Introduction
Njurar upprätthålla homeostatiska balansen för olika substanser och reglera blodvolymen på ett sätt som bestämmer den totala blodtryck. Störningar i njur filtrering reabsorption eller utsöndring leder till eller följa patologiska tillstånd, allt från hyper- eller hypotension njursjukdom i slutskedet som så småningom behöver njurtransplantation. Njurfiltreringsenhet (glomerulus) består av tre lager - kapillärendotelet, basalmembran och encelliga lager av epitelceller - podocyter, som spelar en viktig roll i upprätthållandet av slitsmembranet integritet och funktion 1. Dysfunktion i permselektiva glomerulär filtrering orsakar urin förlust av makromolekyler, såsom proteinuri. Olika medel kan påverka strukturen av podocyter och deras fot processer, vilka bestämmer integriteten hos glomeruli filtreringsbarriären.
De podocyter är involverade i upprätthållandet av glomEruli filtreringsfunktion. Det har konstaterats att felaktig kalcium hantering av podocyte leder till cellskada och spelar en viktig roll i utvecklingen av olika former av nefropatier 2,3. Därför, utveckling av en modell som möjliggör direkt mätning av intracellulära förändringar kalciumkoncentration kommer att vara avgörande för studier av podocyte funktion. Isolerade glomeruli har tidigare använts i ett stort antal studier, inklusive mätning av albumin reflektionskoefficienten förändras 4 och bedömning av integralcellströmmar i hela celler elektro patch-clamp mätningar 5,6. I föreliggande dokument beskriver vi protokoll som gör det möjligt för forskare att mäta intracellulära förändringar kalciumkoncentration som svar på tillämpningar av farmakologiska medel, uppskatta basala nivåer av kalcium i cellerna, och bedöma enskilda kalciumkanaler aktivitet. Ratometric mätningar kalciumkoncentration och patch-clamp electrophysiology användes för att bestämma förändringar i den intracellulära kalciumkoncentrationen inom podocyte och kanalaktiviteten, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djur användning och välfärd ska ansluta sig till NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur efter protokoll granskas och godkänns av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
1. Njure Flush
- Använd 8 till 12 veckor gamla hanråttor (föreslås är en Sprague Dawley-stam, men andra stammar av olika ålder och kön kan användas med lämpliga ändringar).
- Söva djuret enligt det förfarande som är tillåtet enligt lACUC protokollet; övervaka anestesidjupet och inspektera djuret. Den detaljerade beskrivningen av operationen som skall utföras i 1,3-1,8 kan hittas i Ilatovskaya et al 7.
- Efter lämplig anestesi, placera djuret på en temperaturstyrd operationsbordet, gör ett mittlinjesnitt av buken (upp till 3 inches i längd), och avslöja vena cava och aorta.
- Sätt ligatur runt celiaki och överlägsen mesenteriska artärer och bukenaorta ovanför dem; inte ligera.
- Blunt dissekera bukaorta nedanför njurartärerna, och placera två ligaturer runt det, men inte ligera, sedan klämma aortan ovanför ligaturer och knyta undertråden.
- ANVÄNDA KATETER aortan med en polyeten PE50 slang (ansluten till en sprutpump fylld med PBS) under klämman och fäst katetern med andra ligatur; ta bort klämman, slå på pumpen, och ligera aorta och mesenteriala med celiaki artärer. Snabbt göra snitt i njurvenen att lätta på trycket.
- Ingjuta aortan med pre-kylda PBS under två eller tre minuter vid en hastighet av 6 ml / min.
- Stoppa perfusion, punktskatter och decapsulate 7 njurarna och lägg dem på is i PBS-lösning. Euthanize djuret enligt protokollet godkänts av IACUC.
2. Isolering av Rat Glomeruli
- Bered 30 ml färsk lösning av 5% BSA i RPMI 1640.
- Med användning av ett rakblad och saxar,isolera cortex av båda njurarna, och sedan finhacka tills homogen. Detta förfarande har beskrivits tidigare 7.
- Tryck vävnaden malet under föregående steg genom en 100 mesh rostfritt sikt stål (pre-indränkt i 5% BSA / RPMI lösning) med hjälp av en spatel. Samla genomströmning och genom gravitationskraften tillåter genomflödet att passera genom en 140 mesh sikt.
