Introduction
С 1973 года модель трансплантации почек у мышей является ценным инструментом исследования, но технические вопросы препятствуют его широкому использованию. На протяжении многих лет несколько статей были опубликованы подробно улучшения / уточнения к этой процедуре. В качестве модели трансплантации в первую очередь васкуляризированной солидных органов эта процедура, вероятно, уступает только гетеротопической модели трансплантации сердца, который также был разработанного в лаборатории Рассел в 1973 году 6. Обе модели поддаются исследования в аллогенных ответов отторжения, развития замедленной функции трансплантата и ишемия реперфузии.
Один из самых распространенных вопросов, сообщается с трансплантации почки является сравнительно высокий уровень артериального тромбоза 4,5,7, которые мы также испытали в нашей лаборатории. Поэтому мы намерены выполнить обзор литературы по образованию тромба и, возможно, найти причину этой технической проблеме и также разработатьвозможное решение. Наиболее вероятной причиной тромбоза является несколько извилистый путь кровь занимает от аорты реципиента, в донорской почки аорты затем на доноров почечной артерии. Этот путь приводит к турбулентности в почечной артерии, которые могут привести к активации тромбоцитов и образование тромба. Основываясь на последних наблюдений и поиска соответствующей литературы 8-14 мы пришли с новой техникой, что уменьшило тромбоз до 0%.
Описанная методика здесь варьируется от сообщалось ранее методов в формировании артериальной пятки на носок манжеты, какие объекты улучшенной кровоток и значительно снижает образование тромбов. Манжета формируется путем деления инфра-почечные аорты по лицу почечной артериальной устья под углом менее 45 вывода к продольной оси аорты (фиг.1А и 1В). Это приводит к манжете приблизительно 2 мм в длину. Венозный Каррель патч формируется пересекающих Rеналя вены в НПВ тем самым увеличивая диаметр манжеты. Инфра-почечных доноров брюшной аорты пятки на носок манжеты конец-в-бок анастомозировали получателю брюшной аорты и доноров почечной вены / IVC патч конца в сторону анастомозировали получателю брюшной нижней полой вены (НПВ) , Мочеточник затем вводят в якорь и в мочевой пузырь, как описано Хан и др 3.
Для этого исследования необработанные трансплантатов только с времен теплой ишемии (то есть., Не холодно ишемия) не сравниваются. В этом случае тепловой ишемии относится ко времени от прекращения кровотока через донорской почки (шаг 1.11 ниже) и реперфузии трансплантата у реципиента (шаг 2,11 ниже). Холодовой ишемии относится ко времени, что почки не перфузии и не хранится в холодильниках до начала процедуры имплантации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши были приобретены у The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) и были размещены под патогенов условиях в Университете Колорадо Денвера, Барбара Дэвис Центр Animal фонда в соответствии с NIH Руководства и с согласия университета Колорадо в Денвере от IACUC.
1. донорской почки урожая
- Стерилизовать все инструменты, носить стерильные перчатки на протяжении всей процедуры и поддерживать стерильную поле. Выполните все операции с использованием операционного микроскопа.
- Удалить хирургическим мыши доноров почки от фенобарбиталом-наркозом (60 мг / кг IP) доноров. Определить глубину анестезии схождения крайнем случае, и наблюдать частоту дыхания.
- Клип мех затем обездвижить мыши по 4-полосных ограничений. Подготовьте кожу повидон-йода и драпировка мыши в стерильном моды.
- Сделайте 2 см срединный разрез брюшной вертикальный и проникновения в брюшную полость. Отвести кишечника сверху и воплощать егона груди. Держите кишечника, завернутый в стерильную марлю влажной в течение всей процедуры.
- Определить большие сосуды брюшной и мобилизовать их, выявлять любые поясничные филиалов и либо прижечь или перевязывать их 10/0 нейлоновой нити.
- Сразу дистальнее левой почечных сосудов дразнить нижнюю полую вену (IVC) и брюшной аорты (АА) друг от друга тупым над примерно 2 мм. Перевязывать с 10/0 нейлона и разделить небольшую артериальной и венозной ветви с почечных сосудов.
- Теперь отделить почечную вену с почечной артерии, осторожно тупым этих структур. Это позволяет для точного создания пластыря Каррел на проксимальном конце почечной вены, которая будет использоваться для формирования анастомоза конец-в-бок получателям IVC.
