Introduction
Nieren handhaven homeostatische balans voor diverse stoffen en reguleren bloedvolume op een manier die totaal bloeddruk bepaald. Verstoringen in de renale filtratie, reabsorptie of secretie leiden of begeleiden pathologische toestanden, gaande van hyper- of hypotensie tot eind nierziekte die uiteindelijk nodig niertransplantatie. De renale filtereenheid (glomerulus) bestaat uit drie lagen - de capillaire endotheel, basaalmembraan en een eencellige laag van epitheelcellen - podocytes, die een belangrijke rol in de handhaving van het spleetvormige diafragma integriteit en functie 1 zijn. Disfunctie in de permselectief glomerulaire filter veroorzaakt urine verlies van macromoleculen, zoals proteïnurie. Verschillende middelen kunnen de structuur van de podocytes en hun voeten processen die de integriteit van de glomeruli filtratie barrière bepalen beïnvloeden.
De podocytes zijn betrokken bij het onderhoud van de Glomeruli filtratie functie. Vastgesteld is dat incorrect calciumhuishouding van de podocyte leidt tot celbeschadiging en speelt een belangrijke rol bij de progressie van verschillende vormen van nefropathie 2,3. Daarom is ontwikkeling van een model waarmee directe meting van intracellulaire calciumconcentratie veranderingen instrumentele voor onderzoek podocyte functie zijn. Geïsoleerde glomeruli werden eerder gebruikt in een groot aantal studies, waaronder het meten van albumine reflectiecoëfficiënt verandert 4 en evaluatie van de integrale cellulaire stromingen in de whole-cell elektrofysiologische patch-clamp metingen 5,6. In dit artikel beschrijven we het protocol dat de onderzoeker mogelijk maakt om intracellulaire calciumconcentratie verandert in reactie op verzoeken van farmacologische middelen te meten, schatten basale niveaus van calcium in de cellen, en beoordeelt afzonderlijke calciumkanalen activiteit. Ratometric calciumconcentratie metingen en patch-clamp electrophysiology werden gebruikt om veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie in het podocyte en kanaalactiviteit respectievelijk bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal gebruik en welzijn moeten zich houden aan de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren volgende protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) beoordeeld en goedgekeurd.
1. Nier Flush
- Gebruik 8-12 weken oude mannelijke ratten (beoogd is een stam Sprague Dawley, maar andere stammen van verschillende leeftijd en geslacht kunnen worden gebruikt met geschikte wijzigingen).
- Verdoven het dier volgens de procedure toegestane IACUC protocol; monitoren diepte van de anesthesie en inspecteer het dier. De gedetailleerde beschrijving van de ingreep wordt uitgevoerd in 1,3-1,8 ligt in Ilatovskaya et al 7.
- Na een goede verdoving, plaats het dier op een temperatuur-gecontroleerde chirurgische tafel, maak een middellijn incisie van de buik (tot 3 centimeter in lengte), en ontdek de vena cava en de aorta.
- Plaats ligatuur rond de coeliakie en superieure mesenteriale slagaders en de buikaorta boven die; niet ligeren.
- Blunt ontleden de abdominale aorta onder de nierslagaders en plaats twee ligaturen rond het, maar niet ligeren, vervolgens klem de aorta boven de ligaturen en bind de onderste draad.
- Katheteriseren de aorta met een polyethyleen PE50 buis (bevestigd aan een injectiespuit pomp gevuld met PBS) onder de klem en bevestig de katheter met de tweede ligatuur; Verwijder de klem, zet de pomp, en ligeren van de aorta en mesenterische met coeliakie slagaders. Maak snel incisie in nierader om de druk te verlichten.
- Giet de aorta met de vooraf gekoelde PBS gedurende 2 of 3 minuten bij een snelheid van 6 ml / min.
- Stop perfusie, accijnzen en decapsulate 7 de nieren, en leg ze op ijs in de PBS-oplossing. Euthanaseren van de dieren volgens het protocol door IACUC goedgekeurd.
