Introduction
Böbrekler, çeşitli maddeler için homeostatik dengeyi korumak ve toplam kan basıncını belirleyen bir şekilde kan hacmini düzenler. Hiper veya hipotansiyon arasında değişen renal filtrasyon, geri emiliminin veya salgı kurşun bozukluklar veya eşlik patolojik durumlar, sonunda böbrek nakli gerektiren son dönem böbrek hastalığı için. kapiller endotel, bazal membran ve epitel hücreleri tek-hücre tabakası - - yarık diyafram bütünlüğü ve işlevi 1 korunmasında önemli bir rol oynamaktadır Podositler renal filtreleme birimi (glomerulus) üç tabakadan oluşur. Permselektif glomerüler filtre Disfonksiyon gibi proteinüri olarak makromoleküllerin, idrar kaybına neden olur. Çeşitli ajanlar glomerüller filtrasyon bariyerinin bütünlüğünü belirleyen Podositler ve ayak süreçleri, yapısını etkileyebilir.
Podositler glom bakım katılaneruli filtrasyon işlevi. Bu Podosit tarafından uygunsuz kalsiyum taşıma hücre hasarı yol açar ve nefropatilerin 2,3 çeşitli biçimlerde ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı tespit edilmiştir. Bu nedenle, podosit fonksiyonunun çalışmalar için etkili olacaktır hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri, doğrudan ölçümü için izin veren bir modelinin geliştirilmesi. İzole glomerüller önce albümin yansıma katsayısı ölçümü 4 ve bütün hücre elektrofizyolojik patch-kelepçe ölçümlerde 5,6 integral hücresel akımların değerlendirmesini değiştirir dahil çok sayıda çalışmalarda kullanılmıştır. Mevcut yazıda, farmakolojik ajanların uygulamalarına tepki olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri ölçmek hücrelerin içinde kalsiyum bazal düzeylerini tahmin ve bireysel kalsiyum kanalları aktivitesini değerlendirmek için araştırmacı izin veren protokol açıklar. Ratometric kalsiyum konsantrasyonu ölçümleri ve patch-kelepçe electrophysiology sırasıyla podosit ve kanal aktivitesi olan hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri belirlemek için kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan kullanımı ve refah Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan protokoller aşağıdaki Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı NIH Kılavuzu'na uygun olmalıdır.
1. Böbrek Gömme
- (Ancak farklı yaş ve cinsiyet diğer suşları uygun değişikliklerle kullanılabilir, bir Sprague Dawley suşu olan önerilen) 8 ila 12 haftalık erkek sıçan kullanın.
- IACUC protokolü tarafından izin verilen prosedüre göre hayvan anestezisi; anestezi derinliği izlemek ve hayvan kontrol edin. cerrahi ayrıntılı bir açıklama 1.3 gerçekleştirilebilir göre - 1.8 Ilatovskaya ark bulunabilir 7.
- Uygun anestezi sonrasında, sıcaklık kontrollü cerrahi masaya hayvan koyun (yukarı uzunluğu 3 inç) karın orta hat kesi yapmak ve vena kava ve aorta ortaya çıkarmak.
- Çölyak ve superior mezenterik arterler ve abdominal etrafında bitişik harfleri yerleştirinyukarıda aort; Arter yok.
- Renal arterlerin altında abdominal aorta incelemek ve çevresinde iki bitişik harfler koyun, ancak lige yok künt, daha sonra bitişik harfler üzerinde aorta kelepçe ve alt iplik kravat.
- Kelepçe altında (PBS ile dolu bir şırınga pompası takılı) bir polietilen PE50 boru ile aort kateter ve ikinci dikilen ile kateter düzeltmek; , kelepçe kaldırmak pompa açın ve aorta bağlanır ve çölyak arterler ile mezenterik. Hızla baskıyı hafifletmek için renal ven kesi yapmak.
- / Dakika 6 ml 'lik bir oranda, 2 veya 3 dakika için önceden soğutulmuş PBS ile aort infüze.
- Perfüzyon, rüsumat durdurun ve 7 böbrekler açarlar ve PBS çözüm buz üzerine koydu. IACUC tarafından onaylanmış protokole göre hayvan Euthanize.
Sıçan glomerulusların 2. izolasyonu
- RPMI 1640 içinde% 5 BSA, taze çözelti 30 ml hazırlayın.
