Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Одноканальный анализ и Кальций изображений в подоцитов в Свежевыделенные клубочков

Published: June 27, 2015 doi: 10.3791/52850
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

Introduction

Почки поддержания гомеостаза баланс для различных веществ и регулируют объем крови таким образом, что определяет общую кровяное давление. Нарушения в почечной фильтрации, реабсорбции или секреции приводят к или сопровождают патологические состояния, начиная от гипер- или гипотензии, чтобы терминальной стадией почечной недостаточности, что в конечном итоге требует трансплантации почки. Почечная блок фильтрации (клубочек) состоит из трех слоев - капиллярный эндотелий, базальной мембраны и одного слоя клеток эпителиальных клеток - подоцитов, которые играют важную роль в поддержании щелевой диафрагмой целостности и функции 1. Дисфункция в полупроницаемую клубочковой фильтра вызывает недержание потери макромолекул, таких как протеинурия. Различные агенты могут повлиять на структуру подоцитов и их процессов стопы, которые определяют целостность клубочки фильтрационного барьера.

Подоцитов участвуют в поддержании гломеeruli функция фильтрации. Было установлено, что неправильное обращение кальция в подоцита приводит к повреждения клеток и играет важную роль в прогрессировании различных форм нефропатии 2,3. Таким образом, разработка модели, которая позволяет для прямого измерения внутриклеточных изменений концентрации кальция будет способствовать для изучения функции подоцитов. Изолированные клубочки ранее использовались в течение многих исследований, включая измерения альбумина коэффициента отражения изменения 4 и оценку интегральных клеточных токов в электрофизиологических измерений 5,6 патч-зажим цельноклеточных. В настоящей работе мы описываем протокол, который позволяет исследователю измерять внутриклеточные изменения концентрации кальция в ответ на применения фармакологических агентов, оценить уровень базальной кальция внутри клеток, а также оценить деятельность индивидуального кальциевых каналов. Ratometric измерения концентрации кальция и патч-зажим electrophysiology были использованы для определения изменения внутриклеточной концентрации кальция внутри подоцита и канала активности, соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использование и благосостояния животных следует придерживаться в Руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных после протоколов, рассмотренных и утвержденных по уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) по.

1. Почки Флеш

  1. Использование 8 до 12 недельных самцов крыс (предложенный является штамм Sprague Dawley, однако другие штаммы разного возраста и пола можно использовать с соответствующими изменениями).
  2. Обезболить животное в соответствии с процедурой, разрешенной протоколом IACUC; контролировать глубину анестезии и осмотрите животное. Подробное описание операции должны быть выполнены в 1,3 - 1,8, можно найти в Ilatovskaya др 7.
  3. После надлежащего анестезии, поместите животное на контролируемой температурой хирургическом столе, сделать срединный разрез брюшной полости (до 3 дюймов в длину), и раскрыть полую вену и аорту.
  4. Вставьте лигатуры вокруг целиакией и верхней брыжеечной артерий и брюшнойаорты выше тех,; не перевязывать.
  5. Блант рассекать брюшной аорты ниже почечных артерий, и поместите две лигатуры вокруг него, но не перевязывать, то зажать выше лигатур аорты и связать нижнюю нить.
  6. Катетер в аорту с трубки из полиэтилена PE50 (прилагается к шприцевой насос, заполненный PBS) ниже зажима и закрепить катетер со второй лигатуры; снять хомут, включить насос и перевязывать аорты и мезентериальные с целиакией артерии. Быстро сделать разрез в почечной вене, чтобы облегчить давление.
  7. Настаивать аорты с заранее охлажденным PBS в течение 2 или 3 мин со скоростью 6 мл / мин.
  8. Стоп перфузии, акциз и decapsulate 7 почки, и положить их на льду в решении PBS. Эвтаназии животное в соответствии с протоколом, утвержденным IACUC.