2. Isolatie van de Rat glomeruli
- Bereid 30 ml verse oplossing van 5% BSA in RPMI 1640.
- Met behulp van een scheermesje en schaar,isoleren van de cortex van beide nieren, en vervolgens gehakt tot een homogene massa. Deze procedure is eerder 7 beschreven.
- Duw het weefsel fijngehakt in de vorige stap door een 100 mesh roestvrijstalen zeef (vooraf geweekt in 5% BSA / RPMI-oplossing) met een spatel. Verzamel de doorstroom en door zwaartekracht kan de doorstroom door een 140 mesh zeef.
- Filtreer de doorstroom vanuit het 140 mesh zeef met een geweekte 200 mesh zeef, het filtraat weg en spoel de bovenkant van de zeef met 10-15 ml van de geprepareerde BSA / RPMI oplossing voor de glomeruli die sediment te verzamelen de zeef.
- Zet de BSA / RPMI bevattende glomeruli op ijs in een 15 ml buisje en laat de glomeruli sediment op de bodem van de buis gedurende maximaal 20 minuten. De glomeruli concentreren op de bodem van de buis duidelijk zichtbaar. Verwijder de overtollige oplossing, laat ongeveer 2 ml in de buis.
3. Single-channel Patch-clamp Elelektrofysiologie
- Bereid 5 x 5 mm dekglas chips door het bekleden ze met MW 70.000 - 150.000 poly-ʟ-lysine, en laten drogen. Gebruik ongeveer 30 ul van 0,01% steriel gefiltreerd oplossing in water per couvert glas.
- Warmen de experimentele oplossingen voor RT en vul de patch-clamp kamer en pipet. Voor de bewaking TRPC kanalen, gebruik dan een bad oplossing, in mm: 126 NaCl, 1 CaCl2, 10 HEPES, 2 MgCl2, 10 glucose, pH 7,4; pipet: 126 NaCl, 1,5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glucose; pH 7,4.
- Remmers Naar de pipet oplossing om de activiteit van endogene kanalen, die niet relevant voor de studie (aanbevolen zijn blok zijn: 100 uM nifluminezuur of DIDS (Ca 2 + -geactiveerde Cl blok - kanalen), 10 mM TEA (het inhiberen grote-conductance Ca 2 + - afhankelijke K + kanaal), 10 nM iberiotoxin (de Ca 2+ -geactiveerde K + kanalen te blokkeren), 10 uM nicardipine (voor N-type Ca blokkeren2+ kanalen)) direct voor de patch-clamp experiment.
- Meng de glomeruli bevattende oplossing en vervolgens ongeveer 50 ui te passen op de poly-ʟ-lysine beklede dekglaasjes chips. Laat de glomeruli worden toegevoegd van ongeveer 5 min.
- Beweeg de glazen chips met glomeruli om de patch-clamp kamer pre-gevuld met het bad oplossing; perfuseren de kamer met een snelheid van 3 ml / min gedurende 1 minuut om het verwijderen van de losse glomeruli waarborgen.
- Voer een conventionele patch-clamp experiment in een cel-bevestigd-modus 7. Met een glazen pipet (7-10 MQ pipette resistentie) een hoge weerstand afdichting tussen een pipet en een podocyte membraan door toepassing van zachte zuigkracht (een pipet bevestigd aan een podocyte op het oppervlak van de geïsoleerde glomerulus wordt getoond in figuur 2, op links).
- Voor de cel bevestigd metingen, low-pass de stroming bij 300 Hz met een acht-polige Bessel-filter.
- Use geïsoleerd glomeruli in patch-clamp experimenten voor maximaal 4 - 6 uur. Houd de voorraad glomeruli fractie op ijs.