- Bir jilet ve makas kullanarak,Her iki böbreğin korteks izole ve ardından homojen hale gelinceye kadar kıyma. Bu prosedür, önceki 7 tarif edilmiştir.
- 100 gözlü paslanmaz çelik elek içinden geçen aşaması esnasında kıyılmış doku itin bir spatula kullanılarak (BSA / RPMI çözeltisi% 5 önceden ıslatılmış). Akış ve yer çekimi kuvveti ile akış ile 140 ağ elek boyunca geçmesine izin toplayın.
- Bir ön-ıslatılmış 200 gözenekli elek kullanılarak bir elek 140 ağ toplanan akış geçirgen filtre süzüntü atmak ve 10, elek üst yıkama - ilgili tortu glomerül toplamak için hazırlanmış BSA / RPMI çözeltisi 15 ml Elek.
- Kadar 20 dakika boyunca tüpün altındaki glomerüller tortu 15 ml tüp buz üzerinde glomerül BSA / RPMI çözeltisi koyun ve bildirin. Tüpün alt glomerüller konsantre açıkça görülecektir. Tüp içinde yaklaşık olarak 2 ml bırakarak, fazla çözelti çıkarın.
3. Tek kanallı Patch-kelepçe Electrophysiology
- MW 70.000 ile kaplanarak 5 x 5 mm kapak cam cips hazırlayın - 150.000 poli-ʟ-lizin ve kurumaya bırakın. Kapak cam başına su içinde% 0.01 steril filtre edilmiş çözeltisi, yaklaşık 30 ul kullanın.
- RT deneysel çözümler Isınma ve patch-kelepçe odasını ve pipet doldurun. TrpC kanalları izleme, mM banyo solüsyonu kullanın: 126 NaCl, 1 CaCl2, 10 HEPES, 2 MgCl2, 10 glukoz, pH 7.4; Pipet: 126 NaCl, 1.5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glukoz; pH 7.4.
- Tavsiye çalışmalarda (ilgili olmayan endojen kanal aktivitesini engellemek için pipet solüsyonuna inhibitörleri ekleme vardır: 100 uM niflumik asit ya da DIDS (Ca2 + ile aktive edilen Cı engellemek için - kanalları), 10 mM TEA (inhibe yüksek ölçüde iletkenliğe sahip Ca2 + - bağımlı K + kanalı), 10 nM iberiyotoksin (,) 10 uM nikardipin Ca2 + ile aktive edilen K + kanallarını bloke etmek (N-tipi Ca engellemek2+ doğrudan patch-kelepçe deneyden önce kanalları)).
- Yavaşça glomerüller içeren çözüm karıştırmak ve sonra poli-ʟ-lizin kaplı kapak cam cips bunun yaklaşık 50 ul uygulayın. Glomerül yaklaşık 5 dakika süreyle tutunma olsun.
- Patch-kelepçe odasına banyo solüsyonu ile önceden doldurulmuş için glomerül cam cips taşı; serbest glomerül kaldırılmasını sağlamak için 1 dakika için / dakika 3 ml bir oranda bölme serpmek.
- Bir hücre ekli modunda 7 geleneksel bir yama-kelepçe deney. Bir cam pipet ile, (7-10 M? Pipet direnci), bir pipet ve hafif bir emme (izole glomerulus yüzeyi üzerinde bir podosit bağlanmış bir pipet uygulayarak podosit membran arasında yüksek dirençli bir yalıtım oluşturmak ilgili, Şekil 2'de gösterildiği gibi olduğu sol).
- Hücre bağlı ölçümler için, sekiz kutuplu Bessel filtresi ile 300 Hz akımları düşük geçmektedir.
- U6 saat - se kadar 4 için patch-kelepçe deneylerinde glomerüller izole. Buz üzerinde stok glomerüller fraksiyonu tutun.
Podositler hücre içi kalsiyum konsantrasyonu 4. oranlı metrik Konfokal floresans ölçümleri
- Konik tüp, 0.5 ml (2.5 açıklanan) glomerüller fraksiyonu 500 ul yerleştirin ve kalsiyum boyalar Fura Kırmızı, AM ve Fluo-4, AM ekleyin. 2 mm ve (DMSO içinde çözülmüş -20 ° C'de saklayın) Fura Kırmızı, AM ve Flu-4, GM, sırasıyla 1 mM stok konsantrasyonları kullanımı ve glomerüller fraksiyonunun 500 ul her bir boya 2.5 ul kullanın. Hemen boyaların ilave edilmesinden sonra, alüminyum folyo ile tüp kapsamaktadır.