- Filtrera genomflödet uppsamlades från de 140 mesh sikt med användning av en i förväg dränkts 200 mesh sikt, kassera filtratet och tvätta toppen av sikten med 10-15 ml av den framställda BSA / RPMI-lösning för att samla glomeruli som sedimenterar på sikten.
- Sätt BSA / RPMI-lösning innehållande glomeruli på is i en 15 ml rör och låt glomeruli sediment vid botten av röret i upp till 20 minuter. Glomeruli koncentrera sig på botten av röret kommer att tydligt. Avlägsna överskott av lösning, med ungefär 2 ml i röret.
3. Single-kanal Patch-clamp Electrophysiology
- Förbered 5 x 5 mm täckglaschips genom att belägga dem med MW 70.000 - 150.000 poly-ʟ-lysin, och låt torka. Använd cirka 30 pl av 0,01% steril filtrerad lösning i vatten per täckglas.
- Värm upp de experimentella lösningar till RT och fylla patch-clamp kammaren och pipetten. För trpC kanaler övervakning, använd en badlösning i mM: 126 NaCl, 1 CaCl2, 10 HEPES, 2 MgCl2, 10 glukos, pH 7,4; pipett: 126 NaCl, 1,5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glukos; pH 7,4.
- Lägg hämmare till pipetten lösning för att blockera aktiviteten av endogena kanaler, som inte är relevanta för studier (rekommenderas är: 100 iM niflumsyra eller DIDS (för att blockera Ca2 + -activated CL - kanaler), 10 mM TEA (för att hämma stora konduktans Ca 2 + - beroende K + kanal), 10 nM iberiotoxin (att blockera Ca2 + -activated K + kanaler), 10 iM nikardipin (för att blockera N-typ Ca2+ kanaler)) direkt innan patch-clamp-experiment.
- Blanda försiktigt glomeruli-lösningen, och sedan tillämpa cirka 50 pl till poly-ʟ-lysin belagda täckglaschips. Låt glomeruli fästa under cirka 5 minuter.
- Flytta glaschips med glomeruli till patch-clamp kammare förfylld med badlösningen; BEGJUTA kammaren vid en hastighet av 3 ml / min under 1 min för att säkerställa avlägsnandet av de obundna glomeruli.
- Genomföra en konventionell patch-clamp experiment i en cell-anslutna läge 7. Med en glaspipett (7-10 Mohm pipett motstånd) bildar en hög resistans tätning mellan en pipett och en podocyte membran genom ett lätt sug (en pipett fäst till en podocyte på ytan av den isolerade glomerulus visas i figur 2, på vänster).
- För celllösa mätningar, låg-pass strömmarna vid 300 Hz med en åtta-polig Bessel-filter.
- USE isolerade glomeruli i patch-clamp experiment för upp till 4 - 6 timmar. Håll aktie glomeruli fraktionen på is.
4. Propportionell konfokal fluorescens Mätningar av intracellulär kalciumkoncentration i podocyter
- Placera 500 pl av glomeruli fraktionen (beskrivs i 2.5) i 0,5 ml koniska rör och tillsätt kalcium färgämnen Fura Red, AM och Fluo-4, AM. Använd 2 mM och 1 mM förrådskoncentrationer av Fura Red, AM och Fluo-4 AM, respektive (förvaras vid -20 ° C, löstes i DMSO) och använda 2,5 | il av varje färgämne för en 500 | il av glomeruli fraktion. Omedelbart efter tillsats av färgämnena omfattar röret med aluminiumfolie.
- Placera rören på en roterande skakanordning under minst 20 min upp till 1 h vid RT.
Obs: Farmakologiska medel kan tillsättas under detta steg. - Förbered glastäck, täck dem med poly-ʟ-lysin och torka med hjälp av uppvärmd platta inställd på 70 ° C.
- När lastningen av kalcium färgämnen är complete, applicera 100 | il av de glomeruli innehållande lösning på de poly-ʟ-lysin belagda täckglas och låt dem fastnar på ytan under ca 5 minuter. Montera glomeruli lösa täckglas i en avbildning kammare, och BEGJUTA med badlösningen (innehållande (i mM): 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, pH 7,35) med en hastighet av 3 ml / min för att avlägsna De fria glomeruli och de återstående färgämnen.