2. Выделение Крыса клубочков

  1. Подготовка 30 мл свежего раствора 5% BSA в среде RPMI 1640.
  2. Использование лезвие бритвы и ножницы,изолировать кору обеих почек, а затем пропустить через мясорубку не до однородной консистенции. Эта процедура была описана ранее 7.
  3. Нажмите ткани фарш на предыдущем этапе через 100 меш из нержавеющей стали (предварительно вымоченные в 5% БСА / раствор RPMI) с помощью шпателя. Соберите проточный и силы тяжести позволяет проточный, чтобы пройти через 140 меш.
  4. Фильтр проточные полученная от 140 меш, используя предварительно пропитанной 200 меш, отбросить фильтрата, и мыть верхнюю часть сито с 10 - 15 мл приготовленного раствора БСА / RPMI для сбора клубочков, что осадка на сито.
  5. Поместите раствор БСА / RPMI, содержащей клубочков на льду в 15 мл пробирку и пусть клубочков осадок на дне пробирки в течение 20 мин. Клубочки концентрат на дне пробирки будет хорошо видно. Удалить избыток раствора, оставляя приблизительно 2 мл в трубке.

3. Одноканальный патч-зажим Эльectrophysiology

  1. Подготовьте 5 х 5 мм покрытие стеклянных осколков путем нанесения их с МВт 70,000 - 150,000 поли-ʟ-лизина, и дайте высохнуть. Используйте примерно 30 мкл 0,01% стерильной отфильтрованной раствор в воде за покровного стекла.
  2. Разминка экспериментальные решения РТ и заполнить патч-зажим камеру и пипетки. Для мониторинга TRPC каналов, использовать раствор ванны, мм: 126 NaCl, CaCl 2 1, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 10 глюкозы, рН 7,4; Пипетка: 126 NaCl, CaCl 2, 1,5, 10 HEPES, 10 глюкозы; рН 7,4.
    1. Добавить ингибиторы пипетки раствор, чтобы блокировать активность эндогенных каналов, которые не имеют отношение к исследований (рекомендуются: 100 мкМ нифлумовую кислоты или DIDS (блокировать Са 2+ -активированную Cl - каналов), 10 мМ TEA (ингибировать большой проводимостью Са 2 + - зависимой К + каналов), 10 нМ iberiotoxin (блокировать Са 2+ -активированную К + каналы), 10 мкМ никардипин (блокировать N-типа Ca2+ каналы)) непосредственно перед экспериментом патч-зажим.
  3. Аккуратно перемешайте клубочков раствор, содержащий, а затем применить примерно 50 мкл этом поли-ʟ-лизин покрытием крышки стеклянных осколков. Пусть клубочки приложить примерно 5 мин.
  4. Перемещение стеклянных осколков с клубочков к патч-зажим камеры предварительно заполнены раствор бани; заливать в камеру со скоростью 3 мл / мин в течение 1 мин, чтобы обеспечить удаление неприкрепленной клубочков.
  5. Провести эксперимент обычный патч-зажим в режиме клеточной прилагается 7. Со стеклянной пипетки (7 - 10 МОм сопротивления пипетки) образуют с высоким сопротивлением уплотнение между пипеткой и подоцитов мембраны путем легкого всасывания (пипетки, прикрепленный к подоцита на поверхности изолированного клубочка показано на рисунке 2, на слева).
  6. Для измерений клеточных-присоединены, нижних частот токов на частоте 300 Гц с помощью фильтра восемь полюсов Бесселя.
  7. USE изолированы клубочки в патч-зажим для экспериментов до 4 - 6 часов. Держите фондового клубочков фракции на льду.