4. Ratiometrische confocale Fluorescentie metingen van de intracellulaire calciumconcentratie in de podocytes
- Plaats 500 pi van de glomeruli fractie (beschreven in 2.5) in 0,5 ml conische buis en voeg calcium kleurstoffen Fura Rood, AM en Fluo-4, AM. Gebruik 2 mM en 1 mM voorraad concentratie van Fura rood, AM en Fluo-4, AM, respectievelijk (opslag bij -20 ° C, opgelost in DMSO) en gebruik 2,5 pi van elke kleurstof een 500 pl glomeruli fractie. Onmiddellijk na toevoeging van de kleurstoffen omvatten de buis met aluminiumfolie.
- Plaats de buisjes op een roterende schudder gedurende ten minste 20 min tot 1 uur bij KT.
Opmerking: Farmacologische middelen kunnen in deze stap worden toegevoegd. - Bereid dekglaasjes, bedek ze met poly-ʟ-lysine en laat het drogen met behulp van verhitte plaat set tot 70 ° C.
- Zodra het laden van calcium kleurstoffen complete Breng 100 pi van de glomeruli bevattende oplossing van het poly-ʟ-lysine beklede dekglaasjes en laat ze zich aan de oppervlakte gedurende 5 min. Monteer de glomeruli bevestigd dekglaasjes in een imaging kamer en perfuseren met het bad-oplossing (bevattende (in mM): 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, pH 7,35) met een snelheid van 3 ml / min te verwijderen de losse glomeruli en de resterende kleurstoffen.
- Stel de confocale laserscanning microscoop een 488 nm excitatie golflengte en emissiefilters (525/25 en 650/25 nm voor Fluo-4 en Fura rood, respectievelijk). Stel de imaging software op een gewenste frequentie en resolutie.
- Vind de glomeruli in helderveld en zet vervolgens de detectie van de fluorescentie-signaal. De intensiteit van de laser voor elke kleurstof verzadiging van het signaal te voorkomen. Kies het brandvlak met podocytes die direct op de ruit bevestigd. Dit minimaliseert het effect wordt veroorzaakt door samentrekking van een glomerulus in reactie op geneesmiddelentoepassing. Double-check dat de glomerulus van keuze goed is bevestigd aan het glas;
- Start beeldvorming van de focal plane keuze (neem 512 x 512 beelden met de op 4 sec frequentie snel Ca 2+ voorbijgaande veranderingen te visualiseren. Gebruik een 60X / NA 1.4 of soortgelijke objectief hoge resolutie afbeelding voor), drugs van belang toe te passen, en noteer de respons.
- Selecteer de gewenste focal plane (zo dicht mogelijk bij het oppervlak van het glas mogelijk te beeldvorming van podocytes garanderen op het oppervlak van de glomerulus). Controleer de intensiteit van de fluorescentie van de Fluo4 en FuraRed kanalen, en zorg ervoor dat de glomerulus duidelijk is te zien in helderveld.
- Start imaging. Voor het aanbrengen van enige drugs, opnemen ten minste 1 min van de baseline fluorescentie om ervoor te zorgen dat het signaal stabiel is (er zijn geen plotselinge pieken of vervagen van het signaal).
- Breng de gewenste geneesmiddelen met behulp van een micropipet; wees voorzichtig en zorgen voor de drug was in staat om goed te verspreiden en bereiken de glomerUlus. Meng het bad oplossing voorzichtig indien nodig, het toezicht op de geselecteerde focal plane en controleren dat het niet uit te gaan van de focus als gevolg van de drug toepassing.
- Noteer de veranderingen in fluorescentie-intensiteit voor Fluo4 en FuraRed signalen. Zorg ervoor dat de opname is lang genoeg, door te wachten tot het signaal het plateau niveau bereikt of een piek bereikt en keert vervolgens terug naar de uitgangswaarde. Voer oplossing wijziging of aanvulling van enige andere medicijnen als dat nodig is.
- Stop de opname en sla het bestand in het eigen formaat van de software.
5. Image Analysis voor het Calcium Metingen
- Voer beeldanalyse met de ImageJ geopende software uitgerust met de ND Utility plugin die het mogelijk maakt het importeren van afbeeldingen in de moedertaal ND2 formaat.
- Importeer de beeldsequentie; Zorg ervoor om de kanalen te splitsen en gebruik een HyperStack grijstinten-modus.