- Oda sıcaklığında 1 saat için en az 20 dakika kadar bir döner çalkalayıcı üzerinde yer borular.
Not: Farmakolojik maddeler, bu aşama sırasında eklenebilir. - Cam lamelleri hazırlanması poli-ʟ-lisin ile kapak ve 70 ° C'ye kadar ısıtıldı levha seti kullanarak kurutma sağlar.
- Kalsiyum boyalar yükleme komplet sonraE, poli-ʟ-lizin kaplı kapak çözeltiyi içeren glomerül 100 ul uygulamak ve bununla ilgili olarak, 5 dakika için yüzeye dönelim. Bir görüntüleme odasına glomerüller bağlı lamelleri monte edin ve banyo çözeltisi (() mM olarak ihtiva eden: MgCl2 145 NaCl, 4.5 KCl, 2, 10 HEPES, pH 7.35) ile serpmek 3 ml / dk hızda kaldırmak için bekâr glomerüller ve kalan boyalar.
- Bir 488 nm eksitasyon dalga boyu ve radyasyon filtreleri (sırasıyla Fluo-4 ve Fura Red için 525/25 ve 650/25 nm) konfokal lazer tarama mikroskobu ayarlayın. İstediğiniz bir frekans ve çözünürlük görüntüleme yazılımı ayarlayın.
- Aydınlık içinde glomerüller bulun ve sonra floresan sinyalinin tespiti açın. Sinyalin doygunluk önlemek için her boya için lazer yoğunluğunu ayarlar. Doğrudan cama bağlı Podositler ile odak düzlemi seçin. Bu ilaca yanıt olarak bir glomerulus büzülmesiyle kaynaklanan etkiyi en aza indirirUygulama. Seçim glomerulus iyi cama takılı olduğundan çift çek;
- Seçim odak düzlemi görüntüleme başlayın, (yüksek çözünürlüklü görüntü için 60X / NA 1.4 veya benzer objektif lens kullanın. Hızlı Ca 2+ geçici değişiklikleri görmenizi 4 sn set frekans ile 512 x 512 görüntü almak) ilgi ilaçları uygulamak ve yanıtı kaydedin.
- (Glomerül yüzeyinde Podositler görüntülenmesini sağlamak için, mümkün olduğu kadar camın yüzeyine yakın olarak) arzu edilen bir odak düzlemi seçin. Fluo4 ve FuraRed kanallarda floresan yoğunluğunu kontrol edin ve glomerulus açıkça aydınlık görülür olduğundan emin olun.
- Görüntüleme başlatın. Herhangi bir ilaç uygulamasından önce, bazal floresans rekor en az 1 dakika sinyali (hiçbir ani sivri veya sinyal solma) kararlı olduğundan emin olmak için.
- Bir mikropipet yardımıyla istenilen ilaçları uygulayın; dikkatli olmak ve ilaç iyi diffüz başardı sağlamak ve glomer ulaşmakulus. Gerekirse, seçilen odak düzlemi izlemek ve çünkü ilaç uygulamasının odak dışına taşımak olmadığını kontrol ediniz hafifçe banyo çözüm karıştırın.
- Fluo4 ve FuraRed sinyalleri için flüoresan yoğunluğundaki değişimlerle kaydedin. Kayıt sinyal plato seviyesine ulaştığında veya bir zirveye ulaşır ve daha sonra bazal dönene kadar bekleyerek, yeterince uzun olduğundan emin olun. Gerekirse Çözelti değişiklik ya da başka herhangi bir ilaç ilave gerçekleştirin.
- Kaydı durdurmak ve yazılım özgün biçiminde dosyayı kaydedin.
Kalsiyum Ölçümleri 5. Görüntü Analizi
- Yerli ND2 formatındaki görüntüleri içe izin veren ND Programı eklentisi ile donatılmış ImageJ açık yazılım ile görüntü analizi yapın.
- Görüntü dizisi İthalat; Kanal bölmek ve bir hyperstack gri tonlama modu kullandığınızdan emin olun.