4. Логометрический конфокальной флуоресцентной Измерения внутриклеточной концентрации кальция в подоцитов

  1. Поместите 500 мкл клубочков фракции (описано в 2.5) в 0,5 мл коническую трубку и добавить кальция красители Фура красный, AM и Fluo-4, AM. Использование 1 мМ исходный концентрации Fura Red, AM и Fluo-4, AM, соответственно (хранить при -20 ° C, растворенного в ДМСО) 2 мм и и использовать 2,5 мкл каждого красителя в течение 500 мкл фракции клубочков. Сразу же после добавления красителей охватывает трубу с алюминиевой фольгой.
  2. Место труб на вращающемся шейкере в течение по крайней мере 20 мин до 1 ч при комнатной температуре.
    Примечание: Фармакологические агенты могут быть добавлены на этой стадии.
  3. Подготовьте покровные стекла, покрывают их поли-ʟ-лизина и дать высохнуть при помощи нагретой пластины набор до 70 ° С.
  4. После того, как загрузка красителей кальция завершенае, применять 100 мкл клубочков, содержащих решение покровные покрытием поли-ʟ-лизин и пусть прилипает к поверхности примерно на 5 мин. Установите клубочков-прикреплен покровные в камере формирования изображения, и заливать раствором ванны (содержащий (в мМ): 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, рН 7,35) со скоростью 3 мл / мин для удаления незакрепленные клубочки и остальные красители.
  5. Установка конфокальной лазерной сканирующей микроскопии на длине волны возбуждения 488 нм и эмиссии фильтров (525/25 и 650/25 нм для Fluo-4 и Fura Red, соответственно). Установите программное обеспечение визуализации на нужную частоту и разрешение.
  6. Найти клубочков в светлое, а затем включите обнаружения сигнала флуоресценции. Регулировка интенсивности лазера для каждого красителя, чтобы избежать насыщения сигнала. Выбрать фокальной плоскости с подоцитах которые непосредственно присоединенными к стеклу. Это сводит к минимуму эффект, вызванный сжатием клубочка в ответ на лекарстваприменение. Дважды проверьте, что клубочек выбора правильно приложен к стеклу;
  7. Начните визуализации фокальной плоскости выбора (принимать 512 х 512 изображений с частотой, установленной на 4 сек для визуализации быстрый Ca 2+ переходные изменения. Используйте 60X / NA 1.4 или аналогичный объектив для изображения высокого разрешения), применяются препараты, представляющие интерес, и записать ответ.
    1. Выбирают желаемую фокальной плоскости (как можно ближе к поверхности стекла, как это возможно, чтобы обеспечить визуализацию подоцитах на поверхности клубочка). Проверьте интенсивность флуоресценции на Fluo4 и FuraRed каналов, и убедитесь, что клубочек четко видно в светлое.
    2. Начните изображений. Перед применением любых лекарственных средств, запись по крайней мере, 1 мин базовой флуоресценции, чтобы убедиться, что сигнал является стабильным (нет резких пиков или угасание сигнала).
    3. Применение желаемых препаратов с помощью микропипетки; будьте осторожны и убедитесь, препарат был в состоянии диффузного хорошо и достичь glomerулус. Смешайте раствор ванны осторожно, при необходимости, контролировать выбранный фокальной плоскости и убедитесь, что он не двигался в фокусе из-за применения препарата.
    4. Запишите изменения в интенсивности флуоресценции для сигналов Fluo4 и FuraRed. Убедитесь, что записи достаточно долго, по дожидаясь сигнала не достигнет уровня плато или достигает пика, а затем возвращается к исходному. Выполнение изменения решение или добавление каких-либо других лекарственных средств, если это необходимо.
    5. Остановить запись и сохранить файл в родном формате программного обеспечения.

