Introduction
الكلى الحفاظ على التوازن استتبابي للمواد المختلفة وتنظيم حجم الدم في الطريقة التي يحدد مجموع ضغط الدم. الاضطرابات في الترشيح الكلوي، استيعاب أو إفراز الرصاص أو مرافقة الحالات المرضية، التي تتراوح بين المفرط أو انخفاض ضغط الدم لإنهاء مرحلة المرض الكلوي الذي يتطلب في نهاية المطاف زرع الكلى. وحدة تصفية الكلى (الكبيبة) ويتكون من ثلاث طبقات - البطانة الشعرية، الغشاء القاعدي وطبقة خلية واحدة من الخلايا الطلائية - podocytes، والتي تلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على سلامة شق الحجاب الحاجز وظيفة 1. الخلل في تصفية الكبيبي permselective يسبب فقدان البولية من الجزيئات، مثل بروتينية. عوامل مختلفة قد تؤثر على هيكل podocytes والعمليات أقدامهم، والتي تحدد على سلامة حاجز الترشيح الكبيبات.
وتشارك podocytes في الحفاظ على يسرقeruli ظيفة الترشيح. وقد ثبت أن تناول الكالسيوم غير لائق من قبل خلية رجلاء يؤدي إلى إصابة الخلايا ويلعب دورا هاما في تطور مختلف أشكال nephropathies 2،3. لذلك، ووضع نموذج الذي يسمح للقياس المباشر للتغيرات تركيز الكالسيوم داخل الخلايا سوف يكون مفيدا للدراسات وظيفة خلية رجلاء. تم الكبيبات معزولة تستخدم سابقا في العديد من الدراسات بما في ذلك قياس معامل الانعكاس الألبومين يغير 4 و تقييم التيارات الخلوية المتكاملة في خلية كاملة الكهربية القياسات التصحيح، المشبك 5،6. في هذه الورقة وصفنا البروتوكول الذي يسمح الباحث لقياس التغيرات تركيز الكالسيوم داخل الخلايا استجابة لطلبات من وكلاء الدوائية، وتقدير مستويات القاعدية من الكالسيوم داخل الخلايا، وتقييم النشاط الفردي قنوات الكالسيوم. قياسات تركيز الكالسيوم Ratometric والتصحيح، المشبك electropاستخدمت hysiology لتحديد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا ضمن النشاط خلية رجلاء وقناة، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
استخدام الحيوان ورعايته ينبغي أن تلتزم دليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التالية بروتوكولات مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC).
1. الكلى فلوش
- استخدام 8-12 اسبوع الفئران الذكور القديم (المقترح هو سلالة سبراغ داولي، ومع ذلك سلالات أخرى من مختلف الأعمار والجنسين يمكن استخدامها مع التغييرات المناسبة).
- تخدير الحيوان وفقا للإجراءات التي يسمح بها بروتوكول IACUC. رصد عمق التخدير وفحص الحيوانات. وصف مفصل للجراحة التي يتعين القيام بها في 1،3-1،8 يمكن العثور عليها في Ilatovskaya وآخرون 7.
- بعد التخدير المناسب، ووضع الحيوان على طاولة الجراحة التحكم في درجة حرارته، وجعل شق خط الوسط من البطن (ما يصل الى 3 بوصات في الطول)، وكشف الوريد الأجوف والشريان الأورطي.
- إدراج رباط حول الاضطرابات الهضمية والمساريقي العلوي الشرايين والبطنالشريان الأبهر فوق تلك. لا ligate.
- بلانت تشريح الشريان الأورطي البطني تحت الشرايين الكلوية، ووضع اثنين من الأربطة المحيطة به، ولكن لا ligate، ثم تضييق الشريان الأبهر فوق الحروف المركبة وربط موضوع أقل.
- يقثطر الشريان الأورطي مع أنابيب البولي ايثيلين PE50 (تعلق على ضخ حقنة مليئة PBS) تحت المشبك وإصلاح القسطرة مع ربطة الثاني. إزالة المشبك، بدوره على مضخة، وligate الشريان الأورطي والشرايين المساريقي مع الاضطرابات الهضمية. جعل بسرعة شق في الوريد الكلوي لتخفيف الضغط.
- يبث في الشريان الأورطي مع PBS المبردة قبل لمدة 2 أو 3 دقائق بمعدل 6 مل / دقيقة.
- وقف نضح والرسوم وdecapsulate 7 الكلى، ووضعها على الجليد في حل PBS. الموت ببطء الحيوانية وفقا لبروتوكول التي وافق عليها IACUC.