- Volg de Analyze → Extra → ROI manager pad in de ImageJ software om open een ROI manager venster. Selecteer verschillende regio's van belang (podocytes) met behulp van een ovale selectie-instrument en de "toevoegen (t)" functie in de ROI Manager. Zoals de laatste ROI, selecteer het gebied op de achtergrond; sla de geselecteerde ROI (Meer → Opslaan).
- Markeer het venster met de gekozen voor analyses kanaal. Gebruik de Meer → Multi Measure functie in de ROI Manager, markeer de "één rij per slice" box aan de dialoog die naar buiten komt, en klik op OK. De resultaten zullen in het formaat dat kan worden ingesteld in het venster Resultaten worden getoond: het aangaan van de menuoptie Resultaten → Set Metingen, selecteer "Mean grijswaarde" en bereken de pixel intensiteit waarden voor elk ROI, die zal worden weergegeven in de Resultaten venster in aparte kolommen voor elke ROI.
- Kopieer het ROI gemeten intensiteitswaarden voor elk kanaal (Fluo-4 en Fura rood) in voorkeur software voor gegevensanalyse; subtract achtergrond intensiteitswaarden van elk DATeen punt.
- Voor elk tijdstip berekent de verhouding van intensiteiten van de Fluo-4 tot Fura Red kanalen. Plot scatter / line point-time wijzigingen van Ca 2+ transient voor elke ROI. Bereken Mean / SE waarden voor geselecteerde glomeruli.
Opmerking: Time kolom moet worden ingesteld op basis van imaging frequentie geselecteerd op 4,5.
6. Intracellulaire calciumconcentratie Berekeningen met Fluo-4 fluorescentiesignaal
- Neem een monster van de glomeruli en het uitvoeren van de experimentele protocol tot stap 4.7. Na registratie van de achtergrondfluorescentie voeg Ionomycin (eindconcentratie in het bad kamer moet 10 urn) aan de badoplossing en opnemen fluorescentie-intensiteit verhogen. Zodra de intensiteit bereikt zijn maximum en het verval begint, voeg MnCl 2 (eindconcentratie moet 5 mM) aan de fluorescentie 8 doven.
- Analyseer de verkregen data 6.1. Kopieer de Fluo-4 signaal ROI intensiteit waarden verkregen volgenshet op 5.1 beschreven protocol - 5.5 door voorkeursuitvoeringsvorm analysesoftware.
- Bereken intracellulaire calciumconcentratie (in nM) in podocyte overeenkomt met het ROI met een formule:
waarin Kd een vooraf bepaalde dissociatieconstante voor Fluo-4 (345 nM), F is de intensiteit van het tijdstip dat u berekent de calcium concentratie (baseline) en F min en Fmax de intensiteitswaarden van het punt van de maximale belasting calcium (na ionomycine toepassing) en na doven van de fluorescentie (met MnCl 2) respectievelijk (zie figuur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier geadresseerd we het probleem van het meten van acute veranderingen in het calciumgehalte in het podocytes. Figuur 1 toont een schematische weergave van de experimentele protocol ontworpen om hoge resolutie levende fluorescentie confocale beeldvorming en één ionkanaalactiviteit opnamen verrichten de podocytes van de vers geïsoleerde knaagdieren glomeruli. Kort nadat de rat verdoofd, de nieren moet worden gespoeld met PBS om ze te verwijderen van bloed. Vervolgens worden de nieren uitgesneden en ontkapseld en glomeruli worden geïsoleerd uit de niercortex door differentiële zeven. Een deel van het monster kan worden genomen voor de patch-clamp-analyse en de rest kan worden geladen met fluorescerende calcium kleurstoffen Fluo-4, AM en Fura Rood, AM om confocale ratiometrische calcium imaging voeren.