- Ställ in konfokala laserskanning mikroskop till en 488 nm excitationsvåglängd och emissionsfilter (525/25 och 650/25 nm för Fluo-4 och Fura Red, respektive). Ställ bildbehandlingsprogram till en önskad frekvens och upplösning.
- Hitta glomeruli i ljusfält och slå sedan på detektion av fluorescenssignalen. Justera intensiteten hos lasern för varje färgämne för att undvika mättnad av signalen. Välj fokalplanet med podocyter som är direkt knutna till glaset. Detta minimerar den effekt som orsakas av sammandragning av glomerulus som svar på läkemedelansökan. Dubbelkolla att glomeruli val är väl fäst glaset;
- Börja avbildning fokalplanet val (ta 512 x 512 bilder med frekvensen satt till 4 sekunder för att visualisera snabb Ca2 + gående förändringar. Använd en 60X / NA 1.4 eller liknande objektiv för högupplöst bild), tillämpa droger av intresse, och registrera svaret.
- Välj önskad fokalplan (så nära glasytan som möjligt, för att säkerställa avbildning av podocyter på ytan av glomerulus). Kontrollera intensiteten av fluorescens på Fluo4 och FuraRed kanaler, och se till att glomerulus är tydligt i bright.
- Starta avbildning. Innan tillämpningen av några droger, att spela in åtminstone 1 minut av baslinjen fluorescens se till att signalen är stabil (det finns inga plötsliga spikar eller blekning av signalen).
- Applicera önskade läkemedel med hjälp av en mikropipett; vara försiktig och se till att läkemedlet kunde sprida bra och nå glomerUlus. Blanda badlösningen försiktigt om det behövs, övervaka valda fokalplanet och kontrollera att det inte rörde sig ur fokus på grund av drogansökan.
- Spela förändringarna i fluorescensintensitet för Fluo4 och FuraRed signaler. Se till att inspelningen är tillräckligt lång, genom att vänta tills signalen når platånivå eller når en topp och sedan återvänder till baslinjen. Utför lösning ändring eller tillägg av andra läkemedel om det behövs.
- Stoppa inspelningen och spara filen i det ursprungliga formatet av programvaran.
5. Bildanalys för kalcium Mätningar
- Utför bildanalys med ImageJ öppen programvara utrustad med ND Utility plugin som gör det möjligt att importera bilder i det ursprungliga ND2 format.
- Importera bildsekvensen; se till att dela upp kanalerna och använda en Hypers gråskala läge.
- Följ Analysera → Verktyg → ROI manager väg i ImageJ programvara för att openna ett ROI manager fönster. Välj flera regioner av intresse (podocyter) med hjälp av en oval markeringsverktyg och "Lägg till (t)" funktion i ROI Manager. Som sista ROI, välj område i bakgrunden; spara de valda ROI (mer → Spara).
- Markera fönstret som innehåller den valda kanalen för analyser. Använd mer → Multi Mät funktion i ROI Manager markera "en rad per segment" rutan i dialogen som dyker ut och klicka på OK. Resultaten kommer att visas i det format som kan sättas upp i resultatfönstret: gå in menyalternativet Resultat → Set Mått, välj "Mean gråvärdet" och beräkna pixelintensitetsvärdena för varje ROI, som kommer att visas i Resultat fönster i separata kolumner för varje ROI.
- Kopiera de uppmätta ROI intensitetsvärdena för varje kanal (Fluo-4 och Fura Red) i föredragna dataanalys programvara; Subtrahera bakgrundsintensitetsvärden från varje daten punkt.
- För varje tidpunkt beräkna förhållandet mellan intensiteterna för Fluo-4 till Fura Red kanaler. Tomt scatter / linjepunkt tidsändringar Ca2 + gående för varje ROI. Beräkna Mean / SE-värden för valda glomeruli.
Obs: Time kolumnen skall fastställas enligt avbildning frekvens som är vald på 4,5.