- O kadar ImageJ yazılımı analiz → Araçlar → ROI yöneticisi yolunu izleyinkalem ROI yöneticisi penceresi. Oval seçim aracını ve ROI Yöneticisi "Add (t)" fonksiyonunu kullanarak faiz (Podositler) birkaç bölgeleri seçin. Son ROI olarak arka planda alanı seçin; (→ Kaydet fazla) seçilen ROI kaydedin.
- Analizler için seçilen kanalı içeren pencereyi vurgulayın. , YG Yöneticisi Çoklu Ölçüm işlevi → Daha kullanın dışarı çıkar diyalog içinde "tek satır dilim başına" kutusunu işaretleyin ve sonra Tamam 'ı tıklatın. seçeneğini ayarlayın Ölçümleri → menü seçeneği Sonuçlar girmek "gri Ortalama değer" ve görüntülenir her ROI için piksel yoğunluğu değerlerini hesaplamak: Sonuçlar Sonuçları penceresinde ayarlanabilir formatında gösterilir Her ROI için ayrı sütunlarda Sonuçları penceresi.
- Tercih veri analiz yazılımı içine her bir kanal (Fluo-4 ve Fura Kırmızı) için ölçülen ROI yoğunluk değerlerini kopyalayın; Her bir DAT dan çıkarma arka plan yoğunluğu değerleribir nokta.
- Her bir zaman noktası için, Fura kırmızı kanallara Flu-4 yoğunluklarının oranı hesaplanır. Plot dağılım / her ROI için Ca 2+ geçici hat noktası zamanı değişir. Seçilen glomeruli için ortalama / SE değerlerini hesaplamak.
Not: Zaman sütunu 4,5 seçilen görüntüleme frekansına göre ayarlanması gerekir.
Flu-4 Floresan Sinyal kullanma 6. Hücre içi kalsiyum Konsantrasyon Hesaplamaları
- Glomerulusların bir örneğini alın ve 4.7 adıma deneysel protokol yukarı gerçekleştirin. Eşiğe kaydından sonra banyo çözeltisine ve kayıt floresan yoğunluğu artışı (10 uM olmalıdır banyo odasında nihai konsantrasyon) İyonomisin ekleyin. Yoğunluk maksimuma ulaşır ve çürüme başladığında, MnCI2 eklemek floresan 8 gidermek için (nihai konsantrasyon 5 mM olmalıdır).
- 6.1 elde edilen verileri analiz edin. Elde edilen Flu-4 sinyal ROI yoğunluğu değerleri doğrultusunda kopyalamaTercih analiz yazılımı ile 5,1-5,5 açıklanan protokole.
- Bir formül kullanılarak ROI karşılık gelen Podosit olarak (nM) hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu hesaplayın:
Kd Fluo-4 (345 nM) sabit, önceden belirlenmiş bir ayrılma olduğu, F (taban) için kalsiyum konsantrasyonunun hesaplanması olan zaman noktasında yoğunluğudur ve F dakika ve Fmax de yoğunluk değerleri (iyonomisin uygulama sonrası) ve (MnCI2) ile flöresan soğutmadan sonra, maksimum kalsiyum yük noktası, sırasıyla, (Şekil 3'e bakınız).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada Podositler kalsiyum seviyeleri akut değişiklikler ölçülerek değerlendirilmesi amaçlanmıştır. 1, taze bir Podositler yüksek çözünürlüklü canlı floresan konfokal görüntüleme ve tek iyon kanalı aktivitesi kayıtları gerçekleştirmek için tasarlanan deney protokolünün şematik bir temsilini göstermektedir, Şekil İzole kemirgen glomerüller. Sıçan anestezi sonra Kısaca, böbrekler kan bunları temizlemek için PBS ile yıkanmalıdır. Ardından, böbrekler kesilmiş ve decapsulated ve glomerül diferansiyel eleme yoluyla böbrek korteks izole edilir edilir. Numunenin bir kısmı patch-kelepçe analizi için alınabilir ve geri kalanı floresan kalsiyum boyalar Fluo-4, AM ve Fura Kırmızı yüklenebilir, konfokal rasyometrik kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için AM.
Tek iyon kanalı aktivitesinin elektrofizyolojik ölçümler glomerül izolasyonundan sonra hemen gerçekleştirilebilir. İyon cha Aktivitennels yama klemp yöntemi hücre bağlı ve bütün hücre konfigürasyonları, her iki ölçülebilir. Gösterilen yaklaşımın uygulanabilirliğini göstermek için tek trpC gibi kalsiyum-iletken iyon kanalı aktivitesinin (Şekil 2) kaydıdır. Buna ek olarak, bu, hücre-geçirgen ya da reseptör bağlanma, tek iyon kanallarının seviyesinde Podositler kalsiyum akışı üzerindeki etkilerini test etmek için ilaç uygulamak mümkündür.