Elektrofysiologische metingen van de interne ionkanaal activiteit kan direct worden uitgevoerd na de isolatie van de glomeruli. Activiteit van ion channels kan worden gemeten zowel in cel verbonden en hele-cel configuratie van de patch-clamp-methode. Om de uitvoerbaarheid van de getoonde benadering tonen de opname van de enkelvoudige TRPC-achtige calcium geleidend ionkanaal activiteit (figuur 2). Daarnaast is het mogelijk om cellen permeabel of receptor binding drugs hun effecten op de calcium influx in de podocytes op het niveau van afzonderlijke ionkanalen te testen toegepast.
Een aanpak die enkel ionkanaal activiteit assessment maakt produceert een verscheidenheid van de gegevens die podocyte functie kan karakteriseren. Het kan echter sterk worden aangevuld door meting van de calciumconcentratie veranderingen op het niveau van de gehele cellen. Om dergelijke studies uitvoeren, werden vers geïsoleerde glomeruli beladen met fluorescente kleurstoffen voor de high throughput confocale beeldvorming. Met een hoge optische resolutie kan men calciumspiegels in verschillende podocytes tegelijk bewaken. Figuur 3 toont het tijd-koers voor de typisch experiment ontworpen om de veranderingen van calciumconcentratie in de podocyte evalueren. De basale calciumconcentratie in het podocyte werd geëvalueerd op basis van de Fluo-4 fluorescentie. Na registratie van de basale signaalintensiteit gedurende 1 min (F) wordt toegepast lonomycine en veroorzaakt piek fluorescentie (F max) te bereiken, die vervolgens wordt afgeschrikt door MnCl2 (F min wordt aangegeven). Volgens de formule van 6,3, kan de intensiteit van Fluo-4 signaal op elk tijdstip van het experiment vervolgens worden omgezet in de feitelijke concentratie van de calciumionen in de cel. Zoals uit de grafiek blijkt, gemiddelde fluorescentie op de achtergrond (ongeveer 400 arbitraire eenheden) vertaalt in 140 nM, wat binnen een normaal concentratietraject van intracellulair calcium in gezonde niet-apoptotische cellen.
Het belang en het nut van de beschreven aanpak wordt gerechtvaardigd door een andere toepassing, die het mogelijk maakt voor het meten van acute calcium Transients podocytes in reactie op verschillende drugs. Figuur 4A illustreert representatieve beelden van de rat glomerulus gekleurd met Fluo-4 en Fura rood in de 2 mM calcium bevattende oplossing (beschreven in 4.5) voor en na toevoeging van 10 urn ATP. Opmerking een dramatische toename van de groene (Fluo-4 AM) fluorescentie van de podocytes (aangegeven met pijlen), en een daling van Fura rood fluorescentie (rood pseudocolor). Fluo4 en FuraRed weerspiegelt een hoger calciumconcentratie bij een excitatiegolflengte van 488 nm in tegengestelde richting dat wil zeggen, wanneer de calciumconcentratie in de cel verhoogt Fluo 4 intensiteit stijgt, terwijl FuraRed daalt. Dat is mogelijk te wijten aan de dubbele excitatie karakter van FuraRed fluorofoor. Afhankelijk excitatiegolflengte kan gedragen als calcium-gebonden (420 nm) of calciumvrije (488 nm) fluorofoor met overeenkomstige toename of afname in fluorescentie. Daarom is het gebruik van FuraRed alleen in een ratiometrische imaging mode mogelijk, maar het requires twee excitatie golflengten - 420 nm en 488 nm. Hierdoor wordt de frequentie van de beeldvormende ten minste tweemaal (vergeleken met de toepassing van een excitatiegolflengte) verminderd; als de onderzoeker zou willen het snelle tempo van de beeldvorming te houden, moet de beeldresolutie worden verlaagd. Echter, Fluo 4 en FuraRed samen worden gebruikt in een ratiometrische wijze zonder verlies van resolutie of afname imaging frequentie, omdat deze fluoroforen kunnen worden geëxciteerd door dezelfde 488 nm laser en een goede differentiatie van de emissiespectra. Een typische voorbijgaande samengevat van de ROI aangegeven met pijlen in figuur 4A is getoond in figuur 4B; de grafiek toont duidelijk een acute toename van Fluo4 / FuraRed intensiteitsverhouding na toevoeging van 10 uM ATP, die vervalt binnen enkele minuten. Beelden werden genomen elke 4 sec, en daarmee de techniek kunnen waarnemen snelle veranderingen in de calciumconcentratie in de cel.