2. عزل الجرذ الكبيبات
- إعداد 30 مل من محلول جديدة من 5٪ BSA في RPMI 1640.
- باستخدام شفرة حلاقة ومقص،عزل القشرة من كل من الكليتين، ومن ثم اللحم المفروم حتى متجانسة. وقد وصفت هذا الإجراء في وقت سابق 7.
- دفع الأنسجة المفروم خلال الخطوة السابقة من خلال 100 شبكة المقاوم للصدأ غربال الصلب (غارقة مسبقا في 5٪ BSA / RPMI الحل) باستخدام ملعقة. جمع التدفق من خلال وبالقوة خطورة السماح للتدفق من خلال لتمرير من خلال غربال 140 شبكة.
- تصفية التدفق من خلال جمعها من شبكة 140 غربال باستخدام غارقة قبل 200 عيون غربال، تجاهل الترشيح، وغسل الجزء العلوي من غربال مع 10-15 مل من محلول استعداد BSA / RPMI لجمع الكبيبات أن الرواسب على غربال.
- وضع حل BSA / RPMI تحتوي على الكبيبات على الجليد في أنبوب 15 مل وترك الرواسب الكبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب لمدة تصل إلى 20 دقيقة. وسوف ينظر في التركيز الكبيبات على الجزء السفلي من الأنبوب بشكل واضح. إزالة الحل الزائدة، وترك ما يقرب من 2 مل في الأنبوب.
3. على قناة واحدة التصحيح، المشبك شركةectrophysiology
- إعداد 5 × 5 مم رقائق الزجاج غطاء من قبل طلائها مع MW 70،000 - 150،000 بولي ʟ، ليسين، واسمحوا الجافة. استخدام حوالي 30 ميكرولتر من 0.01٪ محلول معقم التي تمت تصفيتها في الماء في غطاء زجاجي.
- الاحماء الحلول التجريبية لRT وملء غرفة التصحيح المشبك وماصة. لقنوات TRPC الرصد واستخدام حل حمام، في ملي: 126 كلوريد الصوديوم، 1 CaCl 2، 10 HEPES، 2 MgCl 2، 10 الجلوكوز، ودرجة الحموضة 7.4؛ ماصة: 126 كلوريد الصوديوم، 1.5 CaCl 2، 10 HEPES، 10 الجلوكوز. 7.4 درجة الحموضة.
- إضافة مثبطات إلى حل ماصة لمنع النشاط من القنوات المحلية، والتي هي ليست ذات صلة للدراسات (الموصى بها: 100 ميكرومتر حمض niflumic أو DIDS (لمنع الكالسيوم 2+ -activated الكلور - قنوات)، 10 ملي TEA (لكبح واسع تصرف الكالسيوم 2 + - K يعتمد + قناة)، 10 نانومتر iberiotoxin (لمنع الكالسيوم 2+ -activated K + قنوات)، 10 ميكرومتر نيكارديبين (لمنع N-نوع كا2+ قنوات)) مباشرة قبل التجربة التصحيح، المشبك.
- المزيج بلطف حل تحتوي على الكبيبات، ومن ثم تطبيق ما يقرب من 50 ميكرولتر من أن الغطاء المطلي رقائق الزجاج بولي ʟ-يسين. السماح للكبيبات نعلق لمدة 5 دقائق تقريبا.
- نقل رقائق الزجاج مع الكبيبات إلى غرفة التصحيح المشبك شغل قبل مع الحل حمام. يروي غرفة بمعدل 3 مل / دقيقة لمدة 1 دقيقة لضمان إزالة الكبيبات غير مرتبط.
- إجراء تجربة التصحيح، المشبك التقليدية في وضع الخلية المرفقة 7. مع ماصة الزجاج (7-10 MΩ المقاومة ماصة) شكل خاتم عالية المقاومة بين ماصة وغشاء خلية رجلاء من خلال تطبيق طيف الامتصاص (ماصة تعلق على خلية رجلاء على سطح الكبيبة معزولة في الشكل 2، على اليسار).
- للقياسات الخلية المرفقة، المنخفضة تمرير التيارات في 300 هرتز على فلتر من ثماني قطب بسل.
- Uحد ذاتها معزولة الكبيبات في تجارب التصحيح، المشبك لمدة تصل إلى 4-6 ساعة. الحفاظ على جزء الأسهم الكبيبات على الجليد.