- Определить, перевязывать и разделить левую надпочечников сосуды. Это позволяет доступ к надпочечников аорты и 6-0 шелк шов находится вокруг аорты в подготовке для лигирования, но не привязан в это время. Мобилизовать почку, сосуды и мочеточник от окружающих приборной панели. Поверните почку права и перевязывать / разделить любые задние ветви. Затем верните почку слева.
- Теперь направьте внимание на мочеточнике. Не нарушая почек рубчик освободить мочеточник от окружающих облицованы Стараясь сохранить мочеточника сосуды. Разделите мочеточник в уровне семявыносящий проток. Почки готов для восстановления.
- Медленно введите 300 единиц гепарина в дистальной IVC, таким образом, heparinizing донора. Tie вниз 6-0 шелковой нити, расположенных вокруг надпочечников АА и заливать левой почки с помощью дистальной аорты с брюшной 0,8 мл гепарина физиологического раствора (100 ЕД / мл).
- После перфузии перестал создать венозный Carrel патч немедленно устранить обратный поток в почках. Отвести в сторону почечной вены почки выявления АА и почечной артерии под.
- Разделите аорты, прилегающей к почечной артерии, создавая каблук и ке манжеты, как показано на рисунке 1. Снимите с почками, сосуды и мочеточник от донора.
- Удалите почки непосредственно к предварительно подготовленной получателя (0 мин холодное время ишемии) или хранили при 4 ° С в растворе выбора для заданного времени до времени имплантации. Эвтаназии доноров от exsanguanation и цервикальной дислокации. Общее время, чтобы восстановить донорскую почку ок. 15-20 мин.
2. Почки Имплантат Техника
- Обезболить мышь получатель с фенобарбиталом (60 мг / кг IP начальной дозе 25 мг, / кг IP-дополнительные дозы, если требуется). Определить глубину анестезии схождения крайнем случае, и наблюдать частоту дыхания. Клип мех затем иммобилизации мышь, 4-полосных ограничений и применять глазной мази для глаз. Подготовьте кожу повидон-йода и драпировка мыши в стерильном моды.
- Сделайте 2 см срединный разрез брюшной вертикальный и проникновения в брюшную полость. Отвести кишечникасверху и воплощать на груди. Держите кишечника, завернутый в стерильную марлю влажной в течение всей процедуры.
- В это время выполнять правой нефрэктомии. Перевязывать почечной артерии и вены с 6-0 шелковых швов. Акцизный дистальных почек к швов. Перевязывать мочеточник 6-0 шелка, а затем разделить проксимальнее почки.
- Изолировать брюшной аорты и нижней полой вены (НПВ) ниже почечных сосудов. Поместите 4-0 хлопка связей вокруг аорты и НПВ выше, то ниже в анастомоза. Выявление и перевязывать любые поясничные суда в области с 10-0 нейлона шва.
- Узел хлопковые связей, сначала уступает Вслед за начальником. Таким образом, некоторое количество крови сохраняется в аорте, делающего aortotomy легче.
- Формируют aortotomy с иглой 30G, чтобы войти в просвет аорты. Расширьте разрез с мелкими микро ножницами до длины примерно 2 мм.
- Сделайте конец боковой анастомоз донорского аорты пятки на носок манжеты нааорта получатель в следующим образом. Поместите 10-0 нейлона шов пребывания стежка в донорской аорты и нижней углом разреза в аорте получателя и галстуке.
- Поместите второй 10-0 нейлона противоположную первой в донорской аорты и верхней углу разреза в брюшной аорты и галстуке. Сделайте работает шва от начальника к уступает в боковой стенке аорты и галстук против ранее размещенных пребывания стежка. Затем шов медиальной стенки в рабочем моды и галстук.
- Сделайте конец боковой анастомоз донорского почечной вены получателю IVC в следующим образом. Прокол IVC с 30G иглу и расширить разрез с мелкими микро ножницами. Свяжите доноров почечной вены в нижней углу разреза в нижней полой с 10-0 нейлона. Сделайте работает шва между почечной вены и НПВ и галстуке.