6. intracellulära kalciumkoncentrationen Beräkningar med Fluo-4 fluorescens Signal
- Ta ett prov av glomeruli och utföra det experimentella protokollet upp till steg 4,7. Efter inspelning av bakgrundsfluorescens lägga Ionomycin (slutkoncentration i badet kammaren bör vara 10 | iM) till badlösningen, och spela in fluorescensintensiteten ökar. När intensiteten når sitt maximum och sönderfallet börjar, till MnCl2 (slutkoncentration bör vara 5 mM) för att släcka fluorescensen 8.
- Analysera data som erhållits i 6.1. Kopiera Fluo-4 signal ROI intensitetsvärden som erhållits enligtprotokollet beskrivet vid 5,1-5,5 genom föredragen analysprogram.
- Beräkna intracellulär kalciumkoncentration (i nM) i podocyte motsvarar ROI med hjälp av en formel:
där Kd är en förutbestämd dissociationskonstant för Fluo-4 (345 nM), F är intensiteten vid den tidpunkt som du beräkning av kalciumkoncentrationen för (baslinje), och F min och Fmax är intensitetsvärdena vid punkten för maximal belastning kalcium (efter jonomycin applikation) och efter släckning av fluorescensen (med MnCl2), respektive (se fig 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här har vi tagit upp problemet med att mäta akuta förändringar i kalciumnivåer i podocyter. Figur 1 visar en schematisk bild av det experimentella protokollet utformat för att utföra hög upplösning levande fluorescens konfokala imaging och enstaka jonkanalaktivitet inspelningar i podocyter av den nyligen isolerade gnagare glomeruli. I korthet, efter råttan nedsövd, njurarna ska spolas med PBS för att ta bort dem av blod. Därefter är njurarna skars ut och decapsulated, och glomeruli är isolerade från njurbark genom differentiell siktning. En del av provet kan tas för patch-clamp analys och resten kan laddas med fluorescerande kalcium färgämnen Fluo-4, AM och Fura Red, AM för att utföra konfokala ratiometrisk kalcium avbildning.
Elektrofysiologiska mätningar av den inre jonkanalaktivitet kan utföras direkt efter isolering av glomeruli. Aktivitet hos jon channels kan mätas både i celllösa och helcells-konfigurationer av patch-clamp-metoden. För att demonstrera genomförbarheten av den metod som visas är inspelningen av den inre trpC liknande kalciumledande jonkanalaktivitet (Figur 2). Dessutom är det möjligt att applicera cellpermeabel eller receptorbindande läkemedel för att testa deras effekter på kalciuminflöde i podocyter på nivån för enskilda jonkanaler.
Ett tillvägagångssätt som gör att enda jonkanalaktivitet bedömning producerar en mängd olika data som kan karakterisera podocyte funktion. Det kan dock vara mycket kompletteras genom att mäta förändringar kalciumkoncentrationen på nivån för de hela cellerna. För att utföra sådana studier, var nyligen isolerade glomeruli laddad med fluorescerande färger för hög genomströmning konfokala avbildning. Med optisk upplösning är det möjligt att övervaka kalciumnivåer i flera podocyter åt gången, fig. 3 visar tids-kurs för typiskt experiment som syftar till att utvärdera förändringar i kalciumkoncentration inom podocyte. Den basala kalciumkoncentrationen inom podocyte utvärderades baserat på Fluo-4 fluorescens. När den basala signalintensiteten under 1 minut (F), är Ionomycin tillämpas och orsakar maximal fluorescens (F max) som skall uppnås, som sedan släcktes genom MnCl2 (F min noteras). Enligt formeln i 6,3, kan intensiteten av Fluo-4 signal vid varje tidpunkt av experimentet kan sedan översättas till den verkliga koncentrationen av kalciumjoner i cellen. Såsom framgår av diagrammet, innebär fluorescens i bakgrunden (ungefär 400 godtyckliga enheter) översätts till 140 nM, vilket är inom ett normalt koncentrationsintervall för intracellulärt kalcium hos friska icke-apoptotiska celler.