4. القياسات Ratiometric متحد البؤر مضان من تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في Podocytes
- وضع 500 ميكرولتر من الكسر الكبيبات (وصفها في 2.5) في 0.5 مل أنبوب مخروطي الشكل وإضافة الأصباغ الكالسيوم FURA الأحمر، وAM فلوو-4، AM. استخدام 2 مم و 1 تركيزات الأسهم ملي من FURA الأحمر، وAM فلوو-4، AM، على التوالي (مخزن في -20 ° C، الذائبة في DMSO) واستخدام 2.5 ميكرولتر من كل صبغة ل500 ميكرولتر من الكبيبات الكسر. مباشرة بعد إضافة الأصباغ تغطية الأنبوب بورق الألمنيوم.
- مكان الأنابيب على شاكر الدورية لمدة 20 دقيقة على الأقل ما يصل إلى 1 ساعة على RT.
ملاحظة: وكلاء الدوائية ويمكن أن يضاف خلال هذه الخطوة. - إعداد coverslips الزجاج، غطاء لهم مع بولي ʟ يسين والسماح التجفيف باستخدام ساخنة لوحة مجموعة إلى 70 درجة مئوية.
- بمجرد تحميل الأصباغ الكالسيوم الإنشائيةه، وتطبيق 100 ميكرولتر من الكبيبات التي تحتوي على حل للل coverslips المغلفة بولي ʟ-يسين والسماح لهم التمسك السطح لمدة 5 دقائق. جبل لل coverslips المرفقة الكبيبات إلى غرفة التصوير، ويروي مع الحل حمام (التي تحتوي على (مم): 145 كلوريد الصوديوم، 4.5 بوكل، 2 MgCl 2، 10 HEPES، ودرجة الحموضة 7.35) بمعدل 3 مل / دقيقة لإزالة الكبيبات غير مرتبط والأصباغ المتبقية.
- تعيين متحد البؤر المسح بالليزر المجهر إلى 488 نانومتر الطول الموجي الإثارة والمرشحات الانبعاثات (525/25 650/25 ونانومتر لفلوو-4 و FURA الأحمر، على التوالي). تعيين برامج التصوير على التردد المطلوب والقرار.
- العثور على الكبيبات في brightfield ثم تتحول على الكشف عن إشارة مضان. ضبط كثافة الليزر لكل صبغ لتجنب تشبع الإشارة. اختر المستوى البؤري مع podocytes التي يعلق مباشرة على الزجاج. هذا يقلل من تأثير الناجم عن تقلص من الكبيبة ردا على المخدراتالتطبيق. المزدوج الاختيار التي الكبيبة من اختيار ويرد أيضا على الزجاج.
- بدء تصوير البؤري من خيار (لقطة 512 X 512 صورة مع تردد وضعت في 4 ثانية لتصور كا سريع 2+ تغيرات عابرة. استخدام 60X / NA 1.4 أو عدسة موضوعية مماثلة لصورة عالية الدقة)، وتطبيق المخدرات من الفائدة، وتسجيل استجابة.
- اختر المستوى البؤري المطلوب (أقرب إلى سطح الزجاج ممكن، لضمان تصوير podocytes على سطح الكبيبة). تحقق من شدة مضان على Fluo4 وقنوات FuraRed، وتأكد من أن الكبيبة وينظر بشكل واضح في brightfield.
- بدء التصوير. قبل تطبيق أي أدوية، سجل 1 دقيقة على الأقل من مضان خط الأساس للتأكد من أن إشارة مستقرة (لا توجد طفرات مفاجئة أو يتلاشى من إشارة).
- تطبيق الأدوية المطلوبة مع مساعدة من micropipette. توخي الحذر والتأكد من ان المخدرات قادرة على الانتشار بشكل جيد والوصول إلى glomerأولوس. مزيج الحل حمام بلطف إذا لزم الأمر، ومراقبة البؤري المحدد وتأكد من أنه لم يتحرك من التركيز بسبب تطبيق المخدرات.
- تسجيل التغيرات في كثافة مضان للإشارات Fluo4 وFuraRed. تأكد من تسجيل طويل بما فيه الكفاية، عن طريق الانتظار حتى تصل إشارة مستوى الهضبة أو تصل إلى الذروة ثم يعود الى الاساس. أداء التغيير حل أو إضافة أي أدوية أخرى إذا لزم الأمر.
- إيقاف التسجيل، وحفظ الملف في تنسيق أصلي من البرنامج.
5. تحليل الصور لقياس الكالسيوم
- لتحليل الصورة مع يماغيج البرمجيات مفتوحة مجهزة المساعد المساعدة ND التي تسمح باستيراد الصور في شكل ND2 الأصلي.
- استيراد تسلسل الصور. تأكد لتقسيم القنوات واستخدام وضع hyperstack الرمادي.