Figuur 1. Schematische weergave van het experimentele protocol. Nadat het dier goed is verdoofd en voorbereid op de operatie worden de nieren gespoeld met PBS om bloed te verwijderen. Vervolgens worden de nieren uitgesneden en ontkapseld en glomeruli worden geïsoleerd uit de niercortex door differentiële zeven. Hier wordt een deel van het monster genomen voor patch-clamp-analyse, en de rest is geladen met fluorescerende calcium kleurstoffen en confocale ratiometrisch calcium beeldvorming wordt uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Representatieve opname waaruit de activiteit van de TRPC calciumkanalen in de podocyten van de vers geïsoleerde glomeruli rat. Linker paneel toont de patch-clamp pipet tijdens een elektrofysiologische opname in een cel verbonden met de configuratie podocyte lichaam op het oppervlak van de glomerulus gevoegd Een deel van een ingekapselde glomerulus is te zien in de rechter benedenhoek van het beeld. Vertegenwoordiger huidige trace van de TRPC-achtige kanalen activiteit van een cel bevestigd patch gemaakt op podocyte van de glomerulus rat in een -40 mV met potentieel wordt getoond aan de rechterkant. De c en o i duiden gesloten en open kanaal niveau, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Representatieve experiment ontworpen om het intracellulaire calciumgehalte in beoordelen de podocytes. intracellulaire calciumconcentratie meten glomeruli worden geladen met Fluo-4, AM, fluorescentie-intensiteit wordt in de basislijn en na toevoeging van ionomycine en MnCl2. De grafiek toont het fluorescentiesignaal verandert als gevolg van ionomycine (waarbij het hoogste van de Fluo-4 fluorescentie, F max) en MnCl2, waarbij de kleurstof en resulteert in de laagste fluorescentie-intensiteit (F min) dooft. Intensiteit van fluorescentie (linker abscis) voor elk tijdstip kan worden omgezet in de werkelijke calciumconcentratie in nanomoles (rechter abscis) volgens de formule in 6.3. Let op de inzetstukken met de beelden die podocytes op het moment punten bij F, F max en F min werden berekend. De hier getoonde grafiek geeft fluorescentie-intensiteit van de podocyte gekenmerkt door een cirkel (ROI); beelden werden genomen elke 4 sec.nk "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Meting van de calcium transiënten in de podocytes als reactie op ATP. (A) Vertegenwoordiger beelden illustreren het wild type rat glomerulus gekleurd met Fluo-4 (groen pseudocolor) en Fura Red (rood pseudocolor) in de 2 mM calcium-bevattende oplossing voor en na toevoeging van 10 uM ATP. Lagere intensiteit groengekleurde fluorescentie Voordat het geneesmiddel moet worden vermeld. (B) Samengevat voorbeeld van de intracellulaire calcium voorbijgaande opgeroepen in podocytes door toepassing van 10 um ATP. Opmerking een sterke en snelle toename van Fluo-4 / Fura rood fluorescentie-intensiteitsverhouding na toevoeging van het geneesmiddel, die goed is voor het stimuleren en uitputting van de calcium depot en calcium influx van he buiten in de cel, wat resulteert in de verhoging van de intracellulaire calciumconcentratie. Fout balken geven de standaard fout van de middelen berekend voor 11 podocytes van dezelfde glomerulus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven benadering maakt voor de analyse van calciumhuishouding door podocytes van het knaagdier glomeruli. Deze techniek maakt het mogelijk de toepassing van de patch-clamp single channel elektrofysiologie en fluorescentie ratiometrische confocale beeldvorming. Echter, beide werkwijzen afzonderlijk worden gebruikt, als zodanig. De voorgestelde protocol heeft een aantal relatief eenvoudige stappen, waaronder 1) de nieren spoelen; 2) het isoleren van de glomeruli door differentiële zeven; 3) het uitvoeren van patch-clamp elektrofysiologische experimenten of incubatie van de glomeruli met fluorescerende calcium labeling kleurstoffen voor ratiometrische confocale beeldvorming van veranderingen in intracellulair calcium.