5. Анализ изображения для измерения кальция

  1. Выполнить анализ изображения с ImageJ программного обеспечения с открытым оснащенный технический модуль Н.Д., что позволяет импортировать изображения в родном формате ND2.
  2. Импорт последовательность изображений; убедитесь, что разделить каналы и использовать режим HyperStack в оттенках серого.
  3. Следуйте Analyze → Инструменты → ROI менеджер путь в программном обеспечении ImageJ к оручка окно менеджера ROI. Выберите несколько регионов интереса (подоцитов), используя овальную инструмент отбора и "Добавить (T)" функцию в диспетчере ROI. В качестве последнего ROI, выберите область в фоновом режиме; сохранить выбранные трансформирования (Подробнее → Сохранить).
  4. Выделите окно, содержащее выбранный канал для анализов. Используйте Подробнее → Многофункциональный Мера в диспетчере ROI, отметьте "одна строка за кусочком" окно в диалоге, который появляется, а затем нажмите кнопку ОК. Результаты будут показаны в формате, который может быть установлен в окне результатов: войти в меню опций результатов измерений → Установить, выберите "Mean серый значение" и вычислить значения интенсивности пикселей для каждого ROI, который будет отображаться в Окно результатов в отдельных столбцах для каждого ROI.
  5. Скопируйте измеренные значения интенсивности ROI для каждого канала (Fluo-4 и Фура красный) в предпочтительном программного обеспечения для анализа данных; вычитать значения интенсивности фона от каждой DATточка.
  6. Для каждого момента времени рассчитать отношение интенсивностей Fluo-4 Фура Red каналов. Участок разброс / линии точка времени изменения Са 2+ переходного для каждого ROI. Рассчитать значения Среднее / SE для выбранных клубочков.
    Примечание: колонка Время должно быть установлено в соответствии с частотой изображения, выбранного в 4,5.

6. Концентрация внутриклеточного кальция Расчеты Использование Fluo-4 флуоресценции сигнал

  1. Возьмите образец клубочков и выполнять экспериментальный протокол до шага 4.7. После записи фоновой флуоресценции добавить Ionomycin (конечная концентрация в ванне камеры должен быть не менее 10 мкМ) в растворе ванны, и увеличение интенсивности флуоресценции записи. После того, как интенсивность достигает своего максимума и спада начинается, добавить MnCl 2 (конечная концентрация должна быть 5 мм), чтобы погасить флуоресценции 8.
  2. Анализ полученных в 6.1 данные. Скопируйте значения интенсивности ROI Fluo-4 сигнал, полученный попротоколу, описанному в 5.1 - 5.5 от предпочтительного программного обеспечения для анализа.
  3. Рассчитать внутриклеточной концентрации кальция (в нМ) в подоцита соответствующей ROI, используя формулу:
    Уравнение 1
    где К д является предварительно определяется константа диссоциации Fluo-4 (345 нМ), F является интенсивность в временной точки, что вы расчета концентрации кальция для (базового) и F мин и макс F являются значения интенсивности на точка максимальной нагрузки кальция (после Ionomycin приложения) и после тушения флуоресценции (с MnCl 2), соответственно (рисунок 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы обращались к проблеме измерения острых изменений в уровнях кальция в подоцитов. Рисунок 1 показывает схематическое представление экспериментальной протокол, предназначенный для того, чтобы выполнить высокое разрешение жить конфокальной микроскопии флуоресценции и отдельные записи активности ионных каналов в подоцитов в недавно изолированные клубочки грызунов. Вкратце, после анестезии крысы, почки следует промыть PBS, чтобы очистить их от крови. Затем почки вырезали и decapsulated и клубочки изолированы от коры почки по дифференциальной просеивания. Часть образца может быть принято для анализа патч-зажим и остальные могут быть загружены с флуоресцентной кальция красителей Fluo-4, АМ и Фура красный, AM, чтобы выполнить конфокальной логометрического изображений кальция.

Электрофизиологические измерения одного канала активности ионов может быть выполнена сразу после выделения клубочков. Активность ионов чаnnels может быть измерена как в клеточных прилагается и целых клеток конфигураций метода патч-зажим. Чтобы продемонстрировать возможности подхода показан запись одной TRPC, как кальций активности ионов проведения канала (рис 2). Кроме того, можно применять клетки проницаемым или рецептор-связывающий препараты, чтобы проверить их воздействие на приток кальция в подоцитах на уровне одиночных ионных каналов.