- اتبع → أدوات → مسار مدير تحليل العائد على الاستثمار في البرمجيات يماغيج لسالقلم نافذة مدير ROI. اختر العديد من المناطق ذات الاهتمام (podocytes) باستخدام أداة التحديد البيضاوي و "إضافة (ر)" وظيفة في إدارة العائد على الاستثمار. كما ROI الماضي، تحديد منطقة في الخلفية. حفظ رويس المحدد (المزيد → حفظ).
- تسليط الضوء على الإطار الذي يحتوي على القناة المحددة للتحليلات. استخدام المزيد → متعددة الوظائف قياس في إدارة ROI، بمناسبة "صف واحد لكل شريحة" مربع في الحوار أن الملوثات العضوية الثابتة، ومن ثم انقر فوق موافق. وسيتم عرض النتائج في شكل يمكن أن تقام في إطار النتائج: الدخول في نتائج خيار القائمة → مجموعة القياسات، حدد "يعني قيمة الرمادية" وحساب قيم الكثافة بكسل لكل ROI، والتي سوف يتم عرضها في نتائج نافذة في أعمدة منفصلة لكل ROI.
- نسخ قيم الكثافة قياس العائد على الاستثمار لكل قناة (فلوو-4 و FURA الأحمر) في فضل برمجيات تحليل البيانات؛ طرح قيم الكثافة الخلفية من كل داتنقطة.
- لكل نقطة زمنية حساب نسبة كثافة من فلوو-4 إلى قنوات FURA الأحمر. مؤامرة مبعثر / خط التغييرات في الوقت نقطة من الكالسيوم 2+ عابرة لكل ROI. حساب القيم متوسط / SE للكبيبات المحدد.
ملاحظة: يجب تعيين عمود وقت وفقا لتردد التصوير المحدد عند 4.5.
6. داخل الخلوية الحسابات تركيز الكالسيوم عن طريق فلوو-4 الإسفار الإشارة
- أخذ عينة من الكبيبات وتنفيذ بروتوكول تجريبي تصل إلى الخطوة 4.7. بعد تسجيل مضان الخلفية إضافة Ionomycin (تركيز النهائي في غرفة الحمام يجب أن تكون 10 ميكرومتر) إلى حل حمام، وسجل مضان زيادة كثافة. عند بلوغ كثافة الأقصى ويبدأ تسوس، إضافة MnCl 2 (يجب أن يكون التركيز النهائي 5 ملم) لإرواء مضان 8.
- تحليل البيانات التي تم الحصول عليها في 6.1. نسخ القيم كثافة ROI فلوو-4 إشارة التي تم الحصول عليها وفقالبروتوكول صفها في 5،1-5،5 بواسطة برنامج التحليل المفضل.
- حساب تركيز الكالسيوم داخل الخلايا (في نانومتر) في خلية رجلاء المقابلة لROI باستخدام الصيغة:
حيث K د هو التفكك محدد مسبقا المستمر لفلوو-4 (345 نيوتن متر)، F هو كثافة في timepoint التي تقوم بحساب تركيز الكالسيوم ل(خط الأساس)، وF دقيقة وF ماكس هي القيم كثافة في نقطة الحمل الأقصى الكالسيوم (بعد تطبيق ionomycin) وبعد التبريد من مضان (مع MnCl 2)، على التوالي (انظر الشكل 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن هنا تعالج مشكلة قياس التغيرات الحادة في مستويات الكالسيوم في podocytes الشكل 1 يدل على تمثيل تخطيطي للبروتوكول تجريبي تصميمها من أجل أداء عالية الدقة التصوير متحد البؤر مضان الحية وحيدة القناة الايونية التسجيلات النشاط في podocytes من الطازجة الكبيبات القوارض معزولة. لفترة وجيزة، بعد مخدرة الفئران، يجب غسل الكلى مع برنامج تلفزيوني واضحة لهم من الدم. ثم، يتم استئصال الكلى وdecapsulated، ويتم عزل الكبيبات من قشرة الكلى عن طريق النخل التفاضلي. يمكن أن يؤخذ جزء من العينة للتحليل التصحيح، المشبك وبقية يمكن تحميل مع الأصباغ الفلورية الكالسيوم فلوو-4، وAM FURA الأحمر، صباحا من أجل أداء التصوير الكالسيوم ratiometric متحد البؤر.