Betydelsen och nyttan av det beskrivna tillvägagångssättet är motiverat av ett annat program, som gör det möjligt att mäta akut kalcium transients i podocyter som svar på olika läkemedel. Figur 4A visar representativa bilder av råtta glomerulus färgades med Fluo-4 och Fura Red i 2 mM kalciuminnehållande lösning (beskriven i 4,5) före och efter tillsats av 10 pM ATP. Observera en dramatisk ökning i det gröna (Fluo-4 AM) fluorescens av podocyter (markerade med pilar), och en droppe i Fura Red fluorescens (röd pseudo). Fluo4 och FuraRed återspeglar en ökning av kalciumkoncentrationen vid en excitationsvåglängd av 488 nm i motsatt sätt dvs., när kalciumkoncentrationen i cellen ökar Fluo 4 intensitet går upp, medan FuraRed går ner. Det är möjligt tack vare dubbla excitation natur FuraRed fluorofor. Beroende på excitationsvåglängd det kan bete sig som kalciumbundna (420 nm) eller kalcium-fri (488 nm) fluorofor med motsvarande ökning eller minskning i fluorescens. Därför är användningen av FuraRed ensam i en ratiometrisk bildåtergivningsläge möjligt, men det requires två excitationsvåglängder - 420 nm och 488 nm. Detta kommer att minska frekvensen av avbildnings minst två gånger (jämfört med användningen av en excitationsvåglängd); om forskaren vill behålla den snabba avbildning, bör bildupplösningen minskas. Men Fluo 4 och FuraRed kan användas tillsammans i en ratiometrisk läge utan förlust av upplösning eller minskning av avbildning frekvens, eftersom dessa fluoroforer kan exciteras med samma 488 nm laser, och ger en god differentiering av emissionsspektra. En typisk transient sammanfattas från ROI markerade med pilar i fig 4A visas i figur 4B; diagrammet visar tydligt en akut ökning av Fluo4 / FuraRed intensitetsförhållande efter tillsats av 10 | iM ATP, som sönderfaller i flera minuter. Bilder togs varje 4 sekunder, och därmed tillåter tekniken att observera snabba förändringar i kalciumkoncentrationen i cellen.
Figur 1. Schematisk representation av det experimentella protokollet. Efter det att djuret är ordentligt sövdes och preparerades för kirurgi, är njurarna spolas med PBS för avlägsnande av blod. Därefter är njurarna skars ut och decapsulated, och glomeruli är isolerade från njurbark genom differentiell siktning. Här är en del av provet tas för patch-clamp analys, och resten är laddad med fluorescerande kalcium färgämnen och konfokala ratiometrisk kalcium avbildning utförs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa inspelning som visar aktiviteten hos trpC kalciumkanaler i Podocyter av nyligen isolerade rått glomeruli. Vänstra panelen visar patch-clamp pipett fäst till podocyte kroppen på ytan av glomerulus under en elektrofysiologisk inspelning i ett cell fäst konfiguration; en del av en inkapslad glomerulus kan ses i den högra nedre hörnet av bilden. Representativa nuvarande spår av trpC liknande kanaler aktivitet från en cell bifogade patch göras på podocyte av rått glomeruli vid en -40 mV hållpotential visas till höger. Den c och o jag beteckna slutna och öppna kanalnivåer, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representant experiment som syftar till att bedöma den intracellulära kalciumnivån i de podocyter. För att mäta intracellulär kalciumkoncentration, glomeruli är laddade med Fluo-4, AM, fluorescensintensitet registreras i baslinjen och efter tillsats av jonomycin och MnCl2. Grafen demonstrerar fluorescenssignalen ändras som svar på jonomycin (som ger den högsta av Fluo-4 fluorescens, Fmax) och MnCl2, som släcker färgämnet och resulterar i den lägsta fluorescensintensiteten (Fmin). Intensitet av fluorescens (vänster abskissan) för varje tidpunkt kan översättas i själva kalciumkoncentrationen i nanomol (höger abskissa) enligt formeln i 6.3. Notera inläggningar med bilder som visar podocyter vid tidpunkter när F, F max och F min beräknades. Grafen visas här återspeglar fluorescensintensiteten hos podocyte markerad med en cirkel (ROI); bilder