Подход, который позволяет оценить деятельность канала одного иона производит различные данные, которые могут характеризовать функцию подоцита. Тем не менее, он может быть значительно дополнена путем измерения изменения концентрации кальция на уровне целых клеток. Для выполнения таких исследований, свежевыделенных клубочки были загружены с флуоресцентными красителями для конфокальной микроскопии высокой пропускной способностью. С высоким оптическим разрешением можно контролировать уровень кальция в нескольких подоцитах одновременно. Рисунок 3 демонстрирует по времениКонечно для типичного эксперимента по оценке изменения концентрации кальция внутри подоцита. Базальная концентрация кальция в подоцита оценивали по флуоресценции Fluo-4. После регистрации интенсивности базального сигнала в течение 1 мин (F), Ionomycin применяется и вызывает пик флуоресценции (F макс) должны быть достигнуты, который затем гасили MnCl 2 (F мин отмечено). В соответствии с формулой в 6,3, интенсивность Fluo-4 сигнала в каждый момент времени эксперимента могут быть затем переведена на фактическую концентрацию ионов кальция в клетке. Как видно из графика, значит, флуоресценцию в фоновом режиме (около 400 условных единиц) переводит в 140 Нм, который находится в пределах нормального диапазона концентрации внутриклеточного кальция для здоровых, не апоптоза клеток.

Важность и полезность описанного подхода оправдано в другом приложении, что позволяет для измерения острой transie кальцияНТС в подоцитах в ответ на различных препаратов. 4А показывает репрезентативные изображения клубочки крыс окрашивали Fluo-4 и Fura Red в 2 мМ содержащего кальций раствора (описанного в 4.5) до и после добавления 10 мкМ АТФ. Обратите внимание на резкое увеличение зеленого (Fluo-4 AM) флуоресценции подоцитов (отмечены стрелками), и падение Фура Красной флуоресценции (красный псевдоцветовую). Fluo4 и FuraRed отразить увеличение концентрации кальция при длине волны возбуждения 488 нм в обратном направлении т.е. когда концентрация кальция в клетке увеличивает интенсивность Fluo 4 идет вверх, в то время как FuraRed понижается. Это возможно из-за двойственной природы возбуждения FuraRed флюорофора. В зависимости от длины волны возбуждения он может вести себя как кальций связан (420 нм) или бескальциевой (488 нм) флюорофора с соответствующим увеличением или уменьшением флуоресценции. Таким образом, использование FuraRed один в логометрической режиме изображений можно, однако это RequirES две длины волны возбуждения - 420 нм и 488 нм. Это позволит уменьшить частоту изображений по крайней мере, в два раза (по сравнению с использованием одного возбуждения длин волн); если исследователь хотел бы сохранить быстрый темп изображений, должна быть уменьшена разрешение изображения. Тем не менее, Fluo 4 и FuraRed могут быть использованы вместе в логометрической режиме без потери разрешения или снижения частоты изображений, так как эти флуорофоры могут возбуждаться же нм лазера 488, и обеспечивают хорошую дифференциацию спектров излучения. Типичный переходный обобщены из трансформирования отмечены стрелками на рисунке 4A показано на рисунке 4В; График наглядно демонстрирует острую увеличение / отношение FuraRed интенсивности Fluo4 после добавления 10 мкМ АТФ, который распадается в течение нескольких минут. Изображения были взяты каждые 4 секунды, и, следовательно, этот метод позволяет наблюдать быстрые изменения концентрации кальция внутри клетки.


