقطع من مراقبة عدم هيئة تنظيم الاتصالات الملطخةالكلى nsplanted. (B) عملية زرع الكلى مسانج في POD 8 باستخدام تقنية المنقحة يوضح الخلايا أنبوبي الداني العادية، والتي هي مكعبي الشكل، مع السيتوبلازم واضح وضوء نواة مستديرة في وسط الخلية. هناك أدلة على إصابة خفيفة الحدود فرشاة (الأسهم) ولكن الغالبية من الحدود فرشاة منتظمة والحفاظ عليها جيدا. التكبير: 400X.
الجدول 1. مقارنة حدوث تجلط الدم ونقص التروية الأوقات الحميمة بين الطريقتين. وأعرب جميع القيم كما يعني ± SD. لإجراء المقارنات واحدة، يتم تقييم البيانات الموزعة عادة باستخدام المفردة، الذيل يومين ر الطالب الاختبارات، ويتم تحليل البيانات غير العادة التي وزعتها اللامعلمية المفردة مان ويتني U الاختبار. تعتبر القيم P أقل من 0.05 significan إحصائيات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اتقان هذه التقنية زرع أمر صعب، ولكن بمجرد إنجازه وإنما هي أداة بحث قوية جدا. سوف يكافأ الجراح المريض / الباحث عن طريق الاهتمام بأدق التفاصيل واتساق التقنية، والذي هو المفتاح لإتقان أي عملية جراحية، حتى أكثر من ذلك في النماذج الحيوانية الصغيرة. الصعوبات التقنية لاتقان زرع الكلى الماوس هي طيات كثيرة، ومن المحتمل جدا أن الخبرة في غيرها من النماذج زرع الحيوانات الصغيرة يجب أن اكتسبت قبل تناول هذا الإجراء.
من المهم للتأكد من أن anastomoses هي "نظيفة"، أي يجب ألا يتم القبض على جدران الأوعية الدموية المتعارضة عند وضع غرز من أجل الحفاظ على التجويف البراءة. وإلا لن يكون هناك انقباض كبير في التدفق من شأنها أن أكثر من النتيجة المحتملة في الكسب غير المشروع فشل وفي الحالات القصوى تؤدي إلى hind-أطرافهم الشلل. ومن الأهمية بمكان أيضا أن سمك الكامل يمر من إبرة خياطة بما في ذلك البرانية الوعائية والبطانية تتحقق لأن هذا يؤدي إلى evertion السليم من حواف ضمان عدم وجود اتصال البطانية إلى البطانية التي تساعد في الختم والشفاء من anastomoses. في حين أن عامل التخثر لوقف نزيف الدم يمكن أن تكون مفيدة للحد من التسريبات، ونحن نوصي بأن الطبيب الجراح بدلا من ذلك الاعتماد على أسلوب جيد.
كما يجب إيلاء الاهتمام لضمان التوتر من خطوط خياطة المفاغرة هو الأمثل، فضفاضة جدا، وسوف يكون هناك تسرب لا رجعة فيه، إلى تدفق ضيق وانخفاض سيؤدي. إذا على الجانب الشرياني هذا سوف يؤدي ذلك إلى ضعف التروية من الكسب غير المشروع، إذا كان على الجانب الوريدي الكلى ازدحام سيؤدي. تحقيق هذا التوتر الصحيح هو أن مسألة الممارسة والخبرة مع غيرها من نماذج الاوعية الدموية الدقيقة الحيوانات الصغيرة تكون مساعدة كبيرة. قبل كل شيء اتساق التقنية والاهتمام الثابت بالتفاصيل سوف تسفر الماوس ممتازة وبقاء الكسب غير المشروع، وظيفة زرع الكلى.
ر "> والقيود المفروضة على هذه التقنية تخضع فقط من الاستخدامات التي يمكن تطبيقها من قبل المحقق. كما هو الحال مع أي إجراء الاوعية الدموية الدقيقة، لوحظ تقنية طالما جيدة كما يجب أن تكون النتائج قابلة للتكرار.تم تخفيض الإصابة بتجلط الشرايين باستخدام هذه التقنية بشكل كبير. هذه النتائج في 03/01 على الأقل من جميع عمليات زرع الكلى يجري تحويلها من أعطال فنية المحتملة لبيانات قابلة للاستخدام، مما أدى إلى انخفاض التكاليف وزيادة الإنتاجية.
باعتبارها أوعية دموية بالكامل، نموذج زرع مثلي ستشمل التطبيقات المستقبلية رفض / دراسات التسامح وظاهرة تأخر ظيفة الكسب غير المشروع والتحقيق في آليات الإصابة نقص التروية / ضخه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل في جزء من 1R03DK096151.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant Proc. 5 (1), 721-725 (1973).
- Kalina, S. L., Mottram, P. L. A microsurgical technique for renal transplantation in mice. Aust N Z J Surg. 63 (3), 213-216 (1993).
- Han, W. R., Murray-Segal, L. J., Mottram, P. L. Modified technique for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 19 (6), 272-274 (1999).
- Ge, F., Gong, W. Strategies for successfully establishing a kidney transplant in a mouse model. Exp Clin Transplant. 9 (5), 287-294 (2011).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Zhang, Z. Kidney Transplantation in Mice. Experimental Organ Transplantation. Chen, H., Qian, S. , Nova Science Publishers. 45-64 (2013).
- Zhang, L., Moskovitz, M., Piscatelli, S., Longaker, M. T., Siebert, J. W. Hemodynamic study of different angled end-to-side anastomoses. Microsurgery. 16 (2), 114-117 (1995).
- Liu, Q., Mirc, D., Fu, B. M. Mechanical mechanisms of thrombosis in intact bent microvessels of rat mesentery. J Biomech. 41 (12), 2726-2734 (2008).
- Chesnutt, J. K., Han, H. C. Tortuosity triggers platelet activation and thrombus formation in microvessels. J Biomech Eng. 133 (12), 121004 (2011).
- Han, H. C. Blood vessel buckling within soft surrounding tissue generates tortuosity. J Biomech. 42 (16), 2797-2801 (2009).
- Gutierrez-Diaz, J. A., et al. Intraluminal thrombus and neointimal hyperplasia after microvascular surgery. Surg Neurol. 24 (2), 153-159 (1985).
- Khouri, R. K., Cooley, B. C., Kenna, D. M., Edstrom, L. E. Thrombosis of microvascular anastomoses in traumatized vessels: fibrin versus platelets. Plast Reconstr Surg. 86 (1), 110-117 (1990).
- Johnson, P. C., et al. Initial platelet deposition at the human microvascular anastomosis: effect on downstream platelet deposition to intact and injured vessels. Plast Reconstr Surg. 90 (4), 650-658 (1992).