القياسات الكهربية من النشاط الوحيد القناة الايونية لا يمكن أن يؤديها على الفور بعد عزل الكبيبات. نشاط أيون تشاويمكن قياس nnels سواء في تكوينات الخلية المرفقة وخلية كاملة من طريقة التصحيح، المشبك. لإثبات جدوى النهج المبين هو تسجيل من واحد مثل TRPC التي تضطلع الكالسيوم أيون النشاط قناة (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن لتطبيق خلايا قابلة للاختراق أو المخدرات لاختبار تأثيرها على تدفق الكالسيوم في podocytes على مستوى القنوات الأيونية واحد ملزم المستقبلة.
هذا النهج الذي يسمح تقييم النشاط قناة أيون واحد تنتج مجموعة متنوعة من البيانات التي يمكن أن تميز وظيفة خلية رجلاء. ومع ذلك، فإنه يمكن إضافة كميات كبيرة من قياس التغيرات تركيز الكالسيوم على مستوى الخلايا بأكملها. لإجراء مثل هذه الدراسات، تم تحميلها الكبيبات المعزولة حديثا مع الأصباغ الفلورية للتصوير متحد البؤر إنتاجية عالية. مع دقة بصرية عالية فمن الممكن لرصد مستويات الكالسيوم في العديد من podocytes في وقت واحد. الشكل 3 يدل على قت-بالطبع لتجربة نموذجية تهدف الى تقييم التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل خلية رجلاء. تم تقييم تركيز الكالسيوم القاعدية داخل خلية رجلاء على أساس مضان فلوو-4. بعد أن سجلت كثافة إشارة القاعدية لمدة 1 دقيقة (F)، يتم تطبيق Ionomycin ويسبب ذروة مضان (ماكس F) التي سيتم التوصل إليها، والتي يتم بعد ذلك مروي عن طريق MnCl 2 (ويلاحظ F دقيقة). وفقا للصيغة في 6.3، كثافة فلوو-4 إشارة في كل نقطة زمنية التجربة يمكن ثم تترجم إلى التركيز الفعلي للأيونات الكالسيوم في الخلية. كما يتضح من الرسم البياني، يعني مضان في الخلفية (ما يقرب من 400 وحدات التعسفي) يترجم إلى 140 نانومتر، والتي هي ضمن نطاق التركيز العادي للكالسيوم الخلايا في الخلايا غير أفكارك صحية.
وبرر أهمية وجدوى النهج وصفها من قبل تطبيق آخر، والذي يسمح لقياس transie الكالسيوم الحاداليلة في podocytes استجابة لمختلف انواع المخدرات. ويوضح الشكل 4A صور تمثيلية من الكبيبة الفئران ملطخة فلوو-4 و FURA الأحمر في حل المحتوية على الكالسيوم 2 مم (موضح في 4.5) قبل وبعد إضافة 10 ميكرومتر ATP. نلاحظ زيادة كبيرة في المنطقة الخضراء (فلوو-04:00) مضان من podocytes (ملحوظ مع السهام)، وانخفاض في FURA الأحمر مضان (pseudocolor الأحمر). Fluo4 وFuraRed تعكس زيادة في تركيز الكالسيوم في الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر في الطريق المعاكس أي عندما تركيز الكالسيوم داخل الخلية يزيد فلوو 4 شدة ترتفع، في حين FuraRed تنخفض. كان ذلك ممكنا بسبب طبيعة الإثارة المزدوجة للFuraRed fluorophore. اعتمادا على الطول الموجي الإثارة يمكن أن تتصرف مثل متجهة الكالسيوم (420 نانومتر) أو خالية من الكالسيوم (488 نانومتر) fluorophore مع زيادة مماثلة أو نقصان في مضان. ولذلك، فإن استخدام FuraRed وحدها في وضع التصوير ratiometric ممكن، ومع ذلك اشتراطات وفاق اثنين من موجات الإثارة - 420 نانومتر و 488 نانومتر. هذا سيقلل من وتيرة التصوير مرتين على الأقل (مقارنة مع استخدام واحد الطول الموجي الإثارة)؛ إذا كان الباحث يريد أن الحفاظ على وتيرة سريعة من التصوير، ويجب أن تكون انخفضت دقة وضوح الصورة. ومع ذلك، فلوو 4 و FuraRed يمكن استخدامها جنبا إلى جنب في وضع ratiometric دون فقدان الدقة أو انخفاض في وتيرة التصوير، حيث أن هذه fluorophores يمكن متحمس من قبل نفس 488 نانومتر ليزر، وتوفير التمايز لا بأس به من أطياف الانبعاث. A عابرة نموذجي لخصت من رويس ملحوظ مع السهام ويرد في الشكل 4A في الشكل 4B. يوضح الرسم البياني بوضوح زيادة حادة في Fluo4 / نسبة كثافة FuraRed بعد إضافة 10 ميكرومتر ATP، والذى يضمحل في غضون عدة دقائق. واتخذت صورة كل 4 ثانية، وبالتالي، فإن الأسلوب يسمح يراقب التغيرات السريعة في تركيز الكالسيوم داخل الخلية.