Рисунок 1. Схематическое изображение экспериментальной протокола. После животное правильно анестезии и подготовлены к операции, почки промыть PBS, чтобы удалить кровь. Затем почки вырезали и decapsulated и клубочки изолированы от коры почки по дифференциальной просеивания. Здесь часть образца берется для анализа патч-зажим, и остальное загружается с флуоресцентными красителями кальция и конфокальной логометрической изображений кальция осуществляется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Представитель записи, показывающий активность TRPC кальциевых каналов в Podocytes о свежевыделенными крыс клубочков. Левая панель демонстрирует патч-зажим пипетку, присоединенную к телу подоцитов на поверхности клубочка во время электрофизиологические записи в конфигурации клеток-присоединены; часть капсулированных клубочек можно увидеть в правом нижнем углу изображения. Представитель тока след деятельности каналов TRPC, как от пластыря клеток подключением сделанного на подоцита крысы клубочек на проведение потенциала -40 мВ показано на рисунке справа. С и О я обозначают закрытые и открытые уровни каналов, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель эксперимент разработан для оценки внутриклеточного уровня кальция в подоцитов. Для измерения внутриклеточной концентрации кальция, клубочки загружены Fluo-4, М., интенсивность флуоресценции регистрируется в базовом и после добавления иономицина и MnCl 2. График показывает изменения сигнала флуоресценции в ответ на Ionomycin (производство максимума Fluo-4 флуоресценции, F макс) и MnCl 2, который гасит краситель и результаты в низкой интенсивности флуоресценции (F мин). Интенсивность флуоресценции (абсцисса) оставили для каждой временной точки могут быть переведены в реальной концентрации кальция в нмоль (правая ось абсцисс) по формуле в 6,3. Обратите внимание на вставки с изображениями, показывая подоцитов в точках времени, когда были рассчитаны F, F макс и Р мин. График, приведенный здесь, отражает интенсивность флуоресценции подоцита отмеченных кружком (ROI); Снимки были сделаны каждые 4 сек.НК "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Измерение переходных кальция в подоцитов в ответ на АТФ. (А) Типичные изображения, иллюстрирующие дикого типа крыс клубочки окрашивали Fluo-4 (зеленый) и псевдоцветном Fura Red (красный псевдоцветовую) в 2 мМ содержащего кальций раствора до и после добавления 10 мкМ АТФ. Нижняя интенсивность зеленого цвета флуоресценции перед применением препарата должно быть отмечено. (В) Обобщенная пример внутриклеточного кальция переходного вызывала у подоцитах применением 10 мкМ АТФ. Обратите внимание на сильный и быстрый рост коэффициента интенсивности флуоресценции Fluo-4 / Фура Красной после добавления препарата, что составляет для стимуляции и истощении депо кальция и приток кальция из йэлектронной снаружи в клетке, в результате возвышения внутриклеточной концентрации кальция. Усы представляют стандартную ошибку средств, рассчитанный для 11 подоцитов той же клубочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный здесь подход позволяет проводить анализ обработки кальция подоцитов грызуна клубочков. Этот метод позволяет применение патч-зажим электрофизиологии одного канала и флуоресценции пропорциональный конфокальной микроскопии. Тем не менее, оба подхода могут быть использованы отдельно, самостоятельно. Предложенный протокол имеет несколько относительно простых шагов, в том числе 1) почек флеша; 2) выделение клубочков по дифференциальной просеивания; 3) осуществление патч-зажим электрофизиологические эксперименты, или инкубационный клубочков с флуоресцентных меток кальция красителей для логометрической конфокальной микроскопии изменения внутриклеточного кальция.

Для выделения клубочки, модифицированный протокол, основанный на Gloy др. 5 был использован. Главное преимущество нынешнего метода дифференциального просеивания является то, что он производит клубочки лишен капсулы Боумена и, таким образом, не требуют сложных и трудоемкий этапручной декапсуляции. Большинство клубочков в изолированном фракции decapsulated, однако исследователь должен знать, что есть капсулированные клубочки, тоже. Важно, чтобы убедиться, что клубочки извлекают из капсулы Боумена изображаются как капсула препятствует наркотики от достижения подоцитов. Как видно на рисунке 2, decapsulated клубочки имеют шероховатую поверхность с различных капилляров и подоцитов органов, в то время как капсулированные клубочки появляются гладкие и круглые формы. Кроме того, инкапсулированные Fluo4 и FuraRed загруженные клубочки выбрасывают менее интенсивный сигнал флуоресценции по сравнению с decapsulated них.