togs var 4 sek.nk "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Mätning av kalcium transienter i podocyter som svar på ATP. (A) Representativa bilder som illustrerar vildtyp rått-glomeruli färgades med Fluo-4 (grön pseudofärger) och Fura Red (röd pseudofärger) i 2 mM kalciuminnehållande lösning före och efter tillsats av 10 pM ATP. Lägre intensitet grönfärgad fluorescens före applicering av läkemedlet bör noteras. (B) Summerat exempel på den intracellulära kalciumövergående framkallade i podocyter genom tillämpning av 10 um ATP. Observera en stark och snabb ökning av Fluo-4 / Fura Red fluorescensintensitetsförhållande efter tillsats av läkemedlet, som svarar för stimulering och utarmning av kalcium depå och kalciuminflöde från the utanför i cellen, vilket resulterar i förhöjning av den intracellulära kalciumkoncentrationen. Felstaplar representerar standardfelet av medel beräknats för 11 podocyter av samma glomerulus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillvägagångssättet beskrivs här möjliggör analys av kalcium hantering av podocyter av gnagare glomeruli. Denna teknik medger tillämpning av patch-clamp enda kanal elektro och fluorescens ratiometrisk konfokal avbildning. Däremot kan båda metoderna användas separat, på egen hand. Den föreslagna protokollet har flera relativt enkla steg, inklusive 1) njure flush; 2) isolering av glomeruli genom differentiell siktning; 3) utföra patch-clamp elektrofysiologiska experiment eller inkubation av glomeruli med fluorescerande kalcium märkning färgämnen för ratiometrisk konfokal avbildning av förändringar i intracellulär kalcium.
För isolering av glomeruli, ett modifierat protokoll baserat på Gloy et al., 5 användes. Den största fördelen med den nuvarande tekniken för differentialsiktning är att den producerar glomeruli avskalade av Bowmans kapsel och därmed inte kräver sofistikerade och tidskrävande stegav manuell decapsulation. Majoriteten av glomeruli i den isolerade fraktionen decapsulated, men forskaren måste vara medvetna om att det finns inkapslade glomeruli, alltför. Det är viktigt att se till att glomeruli avskalade bort från Bowmans kapsel avbildas, som kapsel förhindrar drogerna från att nå podocyter. Såsom framgår av fig 2, decapsulated glomeruli har en grov yta med tydliga kapillärer och podocyte organ, medan inkapslade glomeruli slät och rund-formad. Dessutom inkapslade Fluo4 och FuraRed laddade glomeruli släpper ut mindre intensiv fluorescens signal jämfört med decapsulated dem.
Fraktionen av rått glomeruli erhålles är 95% ren (med spår av proximala tubuli) och kan lätt användas för western blotting eller andra molekylärbiologiska applikationer vid behov. Det är utomordentligt viktigt att podocyter i denna beredning är knutna till kapillärerna, behålla intakta fot processer och fungera som en delav den infödda glomerulus filtreringsapparaten maskiner. Mekanismerna för kalcium hantering av de podocyter tjäna en viktig reglerande roll i utvecklingen och förebyggande av njurkomplikationer i sådana sjukdomar som diabetes eller högt blodtryck 9-12. Podocyter bidrar avsevärt till permeabilitet hinder, vilket framgår av det faktum att akut skada förändrar podocyte morfologi och struktur och kan orsaka proteinuri 2,3,13-15. Därför är det av stor vikt att observera lyhördhet kalciuminflöde i dessa celler till droger, som lätt kan screenas i denna beredning. Det är underförstått att om forskaren sondera podocyter i ett sjukdomstillstånd, till exempel högt blodtryck eller diabetes, vilket brukar resultera i proteinuri och glomeruli skador, utbytet av glomeruli kan vara mindre ren än de friska djur. Det rekommenderas att alltid övervaka glomeruli fraktioner vid varje steg i isoleringsprocessen för att undvika förlust avvävnaden. I vissa fall kan kraftigt sjuka glomeruli eller glomeruli från åldrade eller för unga djur kräver individuell anpassning av isoleringsprocessen, inklusive valet av större / mindre masksiktar.