Примечание: Это также важно, чтобы всю толщину проходит из хирургической иглы в том числе сосудистой adventitIA и интима будут достигнуты. Выворачивания краев также гарантирует, что есть интима к интиму контакт, который помогает в герметизации и исцеления анастомозов. В то время как кровоостанавливающее средство свертывания может быть полезным для снижения утечек, мы рекомендуем, чтобы хирург, а не полагаться на хорошей технике. - Убедитесь, что анастомозы "чистый". То есть, что противоположные стены не поймали при размещении стежков. Это приведет к значительному сужению течь, что приведет к неудачной трансплантата и в крайних случаях к паралич задних конечностей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Еще жизненно важным фактором является обеспечение того, натяжение анастомоза линий шва, также является оптимальным. Слишком свободный и будет необратимым утечка, слишком туго и стриктуры течь приведет. Если на артериальной стороне это приведет к недостаточной перфузии трансплантата, при венозной на стороне перегруженной почек приведет. - Отпустите дистального 4-0 хлопка галстук восстановлении венозного потока. После гемостаза в венонам анастомоза наблюдается постепенно ослабить проксимального 4-0 хлопка галстук и наблюдать артериальное анастомоз для гемостаза.
- Удалить хлопковые связи с мышью только обе анастомозы считаются безопасными. Пирс мочевого пузыря с 20 G иглой, создавая два отверстия.
- Pass кончики изогнутых щипцов через отверстия и вытащить доноров мочеточник через мочевой пузырь с помощью пинцета с проксимального конца мочеточника быть прикреплена к стенке мочевого пузыря с двумя 10-0 нейлона швов. Обрежьте излишки длины мочеточника, выступающей из второго отверстия, позволяющего мочеточник, чтобы убрать в мочевом пузыре и закройте отверстие с двух 10-0 нейлона швов.
- Вернуться кишечника в брюшной полости. Закройте брюшной стенки в двух слоев, используя 5-0 шелковой нити в рабочем моды.
- Администрирование 1,0 мл болюс стерильной теплой физиологического раствора в брюшную полость в качестве инфузионной терапии при закрытии, и вводят 0,8 мл физиологического раствора подкожно после операции. Ни один другой supportiVe меры необходимы во время операции.
- Восстановление животное на потепление одеяло. Всего имплантат время ок. 35-45 мин. Администрирование анальгетики, такие как бупренорфин, 0,05 мг / кг, подкожно, 0,1-0,2 мл в начале процедуры и каждые 6-12 ч в течение 72 ч послеоперационной.
3. Контралатеральный Нефрэктомия
- В зависимости от требований протокола, через несколько дней после процедуры имплантации, выполнить контралатеральной нефрэктомии под анестезией изофлуран (5% вдыхаемого изофлуран для индукции, 1,5-2,0% для технического обслуживания).
- Введите брюшной полости и осторожно втяните кишечника к правой животного. Expose левую почку и тупой рассекают от окружающих фасции.
- Перевязывать почечной артерии, вены и мочеточника с 6-0 шелковых швов, а затем вырезать выше швов почку и удалить почку. Всего оперативное время составляет ок. 10 мин.
4. Прививка Оценка
- Мера сыворотки creatiдевять помощью метода щелочного пикрат (реакция Джаффе).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эта хирургическая техника позволяет либо простых привитых выживания / отторжения исследований, или достаточно сложных экспериментальных протоколов. На рисунках ниже мы демонстрируем преимущества использования этой усовершенствованной техники артериальное анастомоза. Используя эту технику, мы значительно сократили частоту артериального тромбоза с 35% до 0%, таким образом, повышение производительности. Мы использовали этот метод для более года с тем же результатом 0% тромбоза поддерживается. Рисунок 1 описывает способ формирования артериальной пятки на носок манжеты, которая является основой этой новой техники. Это манжеты предусмотрен больший анастомоза и более прямой путь в кровоток в почках. Оба из этих пунктов приведет к значительному уменьшили турбулентность, тем самым снижая вероятность активации тромбоцитов и образованию тромба.
Рисунок 2. иммуногистохимического анализа. (А) Периодическая кислота-Шиффа окрашенных раздел управления, не-TRAnsplanted почек. (B) сингенных пересадка почки в POD 8 используя пересмотренный технику демонстрирует нормальную проксимальных канальцев клеток, которые кубический, с четким цитоплазме и ядре круглого света в центре камеры. Существует свидетельство мягкий щетка границы повреждения (стрелки), но большинство из кисти границы регулярны и хорошо сохранились. Увеличение: 400x.
Таблица 1. Сравнение частоты тромбоза и ишемии теплое время между двумя методами. Все величины выражены как среднее ± SD. Для одиноких сравнений, нормально распределенные данные оцениваются с помощью непарных, два-Стьюдента т испытания, и не-нормально распределенные данные анализируются непараметрического теста непарного Манна-Уитни U. Значения Р менее 0,05 считаются статистически significanт.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Освоение этой техники трансплантации трудно, но как только достигается это очень мощный инструмент исследования. Пациент хирург / исследователь будут вознаграждены вниманием к деталям и консистенции техники, которая является ключом к овладению любой хирургической процедуры, тем более в небольших моделях животных. Технические трудности овладения пересадку почки мыши много складок, и это весьма вероятно, что опыт других небольших моделей трансплантации животное должно быть получено, прежде чем приступать эту процедуру.