Om de glomeruli, een gemodificeerd protocol gebaseerd op Gloy isoleren et al. 5 gebruikt. Het belangrijkste voordeel van de huidige techniek van differentiële zeven is dat het produceert glomeruli ontdaan van het kapsel van Bowman en dus eigenlijk de verfijnde en tijdrovende stap vereisenhandmatige decapsulation. De meerderheid van de glomeruli in de geïsoleerde fractie zijn ontkapseld, maar de onderzoeker moet zich ervan bewust dat er ingekapselde glomeruli, ook. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de glomeruli ontdaan van Bowman's capsule worden afgebeeld, als capsule voorkomt dat de drugs van het bereiken van de podocytes. Zoals blijkt uit figuur 2, decapsulated glomeruli te gestructureerd met verschillende capillairen en podocyte organen, terwijl ingekapselde glomeruli vloeiend en ronde vorm. Bovendien, ingekapseld Fluo4 en FuraRed geladen glomeruli stoten minder intense fluorescentiesignaal vergeleken met ontkapseld degenen.
De fractie glomeruli rat verkregen 95% zuiver (met sporen van proximale tubuli) en kunnen eenvoudig worden gebruikt voor western blotting of andere moleculair biologische toepassingen, indien nodig. Het is buitengewoon belangrijk in dit preparaat podocytes zijn aan de capillairen behouden intact voet processen en functioneren als onderdeelvan de inheemse glomerulus filtratieinrichting machines. De mechanismen van de calciumhuishouding van de podocytes dienen een essentiële regulerende rol in de ontwikkeling en preventie van renale complicaties bij dergelijke ziekten als diabetes of hypertensie 9-12. Podocytes significant bijdragen aan de permeabiliteit barrières, zoals blijkt uit het feit dat acuut letsel verandert podocyte morfologie en structuur en kan proteïnurie 2,3,13-15 veroorzaken. Het is daarom van groot belang voor de reactie van calcium influx acht in deze cellen geneesmiddelen, die gemakkelijk kan worden gescreend in dit preparaat. Men moet begrijpen dat indien de onderzoeker probing podocytes in een pathologische toestand, bijvoorbeeld, hypertensie of diabetes, die meestal leiden tot proteïnurie en glomeruli schade, de opbrengst aan glomeruli misschien minder zuiver is dan die van de gezonde dieren. Het wordt aanbevolen de glomeruli fracties controleren altijd in elke fase van de isolatiewerkwijze om verlies te voorkomen vanhet weefsel. In sommige gevallen kan zwaar zieke glomeruli of glomeruli van dieren ouder of te jong individuele instelling van isolèringsproces, inclusief de selectie van grote / kleine maaszeven vereisen.
We hebben deze benadering aanvankelijk toegepast om de werkzaamheid van niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen te bepalen bij het remmen van de calcium TRPC kanalen podocytes 16. Na deze studies 7,16-22 we in dienst van de beschreven technieken om een aantal cruciale mechanismen die podocytes functie vast te stellen. Zo hebben we het profiel van de P2 (purinerge) receptoren beschreven in de podocytes van de ratten en de regulatie van calcium influx van angiotensine II in de muis glomeruli gedefinieerd. Zoals beschreven in een later manuscript 20, kan het protocol worden aangepast met gelijkwaardige studies niet alleen bij ratten, maar ook bij andere soorten, zoals muizen voeren. Radiometrische calcium fluorescentie beeldvorming (met gebruik van twee fluorescerendekleurstoffen - Fluo-4 en Fura rood) zorgt voor extra betrouwbaarheid van de gegevens en eventueel calcium beeldvorming te combineren met andere fluorescente kleurstoffen voor veranderingen in andere stoffen in de podocytes bewaken. Zo hebben wij deze benadering gebruikt om stikstofoxide met behulp van de DAF-FM kleurstof te meten. Patch-clamp elektrofysiologie kan alleen worden gebruikt of (setup toelaat) in combinatie met calcium imaging. Afgezien van calciumkanalen, de techniek laat registreren van de activiteit van andere ionkanalen. Bovendien kan het gebruik van siRNA transfectie en het toepassingsgebied nog breiden, zoals onlangs is aangetoond door Dr. droger group 23.