في صفحة = "دائما"> 
الشكل 1. تمثيل تخطيطي للبروتوكول تجريبي. بعد مخدرة الحيوان بشكل صحيح وإعداد لعملية جراحية، يتم مسح الكلى مع PBS لإزالة الدم. ثم، يتم استئصال الكلى وdecapsulated، ويتم عزل الكبيبات من قشرة الكلى عن طريق النخل التفاضلي. هنا، يتم أخذ جزء من العينة للتحليل التصحيح، المشبك، ويتم تحميل باقي مع الأصباغ الكالسيوم الفلورسنت ومتحد البؤر التصوير الكالسيوم ratiometric يتم تنفيذ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تسجيل الممثل تبين النشاط القنوات TRPC الكالسيوم في PODOcytes من الكبيبات الفئران المعزولة حديثا. توضح اللوحة اليسرى ماصة التصحيح، المشبك تعلق على الجسم خلية رجلاء على سطح الكبيبة خلال تسجيل الكهربية في تكوين الخلية المرفقة؛ جزء من الكبيبة كبسولات يمكن أن ينظر إليه في الزاوية السفلية اليمنى من الصورة. ويظهر أثر الحالي التمثيلي للقنوات النشاط مثل TRPC من رقعة الخلية المرفقة المحرز في خلية رجلاء من الكبيبة الفئران في إمكانية عقد -40 بالسيارات على اليمين. ج وس ط دلالة على مستويات القناة المغلقة والمفتوحة، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تجربة تمثيلية تهدف إلى تقييم مستوى الكالسيوم داخل الخلايا في وpodocytes. لقياس تركيز الكالسيوم داخل الخلايا، يتم تحميل الكبيبات مع فلوو-4، AM، يتم تسجيل كثافة مضان في الأساس، وبعد إضافة ionomycin وMnCl 2. الرسم البياني يوضح التغييرات إشارة مضان ردا على ionomycin (إنتاج الحد الأقصى من مضان فلوو-4، F كحد أقصى) وMnCl 2، الذي يروي الصبغة والنتائج في أقل كثافة مضان (F دقيقة). يمكن ترجمتها كثافة مضان (الإحداثي السيني اليسار) لكل نقطة زمنية في تركيز الكالسيوم الفعلي في nanomoles (يمين الإحداثي السيني) وفقا للصيغة في 6.3. لاحظ الأشكال مع الصور التي تبين podocytes في نقطة زمنية عندما حسبت F، F ماكس وF دقيقة. الرسم البياني يظهر هنا يعكس كثافة مضان من خلية رجلاء تميزت الدائرة (ROI)؛ واتخذت صورة كل 4 ثانية.NK "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. قياس العابرين الكالسيوم في podocytes ردا على ATP. (A) صور الممثل توضح البرية الكبيبة نوع الفئران ملطخة فلوو-4 (pseudocolor الأخضر) وFURA الأحمر (pseudocolor الأحمر) في حل المحتوية على الكالسيوم 2 مم قبل وبعد إضافة 10 ميكرومتر ATP. وتجدر الإشارة إلى انخفاض كثافة مضان أخضر اللون قبل تطبيق الدواء. (B) تلخيص مثال عابر الكالسيوم داخل الخلايا أثار في podocytes عن طريق تطبيق 10 ميكرومتر ATP. نلاحظ زيادة كبيرة وسريعة في فلوو-4 / FURA الأحمر نسبة كثافة مضان التالية بالإضافة للدواء، الذي يمثل التحفيز واستنفاد مستودع الكالسيوم وتدفق الكالسيوم من عشرالبريد خارج في الخلية، مما أدى إلى ارتفاع تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري وسائل احتساب مدة 11 podocytes من نفس الكبيبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النهج وصفها هنا يسمح لتحليل التعامل مع الكالسيوم من قبل podocytes من الكبيبات القوارض. هذا الأسلوب يسمح تطبيق التصحيح، المشبك الكهربية واحد قناة ومضان التصوير متحد البؤر ratiometric. ومع ذلك، كلا النهجين يمكن استخدامها بشكل منفصل، من تلقاء نفسها. البروتوكول المقترح عدة خطوات بسيطة نسبيا، بما في ذلك الاحمرار 1) الكلى. 2) عزل الكبيبات التي كتبها النخل التفاضلي. 3) إجراء التصحيح، المشبك التجارب الكهربية، أو حضانة الكبيبات مع الفلورسنت الأصباغ وضع العلامات الكالسيوم للتصوير متحد البؤر ratiometric التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا.