Tek iyon kanalı etkinlik değerlendirmesini sağlayan bir yaklaşım Podosit fonksiyonunu karakterize veri çeşitli üretir. Bununla birlikte, büyük ölçüde tüm hücre seviyesinde kalsiyum konsantrasyonu değişikliklerinin ölçülmesiyle desteklenebilir. Bu tür çalışmalar yapmak, taze izole glomerül yüksek verimlilik konfokal görüntüleme için floresan boyalar ile yüklendi. Yüksek optik çözünürlük sayesinde bir anda birkaç Podositler kalsiyum düzeyleri izlemek mümkündür. 3 sürülme süresini gösterir ŞekilPodosit içinde kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri değerlendirmek için tasarlanmış tipik deney için kurs. Podosit içinde bazal kalsiyum konsantrasyonu Fluo-4 floresan dayalı değerlendirilmiştir. 1 dakika boyunca (F), bazal sinyal yoğunluğu kaydedildikten sonra, İyonomisin uygulanır ve daha sonra MnCI2 söndürüldü olan, en yüksek floresan (Fmax) ulaşılabilir neden olur (F dakika not edilmiştir) hazırlandı. 6.3 aşağıdaki formüle göre, deneyin her bir zaman noktasında Fluo-4 sinyalin yoğunluğu daha sonra hücre içinde kalsiyum iyonları, gerçek konsantrasyon tercüme edilebilir. Grafikte görüldüğü gibi, arka plan (yaklaşık 400 rasgele birim) içinde fluoresans ortalaması sağlıklı sigara apoptotik hücrelerde hücre içi kalsiyum için normal bir konsantrasyon aralığı içinde 140 nM, anlamına gelir.
açıklanan yaklaşımın önemi ve faydası akut kalsiyum transie ölçmek için izin veren başka bir uygulama tarafından haklıçeşitli ilaçlara yanıt olarak Podositler olarak nts. Şekil 4A önce ve 10 um ATP ilave edildikten sonra (4,5 tarif edilmiştir), 2 mM kalsiyum içeren çözelti içinde Flu-4 ve Fura kırmızı ile boyanmış sıçan glomerül temsili görüntüleri göstermektedir. Yeşil dramatik bir artış dikkat (Fluo-4 AM) (oklarla işaretli) Podositler floresan ve Fura Kırmızı floresan bir düşüş (kırmızı Pseudocolor). FuraRed iner ise hücre içinde kalsiyum konsantrasyonu, 4 şiddeti artar Fluo arttırır zaman Fluo4 ve FuraRed, ters bir şekilde, yani 488 nm dalgaboyu kalsiyum konsantrasyonunda bir artış göstermektedir. Bu nedeniyle FuraRed fluorofor ikili uyarım doğası mümkündür. Eksitasyon dalga boyuna bağlı olarak, floresan karşılık gelen bir artış veya azalış, kalsiyum-bağlı (420 nm) veya kalsiyum içermeyen (488 nm) florofor olarak davranabilir. Bu nedenle, tek başına bir rasyometrik görüntüleme modunda FuraRed kullanımı ancak requir mümkün420 nm ve 488 nm - iki uyarma dalga boyu es. Bu, en az iki kez (bir eksitasyon dalga boyu kullanımı ile karşılaştırıldığında) görüntüleme sıklığını azaltacaktır; Araştırmacı görüntüleme hızlı ayak uydurmak istiyorsanız eğer, görüntü çözünürlüğü azaltılmalıdır. Bu flüoroforlar, aynı 488 nm lazeri tarafından uyarılır ve emisyon spektrumlarına iyi bir farklılaşma temin edilebilir Bununla birlikte, Fluo 4 ile FuraRed, görüntüleme frekans çözünürlüğü veya azalma kaybı olmadan rasyometrik modu ile birlikte kullanılabilir. ROI özetlenmiştir tipik bir geçici Şekil 4A'da oklar Şekil 4B'de gösterilmektedir ile işaretlenmiş; Grafik net bir şekilde birkaç dakika içinde azalır 10 uM ATP ilave edildikten sonra Fluo4 / FuraRed yoğunluk oranı akut bir artış ortaya koymaktadır. Görüntüler her 4 saniye alındı ve bu nedenle, bu teknik, hücre içindeki kalsiyum konsantrasyonunda hızlı bir değişiklik gözlenmesi sağlar.
