Introduction
1973 년 이후 쥐 신장 이식 모델은 유용한 연구 도구 왔지만, 기술적 인 문제는 광범위한 사용을 저해했다. 수년에 걸쳐 여러 논문 출판이 절차 개선 / 개선을 자세히 설명하고있다. 주로 혈관 고형 장기 이식의 모델로이 절차는 또한 1973 6 러셀 실험실에 의해 고안되었다 이소성 심장 이식 모델에 아마 두 번째입니다. 두 모델은 동종 거부 반응, 지연 이식 기능의 개발에 대한 연구하기 위해 자신을 빌려 허혈 및 재관류 손상.
신장 이식에보고 할 수있는 가장 일반적인 문제 중 하나는 우리는 또한 우리의 실험실에서 경험 동맥 혈전증 4,5,7의 상대적으로 높은 발병률이다. 그러므로 우리는 혈전 형성의 문헌 고찰을 수행하고 가능성이 기술적 인 문제의 원인을 찾기 위해 밖으로 설정하고 또한을 고안가능한 솔루션입니다. 혈전증의 원인은 혈액 기증자 신장 동맥에 다음 기증자 신장 대동맥으로,받는 사람 대동맥에서 걸리는 다소 고통스러운 경로입니다. 이 경로는 혈소판 활성화 및 혈전 형성으로 이어질 수 있습니다 신장 동맥에 난류가 발생합니다. 최근의 관찰과 관련 문헌 8-14의 검색을 바탕으로 우리는 0 %에 혈전증을 감소시켰다 새로운 기술 내놓았다.
여기에 기재된 기술은 시설 혈류를 개선 동맥 힐 앤드 토 커프스의 형성 이전에보고 된 방법과 크게 다르다 혈전 형성을 감소시킨다. 커프 미만 45 O 대동맥 (도 1A 및 1B)의 종축에 각도 신장 동맥의 소공면에 걸쳐 적외선 신장 대동맥을 분할함으로써 형성된다. 이 길이는 약 2mm 커프스가 발생합니다. 정맥 카렐 패치는 R을에 병행하여 형성된다IVC enal 정맥 내로함으로써 커프스의 직경을 증가시킨다. 적외선 신장 기증자 복부 대동맥 발 뒤꿈치와 발가락 커프는 엔드 - 투 -면이받는 사람 복부 대동맥 및 기증자 신장 정맥에 문합이다 / IVC 패치 (IVC) 엔드 - 투 -면이받는 사람 복부 하대 정맥에 문합이다 . 요관 다음에 도입 한 알 동부 (3)에 의해 설명 된 바와 같이 공기 주머니에 고정된다.
이 연구 단지 따뜻한 허혈 시간이 치료 이식의 경우 (예 :., 냉 허혈)는 비교되지 않습니다. 이 경우, 온 허혈 손상이 도너 신장을 통한 혈류의 중단으로부터 시간을 의미한다 (아래의 단계 1.11)와 수신자 (아래 단계 2.11)에 이식 재관류. 냉 허혈은 신장되지 않고, 관류 이식 절차를 시작할 때까지 냉장 보관되는 시간을 의미한다.
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Protocol
모든 마우스는 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 구입하고 NIH 가이드 라인에 콜로라도 덴버 IACUC 대학의 승인에 따라 콜로라도 덴버, 바바라 데이비스 센터 동물 시설의 대학에서 병원균이없는 조건에서 보관 하였다.
1. 기증자 신장 수확
- 모든 악기를 소독 절차를 통해 멸균 장갑을 착용하고 멸균 필드를 유지한다. 운영 현미경을 이용하여 모든 수술을 수행한다.
- 수술로 펜 토바 비탈 - 마취 (60mg의 / ㎏ IP) 기증자로부터 마우스 기증자의 신장을 제거합니다. 발가락 핀치에 의한 마취의 깊이를 확인하고 호흡을 관찰한다.
- 다음 4 방향 구속으로 마우스를 고정 모피 클립. 포비돈 - 요오드와 피부를 준비하고 멸균 방식으로 마우스를 드레이프.
- 2cm의 중간 선 수직 복부 절개를 확인하고 복강을 입력합니다. 우량 장을 후퇴하고 구체화가슴에. 절차를 통해 멸균 촉촉한 거즈에 싸서 장을 유지합니다.
- 큰 복부 혈관을 확인하고 그들을 동원, 어떤 요추 가지를 확인하고 소작 또는 10/0 나일론 봉합사를 결찰 중 하나.
- 바로 왼쪽 신장 혈관 원위부는 약 2mm 이상 무딘 절개에 의한 하대 정맥 (IVC)과 떨어져 복부 대동맥 (AA)를 애타게. 10/0 나일론 결찰과 신장 혈관에서 작은 동맥과 정맥의 가지를 나눕니다.