لعزل الكبيبات، وبروتوكول تعديل على أساس Gloy وآخرون. وقد استخدم 5. والميزة الرئيسية لهذه التقنية الحالية من النخل الفرق هو أنه ينتج الكبيبات تجريده من كبسولة بومان، وبالتالي لا تحتاج إلى خطوة متطورة وتستغرق وقتا طويلامن نزع المحفظة اليدوي. وdecapsulated الغالبية العظمى من الكبيبات في جزء منعزل، ولكن يجب أن يكون الباحث على علم بأن هناك الكبيبات كبسولات، أيضا. من المهم للتأكد من أن الكبيبات خلع من كبسولة بومان يتم تصوير، وكبسولة يمنع الأدوية من الوصول إلى podocytes. كما رأينا في الشكل 2، الكبيبات decapsulated لها سطح خشن مع الشعيرات الدموية متميزة والهيئات خلية رجلاء، في حين تظهر الكبيبات كبسولات ناعمة ومستديرة الشكل. وعلاوة على ذلك، مغلفة Fluo4 وFuraRed الكبيبات تحميل تنبعث منها أقل كثافة إشارة مضان مقارنة مع تلك decapsulated.
جزء من الكبيبات الفئران عليها 95٪ نقية (مع آثار الأنابيب القريبة)، ويمكن استخدامها بسهولة لالنشاف الغربية أو غيرها من تطبيقات البيولوجيا الجزيئية إذا لزم الأمر. من المهم للغاية أن في هذا الإعداد المرفقة podocytes إلى الشعيرات الدموية، والاحتفاظ العمليات القدم سليمة وظيفة كجزءمن الأم الترشيح الكبيبة الآلات الجهاز. آليات التعامل مع الكالسيوم من قبل podocytes تؤدي دورا تنظيميا أساسيا في التنمية والوقاية من المضاعفات الكلوية في أمراض مثل السكري أو ارتفاع ضغط الدم 12/09. Podocytes تساهم إلى حد كبير في الحواجز النفاذية، كما يتضح من حقيقة أن الإصابة الحادة يغير مورفولوجيا خلية رجلاء وهيكل ويمكن أن يتسبب بروتينية 2،3،13-15. وبالتالي، فإنه من الأهمية بمكان أن نلاحظ استجابة تدفق الكالسيوم في هذه الخلايا على الأدوية، والتي يمكن فرزها بسهولة في هذا الإعداد. ينبغي أن يكون مفهوما أنه إذا كان الباحث ويحقق podocytes في حالة المرضية، على سبيل المثال، ارتفاع ضغط الدم أو مرض السكري، مما يؤدي عادة في بروتينية والضرر الكبيبات، العائد من الكبيبات قد تكون أقل النقي من ذلك من الحيوانات السليمة. فمن المستحسن دائما الى رصد كسور الكبيبات في كل مرحلة من مراحل عملية عزل لتجنب فقدانالأنسجة. في بعض الحالات، الكبيبات المريضة بشكل كبير أو الكبيبات من الحيوانات تتراوح أعمارهم أو أصغر من قد تتطلب التكيف الفردي للعملية العزل، بما في ذلك اختيار أكبر / المناخل شبكة أصغر.
ولقد طبق هذا النهج في البداية لتحديد مدى فعالية العقاقير المضادة للالتهاب غير الستيرويدية في تثبيط القنوات TRPC الكالسيوم في podocytes 16. وبعد هذه الدراسات 7،16-22 قمنا بتوظيف التقنيات الموضحة لإنشاء العديد من الآليات الهامة السيطرة على وظيفة podocytes. على سبيل المثال التي وصفناها لمحة عن P2 (purinergic) المستقبلات في podocytes من الفئران ومحددة تنظيم تدفق الكالسيوم أنجيوتنسين II في الكبيبات الماوس. كما هو موضح في مخطوطة في وقت لاحق 20، البروتوكول يمكن تكييفها لإجراء دراسات مماثلة ليس فقط في الفئران، ولكن أيضا في الأنواع الأخرى، مثل الفئران. التصوير مضان الكالسيوم Ratiometric (مع استخدام اثنين من الفلورسنتالأصباغ - فلوو-4 و FURA الأحمر) تضمن موثوقية إضافية من البيانات، وإذا التصوير الكالسيوم المطلوبة يمكن دمجها مع الأصباغ الفلورية الأخرى لرصد التغيرات في المواد الأخرى ضمن podocytes. على سبيل المثال، وقد استخدمنا هذا النهج لقياس أكسيد النيتريك بمساعدة الصبغة DAF-FM. التصحيح، المشبك الكهربية يمكن استخدامها وحدها أو (الإعداد سمحت) بالاشتراك مع التصوير الكالسيوم. وبصرف النظر عن قنوات الكالسيوم، والأسلوب يسمح تسجيل نشاط القنوات الأيونية الأخرى. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام ترنسفكأيشن وسيرنا قد توسيع مجال تطبيق أكثر من ذلك، كما تم مؤخرا أبدته مجموعة الدكتور مجفف البالغ عددهم 23.