Фракция крыс клубочков Полученный 95% (со следами проксимальных канальцев) и могут быть легко использованы для вестерн-блоттинга или других приложений молекулярной биологии, если это необходимо. Это исключительно важно, что в этой подготовке подоциты крепятся к капиллярам, ​​сохранить нетронутыми процессы ног и функцию как частьродной клубочек фильтрационного аппарата машин. Механизмы обращения кальция по подоцитов служить существенное регулирующую роль в развитии и профилактики почечных осложнений в таких заболеваний, как диабет или гипертония 9-12. Подоцитов внести существенный вклад в барьеры проницаемости, о чем свидетельствует тот факт, что острая травма изменяет подоцита морфологию и структуру и может вызвать протеинурию 2,3,13-15. Поэтому большое значение для наблюдения отклика притока кальция в эти клетки лекарств, которые могут быть легко экранированных в данном препарате. Следует понимать, что если исследователь зондирующего подоцитах в патологическом состоянии, например, гипертонией или диабетом, который обычно приводит к протеинурии и повреждений клубочков, выход клубочков может быть менее чистыми, чем у здоровых животных. Рекомендуется всегда следить клубочков фракции на каждом этапе процесса изоляции, чтобы избежать потериткань. В некоторых случаях, в значительной степени больные клубочки или клубочки с в возрасте или слишком молодых животных может потребоваться индивидуальная настройка процесса изоляции, в том числе выбор больших / меньших сит сетки.

Мы применили этот подход первоначально определить эффективность нестероидных противовоспалительных препаратов в ингибировании TRPC кальциевых каналов в подоцитах 16. После этих исследований 7,16-22 мы использовали описанные методы, чтобы установить несколько важных механизмов, контролирующих функции подоцитов. Например, мы описали профиль P2 (пуринергической) рецепторов в подоцитах крыс и определяется регулирование притока кальция ангиотензин II в клубочках мыши. Как описано в более поздней рукописи 20, протокол может быть приспособлен для выполнения аналогичных исследований не только у крыс, но и у других видов, таких как мыши. Логометрический флуоресценции кальция томография (с использованием двух флуоресцентныхкрасители - Fluo-4 и Fura Red) обеспечивает дополнительную надежность данных, и при необходимости визуализации кальция могут быть объединены с другими флуоресцентными красителями для мониторинга изменений в других веществ в подоцитах. Например, мы использовали этот подход для измерения оксида азота с помощью красителя DAF-FM. Патч-зажим электрофизиологии могут быть использованы отдельно или (настройка позволяет) в сочетании с изображениями кальция. Помимо кальциевых каналов, методика позволяет записывать активность других ионных каналов. Кроме того, использование трансфекции миРНК и может расширить область применения еще более, а недавно было показано группой доктора сушилки 23.

Обычные эпифлуоресцентной микроскопия может быть использована здесь вместо менее доступной конфокальной микроскопии. Тем не менее, исследователь должен знать, что эффективное чувствительность широкого флуоресценции микроскопии, как правило, ограничивается из-фокуса света. Это (в сравнение с конфокальной Imaginг) вызывает такие ограничения, как невозможность получения изображения с высоким разрешением в одном ROI (подоцитов) или его ноги процессов. Кроме того, широко области микроскопии усложняет идентификацию подоцитах поскольку трудно провести различие между поверхностью клубочках и глубоких тканей. В настоящее время коммерческая доступность различных флуорофоров для конфокальной микроскопии намного лучше и быстро расширяется. Кроме того, эпифлуоресцентной исследования могут быть легко объединены с помощью электрофизиологического установки, которые могут обеспечить одновременное внутриклеточного Ca 2+ и один канал записи активности. Фура2-АМ загрузка клубочков подоцитов с фильтром колеса монохроматора и нейтральной плотности установки фильтров широко используется, но не всегда подходит для качества изображения с высоким разрешением.