Vi har tillämpat denna strategi från början att bestämma effektiviteten av icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel vid hämning av kalcium trpC kanalerna i podocyter 16. Efter dessa studier 7,16-22 vi anställt de beskrivna tekniker för att skapa flera kritiska mekanismer som styr podocyter funktion. Till exempel har vi beskrivit profil P2 (purinergisk) receptorer i podocyter hos råttorna och definierade regleringen av kalciuminflöde av angiotensin II i mus glomeruli. Som beskrivs i ett senare manuskript 20, kan protokollet anpassas för att utföra liknande studier inte bara hos råttor, men även i andra arter, såsom möss. Ratiometrisk kalcium fluorescens avbildning (med hjälp av två fluorescerandefärgämnen - Fluo-4 och Fura Red) säkerställer ytterligare tillförlitlighet av data, och om det behövs kalcium avbildning kan kombineras med andra fluorescerande färger för att övervaka förändringar i andra ämnen inom podocyter. Till exempel har vi använt denna metod för att mäta kväveoxid med hjälp av DAF-FM-färgämne. Patch-clamp-elektrofysiologi kan användas ensamma eller (inställning tillåter) i kombination med kalcium avbildning. Förutom kalciumkanaler, möjliggör tekniken att registrera aktiviteten av andra jonkanaler. Vidare kan användningen av transfektion och siRNA utvidga tillämpningsområdet ännu mer, som har nyligen visats av Dr torktumlare grupp 23.
Konventionell epifluorescensmikroskopi kan användas här i stället för mindre överkomliga konfokal avbildning. Dock bör forskaren vara medveten om att den effektiva känsligheten hos brett fält fluorescensmikroskopi i allmänhet begränsas av out-of-fokus ljus. Detta (i jämförelse med konfokal imaging) orsakar sådana begränsningar som oförmåga att producera hög bildupplösning på enstaka ROI (podocyte) eller dess fot processer. Vidare brett fält mikroskopi vårar identifiering av podocyter eftersom det är svårt att skilja mellan yta glomeruli och djup vävnad. Från och med nu kommersiell tillgänglighet av olika fluoroforer för konfokal avbildning är mycket bättre och snabbt växande. Alternativt kunde epifluorescence studier enkelt kombineras med en elektrofysiologisk konfiguration som kan ge samtidig intracellulär Ca2 + och enkelkanalaktivitet inspelning. Fura2-AM lastning av glomeruli podocyter med filterhjul monokromator och neutral densitet filter inställning används i stor utsträckning, men är inte alltid lämpligt för kvalitet med hög upplösning.
Det bör också noteras att den isolerade, funktionella glomerulus är i stånd att ändra sin volym som svar på fysiologiska stimuli. Forskaren bör vara medvetna om detta när de utför denexperiment, och noggrant välja fokalplanet under konfokala studier för att undvika förlust av fokus, och utför kontrollexperiment vid val av nya läkemedel för att testa oavsiktlig kontraktion eller avslappning.
Denna teknik erbjuder en unik möjlighet att följa förändringar i kalciuminflöde på enda jonkanal och enskilda celler nivåer efter farmakologisk behandling eller andra manipulationer, i olika gnagare bakgrunder. Denna teknik kan också användas för studier humana njursjukdomar såsom ett modifierat protokoll kan tillämpas på vävnaderna från njur biopsier, vilket utan tvivel kommer att ge exceptionellt värdefull information. Dessutom kan mätningar kalciumkoncentrationen paras ihop med elektrofysiologiska patch-clamp experiment i realtid, vilket kan ge mer djupgående och mekanistisk insikt i regleringen av kalciumhantering inom podocyter i normala och patologiska tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) och Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) för utmärkt tekniskt bistånd med mikroskopi experiment. Gregory Blass är känd för kritiskt korrekturläsning av manuskriptet. Denna forskning stöds av National Institutes of Health bidrag HL108880 och American Diabetes Association bevilja 1-15-BS-172 (AS), och Ben J. Lipps forskartjänst från American Society of Nephrology (DVI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| Poly-ʟ-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| Tube rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Germany |
| Nikon confocal microscope (inverted) | Nikon | Nikon A1R | Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm |
| Objective | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | Silicone Compound | |
| Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low pass filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
| Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| TEA chloride | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | without antibiotics |
| BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% albumin solution |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Steel sieves: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
| mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | screen for CD-1 |
| Binocular microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Binocular microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| Polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia |  VetEquip, Inc. |
911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
- Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
- Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
- Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
- Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
- Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
- Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
- Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
- Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771 (2009).
- Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
- Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
- Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
- Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
- Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
- Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
- Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
- Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
- Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
- Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).
