Introduction
自1973年以来在小鼠肾脏移植模型一直是一个有价值的研究工具，但技术问题阻碍了它的广泛使用。多年来，一些论文已发表的细节改进/改进这一程序。作为主要血管实体器官移植模型这个过程可能是仅次于异位心脏移植模型，这也是在1973年6设计由罗素实验室。这两种型号借给自己的研究分为异体排斥反应，对移植肾功能延迟发展和局部缺血再灌注损伤。
其中最常见的问题与肾移植报是动脉血栓形成4,5,7，我们也经历了我们实验室的发病率相对较高。因此，我们开始着手进行血栓形成的文献综述，并可能发现这个技术问题的原因，也设计一个可能的解决方案。血栓形成的最可能的原因是血液需要从收件人主动脉，成体供肾肾主动脉，然后就到了供肾动脉有点曲折的道路。此路径将导致湍流，肾动脉，可导致血小板激活和血栓形成。根据近期的观察和搜索相关文献8-14中 ，我们提出了一个新的技术，减少血栓形成，以0％。
此处所描述的技术从在动脉踵和胎趾袖口哪个设施改善血液流的形成以前报道的技术而不同，显著减少血栓形成。袖带是通过将横跨肾动脉口的面的红外线肾主动脉在低于45°到主动脉（图1A＆1B）的纵向轴线的角度形成的。这导致了袖带大约2mm的长度。静脉卡雷尔补丁是由横断第r形成烯醛静脉进入下腔静脉，从而增加了封套的直径。该红外供肾腹主动脉脚跟和脚趾袖口端 - 端吻合于受体腹主动脉和供体肾静脉/下腔静脉修补程序端 - 端吻合给收件人腹部下腔静脉（IVC） 。输尿管随后被引入并如由韩等人3锚固在膀胱。
在这项研究中未经处理的移植，只有热缺血时间（ 即 ，不冷缺血）进行比较。在这种情况下，热缺血是指从血液流过供体肾脏的停止的时间（下面的步骤1.11），并在受者（下面步骤2.11）的接枝的再灌注。冷缺血是指肾脏未灌注和保存在冷藏直到植入程序开始的时间。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有小鼠购自杰克逊实验室（巴港，ME）购买并根据美国国立卫生研究院的准则和科罗拉多州丹佛IACUC大学的批准饲养的无病原体的条件下，在美国科罗拉多州丹佛市，芭芭拉·戴维斯中心动物设施的大学。
1.体供肾收获
- 消毒所有仪器，整个过程中戴上无菌手套，并保持无菌区。完成所有的手术配合使用的手术显微镜。
- 从手术戊巴比妥麻醉（60毫克/千克IP）捐助者拔下鼠标供肾。确定麻醉通过脚趾捏的深度，并观察呼吸频率。
- 剪辑的皮毛，然后固定在鼠标的4路限制。准备用碘伏皮肤和悬垂鼠标以消毒方式。
- 做2厘米的垂直中线腹部切口，进入腹腔。缩回肠优化和外部它到胸部。保持包装在无菌湿润纱布在整个过程中的肠。
- 确定伟大的腹部血管和动员他们，找出任何腰椎分行，要么烧灼或用10/0尼龙线将它们连接起来。
- 立即远端左肾血管挑逗下腔静脉（IVC）和腹主动脉（AA）除了钝性分离了2mm左右。结扎与10/0尼龙和分裂的小动脉和静脉分支的肾血管。
- 现在分开肾动脉仔细肾静脉由这些结构钝性分离。这允许在肾静脉的近端的精确创建卡雷尔补丁，这将被用于形成一个端 - 侧吻合到收件人IVC。
- 识别，结扎和划分左肾上腺血管。这允许访问肾上腺主动脉和6-0丝线缝合周围放置在主动脉中准备结扎，但不依赖在这个时候。 动员肾脏，血管和输尿管从周围的仪表板。旋转肾脏的权利和结扎/分任后支。然后肾脏返回到左侧。
- 现在的注意力集中输尿管。而不会干扰肾门不受周围的仪表板照顾输尿管保留输尿管船只。划分输尿管在输精管的水平。肾脏是现在可以恢复。
- 缓缓注入肝素进入远端下腔静脉，从而heparinizing捐赠的300台。阕6-0丝线缝合周围放置肾上腺AA，并通过远端腹主动脉与肝素盐水（100 U / ml）的0.8毫升灌注左肾。
- 一旦灌注已停止创建静脉卡雷尔补丁立即消除回流到肾。缩回肾静脉朝向肾揭示了AA和肾动脉下方。
- 分邻近肾动脉的主动脉创建脚跟，并如图1 C箍。从供体中取出肾脏，血管和输尿管。
- 直接取出肾脏到预先制备的收件人（0分钟冷缺血时间）或储存在4℃下在所选择的一个预定时间中的溶液，直至植入的时间。安乐死的捐助者exsanguanation和颈椎脱位。恢复供肾的总时间大约为15-20分钟。
2.肾脏植入技术
- （如果需要60毫克/公斤的IP初始剂量为25mg / kg的IP补充剂量）麻醉受体小鼠戊巴比妥。确定麻醉通过脚趾捏的深度，并观察呼吸频率。剪辑的皮毛，然后固定在鼠标的4路约束和应用眼药膏的眼睛。准备用碘伏皮肤和悬垂鼠标以消毒方式。
- 做2厘米的垂直中线腹部切口，进入腹腔。缩回肠优和外部化到胸部。保持包装在无菌湿润纱布在整个过程中的肠。
- 在这个时候进行正确的性肾切除术。结扎肾动脉和静脉用6-0丝线缝合。切除肾脏远端的缝线。结扎输尿管以6-0丝线，然后分近端肾。
- 隔离腹主动脉和下腔静脉（IVC）以下的肾血管。周围放置主动脉4-0棉花的关系，下腔静脉优于然后逊于吻合部位。内场识别并结扎所有腰椎血管用10-0尼龙缝合。
- 结棉关系，第一下后跟优越。在这种方式的一些血液被保持在使主动脉切开术更容易主动脉。
- 形成具有30G针的主动脉切开术进入主动脉的内腔中。延长切口用细显微剪到2mm左右的长度。
- 做一个结束捐助主动脉脚跟和脚趾袖侧吻合术收件人主动脉以下的方式。放置一个10-0尼龙缝合针留在供体主动脉和切口在收件人主动脉和领带的下角。
- 将第二10-0尼龙相反的第一个供体主动脉和切口腹主动脉和领带的高级角落。做一个连续缝合线由优到劣主动脉的侧壁和领带对先前放置的逗留针。然后缝合内侧壁上的运行方式和领带。
- 请停止供体肾静脉在以下时尚收件人下腔静脉端侧吻合。穿刺IVC用30G针和细微剪刀延长切口。领带供体肾静脉的切口下腔静脉的下角和10-0尼龙。使肾静脉和下腔静脉和领带之间的连续缝合线。
注：这也是非常重要的全层通过缝合针，包括血管adventit的ia和内膜得以实现。边缘外翻也确保有内膜到内膜接触，这有助于密封和所述吻合的愈合。虽然止血凝血剂可以减少渗漏有用，我们建议外科医生，而不是依靠良好的技术。 - 确保吻合是“干净的”。也就是说，将针迹时的相对的壁没有被捕获。这将导致一个显著收缩流动，这将导致一个失败接枝和在极端情况下，以后肢麻痹。
注：另外一个非常重要的因素是确保吻合缝线的张力也处于最佳状态。过松又会有不可逆转的泄漏，过紧而狭窄的流动将导致。如果在动脉侧，这将导致在接枝的灌注差，如果在静脉侧的拥塞肾脏将导致。 - 松开远端4-0棉领带重新建立静脉血流。一旦静脉止血美国吻合术已经观察到逐步放松的近端4-0棉结，观察动脉吻合术止血。
- 从鼠标中取出棉关系，一旦两者吻合术被认为是安全的。皮尔斯用20G的针头创建两个孔膀胱。
- 通过孔通过弯曲钳提示，并通过与输尿管的近端钳子膀胱拉施主输尿管被锚固到膀胱壁具有两个10-0尼龙缝合线。修剪输尿管从第二孔使输尿管向膀胱内缩回，并关闭两个10-0尼龙缝合线的孔突出的多余长度。
- 返回肠腹部。关闭腹壁两层用5-0丝线缝合的运行方式。
- 辖1.0毫升丸无菌，温暖的生理盐水到腹部为交易结束后的液体复苏，并注入0.8的生理盐水皮下手术后毫升。没有其他supporti在手术期间需要五个措施。
- 恢复在加温毯动物。总植入时间约。 35-45分钟。施用镇痛剂，如丁丙诺啡，0.05毫克/公斤，SC 0.1-0.2毫升在过程的开始和每6-12小时72小时后的操作。
3.对侧肾切除术
- 根据协议要求，几天植入手术后，进行异氟烷麻醉下对侧肾切除术（5％异氟烷吸入诱导，维护1.5-2.0％）。
- 进入腹腔，轻轻缩回肠到动物的右。揭露左肾和钝器解剖与周围筋膜。
- 结扎肾动脉，静脉和输尿管用6-0丝线缝合，然后切除上面的缝线肾脏，取出肾脏。总手术时间约。 10分钟。
4.移植评估
- 测定血清肌酐9使用碱性苦味酸法（谢菲反应）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这种手术方法使得无论是简单的移植物的存活/排斥反应的研究，还是蛮复杂的实验方案。在图中下面，我们展示了使用该改进的动脉吻合术的优点。使用这项技术，我们已经显著降低动脉血栓形成的发病率从35％至0％从而提高了生产率。我们已经用这种技术一年以上在保持相同的0％血栓形成的结果。 图1描述的方法中的动脉踵和胎趾袖口这是这种新技术的基础上的形成。这个袖口提供更长的吻合和直血液流路入肾。这两点的导致显著减少湍流由此降低血小板活化和血栓形成的可能性。
图2.免疫组化分析。 （一）碘酸雪夫染色控制非TRA第nsplanted肾。（b）在同基因肾移植手术在术后第7天使用经修订的技术演示正常肾小管上皮细胞，这是立方形，有明显的细胞质和圆形轻核在小区的中间。有轻微的刷状缘损伤（箭头）的证据，但大多数的刷状缘是定期和保存完好。放大倍数：400倍。
表1.血栓发生率和热缺血时间两种技术之间的比较。所有值均表示为平均值±SD。对于单比较，正态分布的数据被使用不成，双尾Student t检验评估，非正态分布数据是由非参数的Mann未成-Whitney U检验分析。小于0.05的P值被认为是统计学significan吨。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
掌握这种移植技术是困难的，但一旦完成了它是一个非常强有力的研究工具。病人的外科医生/研究人员将通过注重细节和技术，这是在小动物模型的关键是掌握任何外科手术，更使一致性得到回报。掌握鼠标肾移植的技术难度大很多倍，而且极有可能在其他小动物移植模型中的经验，必须处理这个过程之前获得。
即，将针以保持一个专利管腔时的相对的血管壁的一定不能被捕获;确保所述吻合是“干净”的是重要的。否则，将有显著收缩流动的规模将超过有可能导致移植失败，在极端情况下会导致后肢瘫痪。这也是非常重要的是整个厚度经过缝合针的包括血管外膜和内膜得以实现，因为这样导致确保有内膜至中膜接触这有助于密封和所述吻合愈合的边缘的正确evertion。虽然止血凝血剂可以减少渗漏有用，我们建议外科医生，而不是依靠良好的技术。
同时必须注意确保吻合缝线的张力是最优的，太松又会有不可逆转的泄漏，紧张和流量减少会导致。如果在动脉侧，这将导致在接枝的灌注差，如果在静脉侧的拥塞肾脏将导致。实现这一正确的张力实践，并与其他小动物微血管模型经验的问题会有很大的帮助。上述技术和坚定的注意力全部一致性细节将产生出色的鼠标和移植物的存活率和肾移植功能。