- 이제 이러한 구조의 무딘 절개에 의해 조심스럽게 신장 동맥에서 신장 정맥을 분리합니다. 이것은 수신자 IVC로 엔드 - 투 - 사이드 문합을 형성하는데 사용된다 신정맥의 기단부 카렐 패치의 정확한 생성을 위해 허용한다.
- 식별, 결찰 왼쪽 부신 혈관을 나눕니다. 이것은 부신 대동맥에 대한 액세스를 허용하고 6-0 실크 봉합사 결찰에 대비 대동맥 주위에 위치하지만,이 시점에서 연결되지 않은. 주변 간판에서 신장, 혈관과 요관을 동원. 오른쪽 결찰에 신장을 회전 / 어떤 후방 가지를 나눕니다. 그런 다음 왼쪽 신장을 반환합니다.
- 이제 요관에주의를 지시. 신장 폐문이 ureteric 혈관을 유지하기 위해 주변의 간판 복용 치료에서 요관을 무료 방해하지 않고. 동맥관 정관의 수준에서 요관을 나눈다. 신장은 이제 복구하기위한 준비가되어 있습니다.
- 천천히함으로써 기증자를 heparinizing 말초 IVC에 헤파린 300 단위를 주입. 부신 AA 주위에 배치 6-0 실크 봉합사를 묶고 헤파린 식염수 (100 U / ㎖)와 함께 0.8 ㎖의 원위 복부 대동맥을 통하여 좌측 신장을 관류.
- 관류가 정맥 카렐 패치를 만들 중단되면 즉시 신장으로 역류를 제거합니다. AA와 아래 신장 동맥을 드러내는 신장쪽으로 신장 정맥을 후퇴.
- 신장 동맥에 인접한 대동맥 뒤꿈치에를 만드는 나눈다그림 1과 같이 전자 커프. 기증자로부터 신장, 혈관과 요관을 제거합니다.
- 주입 시간까지 미리 제조 수신자 (0 분 냉 허혈 시간) 또는 미리 결정된 시간에 대한 선택의 용액에 4 ℃로 보관 직접 신장을 제거한다. exsanguanation 자궁 전위에 의해 기증자를 안락사. 기증자의 신장을 복구 할 수있는 총 시간은 약입니다. 15 ~ 20 분.
2. 신장 이식 기법
- 펜토 바르 비탈과받는 사람 마우스를 마취 (60mg의 / ㎏ IP 초기 용량, 25 mg의 / ㎏ IP 추가 투여 필요한 경우). 발가락 핀치에 의한 마취의 깊이를 확인하고 호흡을 관찰한다. 모피는 다음 4 방향 구속하여 마우스를 고정하고 눈 안과 연고를 적용 클립. 포비돈 - 요오드와 피부를 준비하고 멸균 방식으로 마우스를 드레이프.
- 2cm의 중간 선 수직 복부 절개를 확인하고 복강을 입력합니다. 장 후퇴우량 가슴에 구체화. 절차를 통해 멸균 촉촉한 거즈에 싸서 장을 유지합니다.
- 이 때 오른쪽 신장 절제술을 수행합니다. 6-0 실크 봉합사와 신장 동맥과 정맥을 결찰. 봉합에 신장의 원위을 절제. 신장에 인접 분할 후 6-0 실크 요관을 결찰하고.
- 신장 혈관 아래 복부 대동맥과 하대 정맥 (IVC)를 분리합니다. 문 합부에 4-0면 대동맥 주위 관계 및 IVC 우수한 다음 열등를 놓습니다. 10-0 나일론 봉합사와 필드 내의 모든 요추 혈관을 확인하고 결찰.
- 우수한 다음에 먼저 열등,면의 관계를 매듭. 이런 식으로 몇 가지 혈액 aortotomy을 쉽게 대동맥에 유지됩니다.
- 대동맥의 루멘을 입력 30G 바늘 aortotomy를 형성한다. 약 2mm의 길이에 미세한 마이크로 가위로 절개를 확장 할 수 있습니다.
- 기증자의 대동맥의 발 뒤꿈치와 발가락 커프의 측면 문합에에 끝을 확인다음과 같은 방식으로받는 사람 대동맥. 기증자의 대동맥과받는 사람 대동맥과 넥타이 절개의 하부 각도에 10-0 나일론 봉합사 숙박 스티치를 놓습니다.
- 기증자의 대동맥의 첫 번째 및 복부 대동맥과 넥타이에 절개의 우수한 코너에 대향하는 제 2 10-0 나일론을 놓습니다. 대동맥의 측면 벽에 열등 우수에서 실행 봉합 라인을 확인하고 이전에 배치 숙박 스티치에 넥타이. 그런 다음 실행 패션과 넥타이 중간 벽을 봉합.
- 다음과 같은 방식으로받는 사람 IVC에 기증자 신장 정맥 측 문합에 끝을 확인합니다. 30G 바늘 IVC에 구멍을 미세 마이크로 가위로 절개를 확장 할 수 있습니다. 10-0 나일론으로 IVC의 절개의 하부 모서리에 기증자 신장 정맥을 묶어. 신장 정맥과 하대 정맥과 넥타이 사이에 실행 봉합 라인을 확인합니다.
참고 : 그것은 전체 두께가 혈관 adventit을 포함하여 봉합 바늘 통과하는 것도 매우 중요합니다IA와 내막이 달성된다. 가장자리의 외반은 밀봉 및 문합의 치유에 도움 내막 - 투 - 내막 접촉이 있음을 보장합니다. 지혈 응고 에이전트가 누출을 감소하는 데 유용 할 수 있지만, 우리는 외과 의사 대신 좋은 기술에 의존하는 것이 좋습니다. - 문합은 "깨끗한"인지 확인합니다. 즉 바늘을 배치 할 때 상대 벽은 발견되지 않는다는 것이다. 이것은 실패한 이식과 뒷다리 마비에 극단적 인 경우가 발생합니다 그 흐름에 상당한 수축의 원인이됩니다.
주 : 또 극히 중요한 요소는 문합 봉합선의 장력이 또한 최적 인 것을 보장한다. 너무 느슨하고 돌이킬 누출, 너무 꽉 발생합니다 흐름에 협착이있을 것입니다. 동맥 측에이 이식의 가난한 관류가 발생할 경우, 정맥 측에 혼잡 신장의 원인이됩니다. - 말초 4-0면 넥타이 재 구축 정맥 흐름을 놓습니다. veno의 지혈 한 번우리의 문합은 근위 4-0면 넥타이를 풀고 지혈을 위해 동맥 문합을 준수 점차적으로 관찰되었다.
- 모두 문합이 안전한 것으로 간주되면 마우스에서 면화 관계를 제거합니다. 피어스 두 개의 구멍을 만드는 20 G 바늘 방광.
- 구멍을 통해 곡선 포셉의 팁을 전달하고 두 10-0 나일론 봉합사로 방광 벽에 고정되는 요관의 기단부와 집게로 방광을 통해 기증자 요관을 당깁니다. 요관이 방광 내에 철회 두 10-0 나일론 봉합사로 구멍을 닫습니다 수 있도록 두 번째 구멍에서 튀어 요관의 초과 길이를 낸다.
- 복부에 장을 돌려줍니다. 실행하는 방식으로 5-0 실크 봉합사를 사용하여 두 층의 복벽을 닫습니다.
- 폐쇄시 유체 소생과 복부에 살균, 따뜻한 생리 식염수 1.0 ML의 덩어리를 관리하고, 생리 식염수를 피하 수술 후 0.8 ml를 주입. 다른 supporti 없습니다적이 조치는 수술 중 필요합니다.
- 온난화 담요에 동물을 복구 할 수 있습니다. 총 주입 시간은 약. 35 ~ 45 분. 이러한 프레 노르 핀, 0.05 ㎎ / ㎏, SC, 절차의 시작과 72 시간의 수술 후마다 6 ~ 12 시간에서 0.1 ~ 0.2 ml의 같은 진통제를 관리.
3. 반대쪽 신장 절제술
- 프로토콜 요구 사항에 따라, 몇 일이 임플란트 시술 후, 이소 플루 란 마취에서 반대측 신장 절제술 (유도 5 % 흡입 이소 플루 란, 유지 보수를 위해 1.5-2.0 %)을 수행합니다.
- 복강를 입력하고 부드럽게 동물의 오른쪽에있는 장을 철회. 주위의 근막에서 왼쪽 신장과 무딘 해부 노출.
- 6-0 실크 봉합사와 신장 동맥, 정맥 및 요관을 결찰 한 후 봉합 위의 신장을 절제하고 신장을 제거합니다. 총 수술 시간은 약입니다. 10 분.
4. 이식 평가
- 측정 혈청 creati알칼리 피크 레이트 법 (제피 반응)를 사용하여 구.
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Representative Results
이 수술 기법은 단순한 이식 생존 / 거부 연구, 또는 매우 복잡한 실험 프로토콜 중 하나를 수 있습니다. 도면에서 우리는이 향상된 동맥 문합 기술을 사용하는 장점을 설명 이하. 우리가 유의하게 0 %, 따라서 생산성 향상 35 %에서 동맥 혈전증의 발생을 감소이 기술을 사용. 우리는 유지 동일한 0 % 혈전증 결과에 1 년 이상이 기술을 이용했다. (1)이 새로운 기술의 기초이다 동맥 힐 앤드 토 커프스의 형성 방법을 설명도. 이 커프 이상 문합과 신장에 똑바로 혈액 유동 경로를 제공한다. 이러한 점을 모두 활성화시켜 혈소판 및 혈전 형성의 가능성을 감소 크게 줄어들 난류를 초래.
2. 면역 조직 화학적 분석을 그림. (A)과 요오드 산 - 쉬프는 제어 비 TRA의 부분을 염색nsplanted 신장. (나) 개정 기술을 사용하여 POD (8)에서 동계 신장 이식은 분명 세포질과 세포의 중앙에 둥근 빛의 핵으로, 입방 있습니다 정상 근위 관 세포를 보여줍니다. 이 온화한 브러시 테두리 부상 (화살표)의 증거는 있지만, 브러시 테두리의 대부분은 정기적으로 잘 보존됩니다. 배율 : 400X.
두 기술 사이의 혈전증의 발생률과 따뜻한 허혈 시간의 표 1. 비교. 모든 값은 평균 ± 표준 편차로 표현된다. 하나의 비교를 들어, 일반적으로 분산 된 데이터는 짝, 두 개의 꼬리 학생 T 테스트를 사용하여 평가하고, 비 정규 분포 데이터는 비모수 짝 Mann-Whitney U test를 분석한다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 significan 간주됩니다T.
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Discussion
이 이식 기술을 습득하는 것은 어렵지만 달성되면 그것은 매우 강력한 연구 도구이다. 환자 외과 의사 / 연구원은 세부 사항 및 작은 동물 모델에서 더욱 더 어떤 수술을 마스터하는 열쇠입니다 기술의 일관성에 대한 관심에 의해 보상 될 것이다. 마우스 신장 이식을 마스터의 기술적 어려움이 많은 주름, 그리고 그것은 다른 작은 동물 이식 모델에서 경험이 절차를 폭행하기 전에 얻을 수 있어야 가능성이 매우 높다.
특허 루멘을 유지하기 위해 바늘을 배치 할 때 상대 혈관 벽이 잡힐 안, 즉, 그것은 문합은 "깨끗한"되어 있는지 확인하는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 실패한 이식과 극단적 인 경우에 가능성이 결과보다 것보다 그 흐름 상당한 수축이있을 것이다하는 것은 마비 - 사지 뒷다리로 이어집니다. 그것은 전체 두께가 봉합 바늘 통과하는 것도 매우 중요합니다 이 밀봉 및 문합 치유 에이즈 내막 대 내막 접촉이 있음을 보장하는 적당한 에지 evertion 결과로서 혈관 외막과 내막을 포함하는 것이 달성된다. 지혈 응고 에이전트가 누출을 감소하는 데 유용 할 수 있지만, 우리는 외과 의사 대신 좋은 기술에 의존하는 것이 좋습니다.
또한주의가 문 합부 봉합 라인의 장력을 보장하기 위해 지불해야하는 것은 너무 느슨 최적이며 발생합니다 꽉 감소 흐름에 돌이킬 수없는 누수가있을 것입니다. 동맥 측에이 이식의 가난한 관류가 발생할 경우, 정맥 측에 혼잡 신장의 원인이됩니다. 이 올바른 긴장을 달성하는 것은 연습과 다른 작은 동물의 미세 혈관 모델과 경험의 문제가 큰 도움이 될 것입니다. 우수한 마우스 및 이식 생존 및 신장 이식 기능을 얻을 것입니다 세부 사항에 대한 기술과 변함없는 관심의 모든 일관성 위.
t ">이 기술의 한계는 연구자에 의해 도포 될 수있는 용도에 의해서만 지배된다. 어떤 미세 혈관 절차와 마찬가지로, 오랫동안 기술이 좋은 결과는 재현되어야 관찰된다.이 기술을 이용하여 동맥 혈전증의 발생 빈도가 대폭 감소되었다. 모든 신장 이식의 적어도 1/3이 결과는 비용 절감 및 생산성 향상의 결과로 사용할 수있는 데이터에 잠재적 인 기술적 장애로 변환된다.
완전히 혈관, 동소 이식 모델로 미래 애플리케이션 거부 / 공차 연구, 허혈 / 재관류 손상의 기전에 지연 기능 및 그래프트 조사 현상을 포함 할 것이다.
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Acknowledgments
이 작품은 1R03DK096151에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
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