Deneysel protokol 1. şematik gösterimi Şekil. Hayvan doğru anestezi ve cerrahi için hazırlandıktan sonra, böbrekler, kan uzaklaştırmak için PBS ile temizlendi. Ardından, böbrekler kesilmiş ve decapsulated ve glomerül diferansiyel eleme yoluyla böbrek korteks izole edilir edilir. Burada, örnek bir parçası patch-kelepçe analizi için alınır ve geri kalan floresan kalsiyum boyalar ve konfokal rasyometrik kalsiyum görüntüleme yapılır ile yüklenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Podo içinde trpC kalsiyum kanallarının aktivitesini gösteren Şekil 2. Temsilcisi kayıttaze izole sıçan glomerüllerin lenfositler. Sol panel hücre bağlı konfigürasyonda bir elektrofizyolojik kayıt sırasında glomerülün yüzeyinde Podosit gövdesine bağlanan yama-kelepçe pipet gösterir; Bir glomerulus kapsüllü bir parçası resmin sağ alt köşesinde görülebilir. Bir -40 mV tutan potansiyelinde sıçan glomerül Podosit yapılan bir hücre bağlı yama trpC benzeri kanallar faaliyet Temsilcisi akım izi sağda gösterilir. c ve o ben kapalı ve açık kanal seviyelerini ifade, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Temsilcisi deney hücre içi kalsiyum düzeyini değerlendirmek için tasarlanmış Podositler. glomerüller Fluo-4, AM, floresan yoğunluğu başlangıca ve ionomisin ve MnCl 2 ilave edildikten sonra kaydedilmektedir ile yüklenir, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu ölçmek için. Grafik boya ve düşük floresan yoğunluğu (F dk) sonuçları söndürür ve MnCI2, (Fluo-4 floresan, F max maksimum üreten) iyonomisin tepki olarak floresan sinyal değişiklikleri gösterir. Her zaman noktası için floresan (sol apsis) yoğunluğu 6.3'de formülüne göre (sağ apsis) nanomol gerçek kalsiyum konsantrasyonu tercüme edilebilir. F F max ve F min hesaplanmıştır zaman zaman noktalarında Podositler gösteren görüntülerle-parçalar unutmayın. Burada gösterilen grafik bir daire (ROI) ile işaretlenmiş Podosit floresan yoğunluğunu yansıtır; görüntüler her 4 saniyede alındı."nk> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil ATP yanıt Podositler kalsiyum geçici 4. ölçülmesi. (A) önce ve 10 uM ATP ilave edildikten sonra 2 mM kalsiyum içeren çözelti içinde Fluo-4 (yeşil Pseudocolor) ve Fura Red (kırmızı Pseudocolor) ile boyandı, vahşi tip sıçan glomerul gösteren Örnek görüntüler. İlacın uygulanmasından önce daha düşük yoğunlukta, yeşil renkli flüoresan not edilmelidir. (B) 10 mikron ATP uygulanmasıyla Podositler uyarılmış hücre içi kalsiyum geçici örneğini özet. Inci kalsiyum deposu ve kalsiyum akını uyarılması ve tükenme hesapları ilacın, ilave aşağıdaki Flu-4 / Fura Kırmızı floresan yoğunluğu oranında güçlü ve hızlı bir artış dikkatE dışındaki hücre içinde, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun yükselmesi ile sonuçlanır. Hata çubukları aynı glomerulus 11 Podositler için hesaplanan ortalamaların standart hatası temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen bir yaklaşım, kemirgen glomerül Podositler kalsiyum işleme analizi sağlar. Bu teknik, patch-kelepçe tek kanallı elektrofizyoloji ve floresan rasyometrik konfokal görüntüleme uygulama sağlar. Bununla birlikte, her iki yaklaşım da kendi ayrı ayrı kullanılabilir. Önerilen protokol 1) böbrek temizleme dahil olmak üzere birçok nispeten basit adımları vardır; 2) diferansiyel eleme ile glomerül izolasyonu; 3) patch-kelepçe elektrofizyolojik deneyler veya hücre içi kalsiyum değişiklikler rasyometrik konfokal görüntüleme için floresan kalsiyum etiketleme boya ile glomerül inkübasyon.
Glomerül, Gloy göre modifiye edilmiş bir protokol izole etmek için ve ark., 5 kullanılmıştır. ayırıcı eleme mevcut tekniğin başlıca avantajı, karmaşık ve zaman alıcı bir aşamasını gerektirmeyen, böylece Bowman kapsülü olmayan glomerül üreten ve olmasıdırmanuel decapsulation evi. İzole fraksiyonunda glomerül çoğunluğu decapsulated edilir, ancak araştırmacı da, kapsüllü glomerül olduğunu farkında olmalıdır. Kapsül Podositler ulaşmasını engeller uyuşturucu gibi, Bowman kapsülü çıkardı glomerül görüntülü emin olmak için önemlidir. Şekil 2'de görüldüğü gibi kapsüllü glomerüller pürüzsüz ve yuvarlak şekilli görünmesi ise decapsulated glomerül, farklı kılcal damarların ve Podosit organları ile kaba bir yüzeye sahiptir. Ayrıca, Fluo4 ve FuraRed yüklenen glomerül decapsulated olanlara kıyasla daha az yoğun floresan sinyal yayarlar kapsüllü.
Elde edilen sıçan glomerül fraksiyon% 95 (proksimal tübül izleri ile) saf ve gerektiğinde kolayca western blot veya başka bir moleküler biyoloji uygulamaları için kullanılabilir olması. Bu hazırlık Podositler kılcal bağlı olduğu son derece önemlidir, bir parçası olarak sağlam ayak süreçleri ve fonksiyonunu muhafazaYerel glomerulus süzme tertibatı makine. Podositler kalsiyum taşıma mekanizmaları diyabet veya yüksek tansiyon 9-12 gibi hastalıklarda, böbrek komplikasyonları geliştirme ve önlenmesinde önemli bir düzenleyici rol alırlar. Akut yaralanma Podosit morfolojisi ve yapısını değiştirir ve proteinüri 2,3,13-15 neden olabileceği gerçeği ile kanıtlandığı gibi Podositler, geçirgenlik bariyerleri önemli katkı sağlamaktadır. Bu nedenle, kolayca bu hazırlanmasında taranabilir ilaçlara, bu hücrelerin, kalsiyum girişinin yanıt gözlemlemek için büyük bir önem taşımaktadır. Araştırmacı patolojik durumda Podositler tarama ise, genellikle, proteinüri ve glomerüller hasara neden örneğin, hipertansiyon ya da diyabet için, glomerül verimi sağlıklı hayvanlarda daha az saf olabilir anlaşılmalıdır. Her zaman kaybını önlemek için izolasyon sürecinin her aşamasında glomerülü kesirler izlemek için tavsiye edilirdokusu. Bazı durumlarda, yaş ya da çok genç hayvanlar ile ilgili yoğun hastalıklı glomerülü veya glomerül daha büyük / küçük gözenekli elek seçimi de dahil olmak üzere yalıtım işlemi için ayrı ayrı ayarlama gerektirebilir.
Biz Podositler 16 kalsiyum trpC kanallarının inhibisyonu non-steroid anti-inflamatuar ilaçların etkinliğini belirlemek için başlangıçta bu yaklaşımı uyguladık. Bu çalışmalar 7,16-22 ardından biz Podositler fonksiyonu kontrol eden pek çok kritik mekanizmaların oluşturulması için anlatılan teknikleri kullandı. Mesela biz sıçan Podositler P2 (pürinerjik) reseptörlerinin profili tarif ve fare glomerüllerinde Anjiotensin II kalsiyum akını düzenlenmesini tanımladık. Daha sonra el yazması 20 de tarif edildiği gibi, bir protokol fare gibi sıçanlarda değil, aynı zamanda diğer türlerde de sadece benzer çalışmalar gerçekleştirmek için adapte edilebilir. İki floresan kullanımı ile oranlı metrik kalsiyum flüoresan görüntüleme (boyalar - Fluo-4 ve Fura Kırmızı) ilave veri güvenilirlik sağlar ve gereken kalsiyum görüntüleme diğer floresan boyalar ile kombine edilebilir, eğer Podositler içindeki diğer maddelere değişiklikleri izlemek için. Örneğin, DAF-FM boya yardımı ile nitrik oksit ölçmek için bu yaklaşımı kullandık. Patch-Clamp elektrofizyoloji tek başına kullanılabilir ya da kalsiyum görüntüleme ile kombinasyon halinde (kurulum izin). Dışında kalsiyum kanallarından, teknik, diğer iyon kanallarının aktivitesini kayıt olanak verir. Son zamanlarda Dr Kurutma grubunun 23 tarafından gösterildiği gibi Dahası, transfeksiyon ve siRNA'nın kullanımı daha da uygulamanın alanını genişletebilir.
Konvansiyonel Epifloresans mikroskopi yerine daha az uygun konfokal görüntüleme burada kullanılabilir. Ancak, araştırmacı geniş alan floresan mikroskobu etkin hassasiyet genellikle out-of-focus ışığı ile sınırlı olduğunu farkında olmalıdır. Konfokal IMAGin Bu (karşılaştırmag) Tek ROI (Podosit) ya da ayak süreçlerinin yüksek görüntü çözünürlüğü üretmek için yetersizlik gibi sınırlamalar olur. Bu glomerülleri ve derin doku yüzeyi arasındaki ayırt etmek zor olduğu gibi Ayrıca, geniş alan mikroskopisi Podositler belirlenmesini zorlaştırır. Şu an itibariyle konfokal görüntüleme için çeşitli fluorophores ticari kullanılabilirliği çok daha iyi ve hızla genişleyen olduğunu. Alternatif olarak, Epifloresans çalışmaları kolaylıkla eşzamanlı hücre içi Ca 2+ ve tek kanal etkinlik kaydı sağlayabilir bir elektrofizyolojik kurulum ile kombine edilebilir. Filtre teker monokromator ve nötral yoğunluk filtreleri kurulum ile glomerülün Podositler ve Fura2-AM yükleme yaygın olarak kullanılan, ama her zaman kaliteli, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için uygun değildir.
Aynı zamanda izole, fonksiyonel glomerulus fizyolojik uyaranlara yanıt olarak hacmini değiştirmek mümkün olduğuna dikkat edilmelidir. Araştırmacı gerçekleştiren bu süre farkında olmalıDeneyler ve dikkatle odak kaybını önlemek için konfokal çalışmalar sırasında odak düzlemi seçin ve istenmeyen daralma veya gevşeme test etmek için yeni ilaçların seçimi üzerine kontrol deneyleri gerçekleştirmek.
Bu teknik kemirgen kökenden çeşitli farmakolojik tedaviler veya diğer manipülasyonlar sonra tek iyon kanalında kalsiyum akını değişiklikleri ve bireysel hücreler seviyelerini izlemek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Değiştirilmiş bir protokol kuşkusuz derece değerli bilgiler sağlayacaktır böbrek biyopsileri, elde edilen dokular için uygulanabilir Bu teknik, aynı zamanda, insan böbrek hastalığı çalışmalarında kullanılabilir. Ayrıca, kalsiyum konsantrasyonu ölçümleri normal ve patolojik şartlarda Podositler dahilinde ele kalsiyum düzenlenmesinde içine derinlemesine ve mekanik anlayış daha sağlayabilir gerçek zamanlı olarak elektrofizyolojik patch-kelepçe deneyler ile eşleştirilmiş olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar mikroskobu deneyleri ile mükemmel teknik yardım için Glen Slocum (Wisconsin Tıp Koleji) ve Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) teşekkür etmek istiyorum. Gregory Blass yazının kritik redaksiyon için kabul edilmektedir. Bu araştırma (AS) 1-15-BS-172, ve (DVI) Nefroloji American Society Ben J. Lipps Araştırma Bursu hibe Sağlık hibe HL108880 ve American Diabetes Association Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| Poly-ʟ-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| Tube rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Germany |
| Nikon confocal microscope (inverted) | Nikon | Nikon A1R | Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm |
| Objective | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | Silicone Compound | |
| Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low pass filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
| Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| TEA chloride | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | without antibiotics |
| BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% albumin solution |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Steel sieves: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
| mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | screen for CD-1 |
| Binocular microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Binocular microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| Polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia |  VetEquip, Inc. |
911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
- Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
- Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
- Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
- Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
- Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
- Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
- Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
- Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771 (2009).
- Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
- Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
- Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
- Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
- Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
- Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
- Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
- Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
- Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
- Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).