Важно убедиться, что анастомозы "чистый", то есть, противоборствующие стенки сосудов не должна быть поймана при размещении стежков, чтобы поддерживать патент просвет. В противном случае будет значительная сужение течь, что, скорее всего, результат в неудачной трансплантата, а в крайних случаях может привести к задних конечностей паралич. Это также важно, чтобы всю толщину проходит из хирургической иглы в том числе сосудов адвентиции и интимы достигаются, поскольку это приводит в надлежащий evertion краев, обеспечивающих, что есть интима к интиму контакт, который помогает в герметизации и исцеления анастомозов. В то время как кровоостанавливающее средство свертывания может быть полезным для снижения утечек, мы рекомендуем, чтобы хирург, а не полагаться на хорошей технике.
Также внимание должно быть уделено обеспечению натяжение анастомоза линий шва является оптимальным, слишком свободно и не будет необратимым утечка, плотного и сокращения потока приведет. Если на артериальной стороне это приведет к недостаточной перфузии трансплантата, при венозной на стороне перегруженной почек приведет. Достижение этой правильное натяжение вопрос практики и опыта с другими маленькими моделями животных микрососудистых будет большим подспорьем. Прежде всего, консистенции техники и непоколебимой внимание к деталям будет дают отличные мыши и выживаемость трансплантата, и функции по пересадке почки.
т "> Ограничения этого метода определяются только применений, которые могут быть применены исследователем. Как и в любом порядке микрососудов, пока хороший метод наблюдается результаты должны быть воспроизводимыми.Заболеваемость артериального тромбоза, используя эту технику, резко сократилось. Это приводит, по меньшей мере 1/3 всех операций по пересадке почек превращаются из потенциальных технических сбоев в используемых данных, что приводит к снижению затрат и повышению производительности труда.
Как полностью васкуляризированной, модели ортотопической трансплантации будущие приложения будут включать отказ / исследования толерантности, явление задержки функции трансплантата и исследований в механизмах ишемии / реперфузии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана 1R03DK096151.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant Proc. 5 (1), 721-725 (1973).
- Kalina, S. L., Mottram, P. L. A microsurgical technique for renal transplantation in mice. Aust N Z J Surg. 63 (3), 213-216 (1993).
- Han, W. R., Murray-Segal, L. J., Mottram, P. L. Modified technique for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 19 (6), 272-274 (1999).
- Ge, F., Gong, W. Strategies for successfully establishing a kidney transplant in a mouse model. Exp Clin Transplant. 9 (5), 287-294 (2011).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Zhang, Z. Kidney Transplantation in Mice. Experimental Organ Transplantation. Chen, H., Qian, S. , Nova Science Publishers. 45-64 (2013).
- Zhang, L., Moskovitz, M., Piscatelli, S., Longaker, M. T., Siebert, J. W. Hemodynamic study of different angled end-to-side anastomoses. Microsurgery. 16 (2), 114-117 (1995).
- Liu, Q., Mirc, D., Fu, B. M. Mechanical mechanisms of thrombosis in intact bent microvessels of rat mesentery. J Biomech. 41 (12), 2726-2734 (2008).
- Chesnutt, J. K., Han, H. C. Tortuosity triggers platelet activation and thrombus formation in microvessels. J Biomech Eng. 133 (12), 121004 (2011).
- Han, H. C. Blood vessel buckling within soft surrounding tissue generates tortuosity. J Biomech. 42 (16), 2797-2801 (2009).
- Gutierrez-Diaz, J. A., et al. Intraluminal thrombus and neointimal hyperplasia after microvascular surgery. Surg Neurol. 24 (2), 153-159 (1985).
- Khouri, R. K., Cooley, B. C., Kenna, D. M., Edstrom, L. E. Thrombosis of microvascular anastomoses in traumatized vessels: fibrin versus platelets. Plast Reconstr Surg. 86 (1), 110-117 (1990).
- Johnson, P. C., et al. Initial platelet deposition at the human microvascular anastomosis: effect on downstream platelet deposition to intact and injured vessels. Plast Reconstr Surg. 90 (4), 650-658 (1992).