吨“>这种技术的局限性是由能够由研究者所施加的用途只管辖。正如任何微血管程序，只要好的技术被观察到的结果应该是可重复的。使用这种技术的动脉血栓形成的发病率大幅度降低。这导致至少三分之一的所有肾移植从潜在技术故障被转换为可使用的数据，从而降低了成本并提高了生产率。
作为一个完全血管化，原位移植模型的未来的应用将包括拒绝/耐受性研究中，移植肾功能延迟和调查的现象到缺血/再灌注损伤的机制。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
这项工作是由1R03DK096151的部分资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant Proc. 5 (1), 721-725 (1973).
- Kalina, S. L., Mottram, P. L. A microsurgical technique for renal transplantation in mice. Aust N Z J Surg. 63 (3), 213-216 (1993).
- Han, W. R., Murray-Segal, L. J., Mottram, P. L. Modified technique for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 19 (6), 272-274 (1999).
- Ge, F., Gong, W. Strategies for successfully establishing a kidney transplant in a mouse model. Exp Clin Transplant. 9 (5), 287-294 (2011).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Zhang, Z. Kidney Transplantation in Mice. Experimental Organ Transplantation. Chen, H., Qian, S. , Nova Science Publishers. 45-64 (2013).
- Zhang, L., Moskovitz, M., Piscatelli, S., Longaker, M. T., Siebert, J. W. Hemodynamic study of different angled end-to-side anastomoses. Microsurgery. 16 (2), 114-117 (1995).
- Liu, Q., Mirc, D., Fu, B. M. Mechanical mechanisms of thrombosis in intact bent microvessels of rat mesentery. J Biomech. 41 (12), 2726-2734 (2008).
- Chesnutt, J. K., Han, H. C. Tortuosity triggers platelet activation and thrombus formation in microvessels. J Biomech Eng. 133 (12), 121004 (2011).
- Han, H. C. Blood vessel buckling within soft surrounding tissue generates tortuosity. J Biomech. 42 (16), 2797-2801 (2009).
- Gutierrez-Diaz, J. A., et al. Intraluminal thrombus and neointimal hyperplasia after microvascular surgery. Surg Neurol. 24 (2), 153-159 (1985).
- Khouri, R. K., Cooley, B. C., Kenna, D. M., Edstrom, L. E. Thrombosis of microvascular anastomoses in traumatized vessels: fibrin versus platelets. Plast Reconstr Surg. 86 (1), 110-117 (1990).
- Johnson, P. C., et al. Initial platelet deposition at the human microvascular anastomosis: effect on downstream platelet deposition to intact and injured vessels. Plast Reconstr Surg. 90 (4), 650-658 (1992).