Conventionele epifluorescentiemicroscopie kan hier worden gebruikt in plaats van de minder betaalbare confocale beeldvorming. Wel dient de onderzoeker weet dat de effectieve gevoeligheid van groot gezichtsveld fluorescentiemicroscopie algemeen beperkt door out-of-focus licht. Deze (in vergelijking met confocale Imaging) zorgt ervoor dat dergelijke beperkingen als het onvermogen om een hoge beeldresolutie van enkele ROI (podocyte) of zijn voet processen te produceren. Verder wide-field microscopie bemoeilijkt identificeren podocytes omdat het moeilijk onderscheid te maken tussen het oppervlak van de glomerulus en deep tissue. Vanaf nu de commerciële beschikbaarheid van verschillende fluoroforen voor confocale beeldvorming is veel beter en snel groeiende. Alternatief zou epifluorescentie studies goed te combineren met een elektrofysiologische setup die gelijktijdig intracellulair Ca2 + en enkele kanaalactiviteit opname kan verschaffen. Fura2-AM laden van glomeruli podocytes met filter-wheel monochromator en grijsfilters setup wordt veel gebruikt, maar is niet altijd geschikt voor de kwaliteit van hoge resolutie beeldvorming.
Voorts zij opgemerkt dat de geïsoleerde, functionele glomerulus kan het volume in respons op fysiologische stimuli veranderen. De onderzoeker moet zich bewust zijn van deze tijdens het uitvoeren van deexperimenten en zorgvuldig kiezen van de focal plane tijdens confocale studies om het verlies van scherpstelling voorkomen en controlemetingen experimenten na selectie van nieuwe geneesmiddelen om onbedoelde contractie of relaxatie testen.
Deze techniek biedt een unieke gelegenheid om veranderingen aan calcium influx bij de enkele ionkanaal en individuele cellen spiegels na farmacologische ingrepen of andere manipulaties verschillende knaagdier achtergronden controleren. Deze techniek kan ook worden gebruikt in de menselijke nierziekte studies als een gemodificeerd protocol kan worden toegepast op weefsel van nierbiopten, die ongetwijfeld zal buitengewoon waardevolle informatie. Daarnaast kan calciumconcentratie metingen worden gecombineerd met de elektrofysiologische patch-clamp experimenten in real time, die meer diepgaande en mechanistisch inzicht in de regulatie van calcium handling binnen podocytes in normale en pathologische omstandigheden kan voorzien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag naar Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) en Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) bedanken voor de uitstekende technische hulp bij microscopie experimenten. Gregory Blass is erkend voor kritische revisie van het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door de National Institutes of Health subsidie HL108880 en American Diabetes Association verlenen 1-15-BS-172 (AS), en de Ben J. Lipps Research Fellowship van de American Society of Nephrology (DVI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| Poly-ʟ-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| Tube rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Germany |
| Nikon confocal microscope (inverted) | Nikon | Nikon A1R | Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm |
| Objective | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | Silicone Compound | |
| Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low pass filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
| Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| TEA chloride | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | without antibiotics |
| BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% albumin solution |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Steel sieves: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
| mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | screen for CD-1 |
| Binocular microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Binocular microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| Polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia |  VetEquip, Inc. |
911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
- Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
- Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
- Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
- Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
- Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
- Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
- Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
- Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771 (2009).
- Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
- Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
- Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
- Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
- Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
- Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
- Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
- Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
- Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
- Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).