التقليدية المجهري epifluorescence يمكن استخدامها هنا بدلا من التصوير متحد البؤر أقل بأسعار معقولة. ومع ذلك، يجب أن يكون الباحث على علم بأن حساسية فعالة لواسعة المجهري مضان المجال يقتصر عموما خارج نطاق التركيز الضوء. هذا (بالمقارنة مع IMAGIN متحد البؤرز) يسبب مثل هذه القيود عدم القدرة على إنتاج صورة عالية الدقة من ROI واحد (خلية رجلاء) أو العمليات قدمه. وعلاوة على ذلك، المجهر واسعة المجال تعقيد تحديد podocytes كما أنه من الصعب التفريق بين سطح الكبيبة والأنسجة العميقة. اعتبارا من الآن التوافر التجاري لfluorophores المختلفة للتصوير متحد البؤر هو أفضل بكثير وتوسعا سريعا. بدلا من ذلك، دراسات epifluorescence يمكن الجمع بسهولة مع الإعداد الكهربية التي يمكن أن توفر الكالسيوم داخل الخلايا في وقت واحد 2+ واحد تسجيل النشاط القناة. ويستخدم على نطاق واسع Fura2-AM تحميل podocytes الكبيبات مع مستوحد اللون فلتر عجلة والكثافة المحايدة مرشحات الإعداد، ولكن ليست دائما مناسبة لجودة التصوير عالية الدقة.
كما تجدر الإشارة إلى أن معزولة، الكبيبة وظيفية قادرة على تغيير حجمه استجابة للمؤثرات الفسيولوجية. يجب أن يكون الباحث على علم بذلك أثناء تنفيذالتجارب، وتختار بعناية البؤري خلال الدراسات مبائر لتجنب فقدان التركيز، وأداء تجارب السيطرة على مجموعة من أدوية جديدة من أجل اختبار انكماش غير مقصود أو الاسترخاء.
تقدم هذه التقنية فرصة فريدة لرصد التغيرات في تدفق الكالسيوم في القناة الايونية واحدة ومستويات الخلايا الفردية بعد العلاجات الدوائية أو معالجات أخرى، في مجموعة متنوعة من الخلفيات القوارض. هذه التقنية يمكن استخدامها أيضا في دراسات أمراض الكلى الإنسان على أنه بروتوكول تعديل يمكن تطبيقها على الأنسجة التي تم الحصول عليها من الخزعات الكلى، والذي سيوفر مما لا شك فيه معلومات قيمة للغاية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يقترن قياسات تركيز الكالسيوم مع الكهربية تجارب التصحيح، المشبك في الوقت الحقيقي، والتي قد توفر أكثر تعمقا والبصيرة الآلية في تنظيم الكالسيوم المناولة في غضون podocytes في الظروف العادية والمرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر غلين سلوكم (كلية الطب في ويسكونسن) وكولين A. لافين (نيكون الآلات، وشركة) للحصول على المساعدة الفنية ممتازة مع التجارب المجهري. ومن المسلم به غريغوري بلاس لتصحيح التجارب المطبعية نقدية للمخطوطة. وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للHL108880 منحة الصحة وجمعية السكري الأميركية منح 1-15-BS-172 (إلى AS)، وJ. زمالة بن Lipps البحوث من الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى (لDVI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| Poly-ʟ-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| Tube rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Germany |
| Nikon confocal microscope (inverted) | Nikon | Nikon A1R | Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm |
| Objective | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | Silicone Compound | |
| Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low pass filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
| Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| TEA chloride | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | without antibiotics |
| BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% albumin solution |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Steel sieves: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
| mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | screen for CD-1 |
| Binocular microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Binocular microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| Polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia |  VetEquip, Inc. |
911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
- Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
- Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
- Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
- Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
- Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
- Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
- Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
- Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771 (2009).
- Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
- Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
- Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
- Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
- Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
- Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
- Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
- Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
- Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
- Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).