Следует также отметить, что изолированный, функционально клубочек может изменить свой объем в ответ на физиологические стимулы. Исследователь должен знать об этом при выполненииэксперименты, и тщательно выбрать фокальной плоскости при конфокальной исследований, чтобы избежать потери фокуса, а также выполнять контрольные эксперименты при выборе новых препаратов для того, чтобы проверить непреднамеренное сокращение или расслабление.

Этот метод предлагает уникальную возможность для мониторинга изменений в приток кальция на одной ионного канала и отдельных клеток уровни после фармакологического лечения или других манипуляций, в различных грызунов происхождения. Этот метод может быть также использован в исследованиях человека заболевания почек, как модифицированный протокол может быть применен к тканей, полученных из биопсии почки, которые, несомненно, обеспечивают исключительно ценную информацию. Кроме того, измерения концентрации кальция может быть в паре с электрофизиологических экспериментов патч-зажим в режиме реального времени, которые могут обеспечить более глубокое понимание и механистического в регуляции кальция в обработке подоцитов в нормальных и патологических условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Глена Slocum (Медицинский колледж штата Висконсин) и Колин А. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) за отличную техническую помощь с микроскопии экспериментов. Григорий Бласс признается критического корректуры рукописи. Это исследование было поддержано Национальными Институтами Здоровья грантов HL108880 и Американской Диабетической Ассоциации предоставить 1-15-BS-172 (как), и Бен J. Липс исследовательский грант от Американского общества нефрологии (для DVI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo4 AM Life Technologies F14217 500 µl in DMSO
FuraRed AM Life Technologies F-3020
Poly-ʟ-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68 solution
Ionomycin Sigma-Aldrich I3909-1ML
Tube rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753 Germany
Nikon confocal microscope (inverted) Nikon Nikon A1R Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm
Objective Nikon Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
High vacuum grease Dow Corning Silicone Compound
Software Nikon Nikon NIS-Elements
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low pass filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10.2
Nicardipine Sigma-Aldrich N7510
Iberiotoxin Sigma I5904-5UG
Niflumic acid Sigma-Aldrich N0630
DIDS Sigma-Aldrich D3514-25MG
TEA chloride Tocris T2265
RPMI 1640 Life Technologies 11835030 without antibiotics
BSA Sigma-Aldrich A8327 30% albumin solution
Temperature controlled surgical table MCW core for rodents
Steel sieves: #100 (150 μm), 140 (106 μm)
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 Fisher Sci 50-871-316
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 Fisher Sci 50-871-318
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 Fisher Sci 50-871-320
mesh 200 Sigma-Aldrich s4145 screen for CD-1
Binocular microscope Nikon Eclipse TS100
Binocular microscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
Polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia VetEquip, Inc. 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
  2. Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
  3. Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
  4. Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
  5. Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
  6. Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
  7. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
  8. Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
  9. Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
  10. Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
  11. Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771 (2009).
  12. Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
  13. Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
  14. Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
  15. Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
  16. Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
  17. Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
  18. Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
  19. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
  20. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
  21. Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
  22. Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
  23. Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).

Tags

Молекулярная биология выпуск 100 клубочки подоциты изображения кальция ионные каналы конфокальной микроскопии внутриклеточный кальций.
Одноканальный анализ и Кальций изображений в подоцитов в Свежевыделенные клубочков
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ilatovskaya, D. V., Palygin, O.,… More

Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli. J. Vis. Exp. (100), e52850, doi:10.3791/52850 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter