Summary
الكوكسيلا البورنيتية هو سلبية الغرام بين الخلايا بكتيريا تلزم مسؤولة عن حمى المرض Q الحيوانية. نحن هنا وصف الطرق لتوليد الكوكسيلا المسوخ ينقول الفلورسنت وكذلك تحديد الآلية وتحليل الناتج الداخلي، والنسخ والسامة للخلايا الظواهر.
Abstract
غزو واستعمار الخلايا المضيفة التي كتبها مسببات الأمراض البكتيرية تعتمد على نشاط عدد كبير من البروتينات بدائية النواة، الذي يعرف بأنه عوامل الفوعة، والتي يمكن تخريب والتلاعب وظائف المضيفة الرئيسية. دراسة التفاعلات المضيف / الممرض ولذا فإن من المهم جدا فهم الالتهابات البكتيرية ووضع استراتيجيات بديلة لمواجهة الأمراض المعدية. هذا النهج ومع ذلك، يتطلب تطوير فحوصات عالية الإنتاجية الجديدة للمتحيز، وتحديد الآلية وتوصيف محددات الفوعة البكتيرية. هنا، نحن تصف طريقة لتوليد مكتبة متحولة الموسومة GFP التي كتبها ينقول الطفرات وتطوير فحص عالية المحتوى نهج لتحديد وقت واحد من عدة الظواهر المرتبطة ينقول. لدينا نموذج عمل هو داخل الخلايا البكتيرية البورنيتية الممرض الكوكسيلا، العامل المسبب للمرض من هذه الأمراض حمى Q، الذي يرتبط مع ذاتهاتفشي فير مع ما يترتب على صحة والعبء الاقتصادي. طبيعة الخلايا تلزم هذه العوامل المسببة للأمراض وحتى وقت قريب، أعاقت بشدة تحديد العوامل البكتيرية تشارك في التفاعلات الممرض المضيف، مما يجعل من الكوكسيلا النموذج المثالي لتنفيذ النهج عالية الإنتاجية / عالية المحتوى.
Introduction
والناشئة، والبكتيريا المتوطنة الكوكسيلا البورنيتية هو المسؤول عن تفشي كبيرة من حمى Q، موهنة شبيهة بأعراض الانفلونزا حيواني المنشأ مع صحية حادة والأثر الاقتصادي 1. الخزانات الرئيسية للالكوكسيلا هي الحيوانات المنزلية والزراعية، وتشير التقديرات إلى أن أكثر من 90٪ من الأبقار الحلوب في الولايات المتحدة تحمل C. البورنيتية 2. البشر هم المضيفين من قبيل الصدفة ان يصاب عن طريق الاستنشاق من الهباء الجوي الملوث. يظهر حمى Q الإنسان إما مرض حاد أو مزمن، والتي قد يكون لها مضاعفات مميتة مع معدل وفيات تصل إلى 65٪ 1،3. مع جرعة المعدية من 1-10 الكائنات الحية، الكوكسيلا هي العوامل المسببة للأمراض المعدية الأكثر المعروفة وكانت قد أجرت التحقيق أنها المحتملين الحيوي سلاح 4. اندلاع ناسفة في الآونة الأخيرة حمى Q في هولندا (2007 - 2010)، مع الحالات تتصاعد من 182 إلى أكثر من 2000 في السنة، وتقف كمثال على الفوعة الشديدة من هذا الممرض5.
كفاءة ملحوظة من التهابات الكوكسيلا المرجح يرتبط مع مقاومته للإجهاد البيئي، جنبا إلى جنب مع التكيف الفريد للخلايا المضيفة. في الواقع، الكوكسيلا موجود في البيئة في شكل غير نشطة عملية الأيض المتغيرات زنزانة صغيرة (SCV)، والتي هي مقاومة ملحوظة لعدة ظروف قاسية (جفاف، ودرجة الحرارة، وغيرها). تؤخذ SCVs من قبل الخلايا البلعمية عبر α V β 3 integrins 6 في حين يتم بوساطة غزو الخلايا غير البلعمية من قبل الكوكسيلا التصاق / الغزو OmpA 7 ومستقبلات بعد مجهولين. بعد امتصاص، الكوكسيلا يقيم في فجوات ضيقة، سواء كان إيجابيا للعلامات endosomal مبكرة Rab5 وEEA1 8. البكتيريا تستجيب للendosomal تحمض عن طريق تحويل إلى المتغيرات زنزانة كبيرة عملية الأيض نشطة (LCVs) وتفعيل نقطة / آي سي إم نوع 4 نظام إفراز (T4SS) 9، مثلي للغاية لأنه من البكتيريا المستروحة 10. إفراز مؤثرات نقطة / آي سي إم تسمح الكوكسيلا لتوليد كبيرة،-LAMP1 إيجابي مقصورة الحمضية التي تحتوي على الانزيمات الليزوزومية نشطة حيث يمكن للبكتيريا تزدهر والعمل بنشاط على حماية الخلايا المصابة من موت الخلايا المبرمج 11. وبالتالي، يتم التحكم في دورة الخلايا من الكوكسيلا من قبل النبات نقطة / آي سي إم بوساطة من المستجيبات البكتيرية 12، ومع ذلك، فإن العوامل الميكروبية المشاركة في غزو الخلية المضيفة، والنسخ البكتيرية ونشر العدوى لا تزال مجهولة إلى حد كبير.
الجمع بين الطفرات ينقول والمقايسات القائم على مضان، نحن نعمل على تطوير المناهج مشاركات لتحديد وقت واحد من العوامل البكتيرية المشتركة في الخطوات الرئيسية لالتهابات الكوكسيلا: 1) استيعاب داخل الخلايا المضيفة، 2) تكرار داخل الخلايا، 3) انتشار الخلية الى خلية و4) استمرار. حتى الآن، لدينا فحص ما يزيد على 1000 مترutations في 500 تسلسل الكوكسيلا الترميز، والتي وفرت لنا رؤى غير مسبوقة في التفاعلات المضيف الممرض التي تنظم الكوكسيلا المرضية 7. من المذكرة، فإن هذا النهج يمكن تطبيقها على دراسة مسببات الأمراض بين الخلايا الأخرى التي تشترك في السمات بيولوجيا الخلية مع الكوكسيلا.
Protocol
1. جيل من مكتبة الموسومة GFP الكوكسيلا المسوخ ينقول
التلاعب الكوكسيلا البورنيتية RSA439 NMII في مستوى الاحتواء للسلامة الأحيائية 2 (BSL-2) في مجلس الوزراء السلامة الميكروبية (MSC) في الامتثال للقواعد المحلية. إذا كان ذلك يتماشى مع النموذج البكتيرية المستخدمة، كرر الخطوات من 1.4.1 إلى 1.4.4 لزيادة احتمال الحصول المسوخ نسيلي. وتتكون مكتبة متحولة نموذجي (على الأقل) من عدد من المسوخ التي تساوي ثلاثة أضعاف عدد الترميز متواليات المشروح في جينوم الكائن المستخدمة.
- إعداد electrocompetent الكوكسيلا RSA439 NMII:
- إعداد 1X ACCM-2 13: 13.4 ملم حمض الستريك، 16.1 ملي سيترات الصوديوم، 3.67 ملي فوسفات البوتاسيوم، 1 ملي كلوريد المغنيسيوم، كلوريد الكالسيوم 0.02 ملم، 0.01 ملم الحديد كبريتات، 125.4 ملي كلوريد الصوديوم، 1.5 ملي L-السيستين، 0.1 غرام / L Bacto Neopeptone، 2.5 غرام / L الأحماض casamino، 1 غرام / L الميثيل بيتا سيكلودكسترين، 125 مل / L RPMI. ضبط درجة الحموضة إلى 4.75 وتعقيم فلتر (لا الأوتوكلاف). ملاحظة: السائل ACCM-2 غير مستقرة عند 4 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 1 في الشهر.
- تطعيم 100 مل من ACCM-2 مع 2 × 10 6 الجينوم يعادل (GE) / مل من الكوكسيلا RSA439 NMII (من الأسهم البكتيرية ولدت وكميا كما في الخطوة 1.5 سابقا) من أسهم C -80 ° وتوزيع تعليق البكتيرية في 75 سم 2 خلية قوارير الثقافة مع قبعات تنفيس (10-15 مل من تعليق البكتيرية في قارورة). تنمو لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية في جو مرطب 5٪ CO 2 و 2.5٪ O 2.
- تجميع تعليق البكتيرية الناجمة في 50 مل الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 3900 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
- تجاهل طاف و resuspend بيليه في 30 مل من 10٪ الجلسرين. أجهزة الطرد المركزي في 3900 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
- resuspend الكرية في حجم كاف من 10٪ الجلسرين (عادة 2 مل)، وقسامة 50 ميكرولتر في 500 ميكرولتر أنابيب. الحفاظ معلق بacteria على الجليد خلال العملية برمتها. ملاحظة: في هذه المرحلة، والبكتيريا هي electrocompetent وقسامة واحدة كافية لأداء Electroporation للواحد. يمكن تخزين تعليق البكتيرية في -80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر أو استخدامها مباشرة ل electroporation من DNA البلازميد.
- Electroporation للمن الكوكسيلا المختصة مع transposon- والبلازميدات ترميز transposase:
ملاحظة: بالنسبة لبروتوكول التالية، يتم ترميز العناصر القابلة للنقل وtransposase من قبل اثنين من البلازميدات مختلفة (pITR-CAT-GFP وpUC19-Himar1C9، على التوالي) 7. كل من البلازميدات تفتقر إلى تكرار الأصل الكوكسيلا محددة، مما يجعلها البلازميدات الانتحار عندما electroporated في الكوكسيلا. وهذا يضمن الإدراج ينقول مستقرة. يحتوي على عنصر القابلة للنقل شريط المقاومة الكلورامفينيكول تحت تنظيم المروج p1169 الكوكسيلا لاختيار والجين GFP تحت تنظيم P311 الكوكسيلا المروج لوضع علامة على المسوخ ولدت مع GFP.- العلاقات العامةتبريد الإلكترونية 0.1 سم كفيت electroporation لمدة 10 دقيقة على الجليد. مزيج 50 ميكرولتر من electrocompetent الكوكسيلا مع 10 ميكروغرام ينقول البلازميد و 10 ميكروغرام من transposase البلازميد 7. ضمان تركيز البلازميد هو أعلى من 500 ميكروغرام / مل للحد من التخفيف من الجلسرين.
- Electroporate باستخدام الإعداد التالية: 18 كيلو فولت، 500 Ω، 25 μF. تأكد من أن ينتج عن ذلك من الوقت ثابت ويتألف ما بين 9 و 13 مللي ثانية.
- إضافة على الفور 950 ميكرولتر من RPMI، resuspend والبكتيريا electroporated ونقل إلى أنبوب سقف المسمار والحفاظ على درجة حرارة الغرفة.
- تأخذ 200 ميكرولتر من البكتيريا electroporated وإضافة إلى 3 مل من ACCM-2 تستكمل مع المعطل للحرارة 1٪ الجنين مصل بقري (FBS) في 6 لوحات جيدة. إضافة 88 ميكرولتر من DMSO إلى حجم ما تبقى من البكتيريا electroporated (للوصول إلى تركيز النهائي من 10٪ DMSO) وتخزينها في -80 ° C.
- اختيار من المسوخ ينقول:
- Incubaالشركة المصرية للاتصالات 6 لوحات جيدا تلقيح كما هو موضح أعلاه (1.2.4) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في جو مرطب 5٪ CO 2 و 2.5٪ O 2. إضافة المضادات الحيوية المناسبة (375 ميكروغرام / مل الكاناميسين أو 3 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول). احتضان ثقافة البكتيرية لمدة 3 أيام إضافية في ظل الظروف المذكورة أعلاه.
- عزل المسوخ الفردية:
- إعداد الصلبة ACCM-2 لوحات والطلاء من الكوكسيلا المسوخ ينقول
ملاحظة: التعليمات التالية هي لل1 طبق بتري، والعديد من التخفيفات من الثقافات البكتيرية يجب أن يتم اختبار لتقييم حجم التلقيح الأمثل لمستعمرة العزلة.- حرارة 10.5 مل من 0.5٪ الاغاروز في الميكروويف وندعه يبرد في 55 ° C حمام الماء. تسخين 11.25 مل من 2X ACCM-2 (الرقم الهيدروجيني 4.75) عند 37 درجة مئوية.
- إعداد الاغاروز القول:
- مزيج 10 مل من ذاب 0.5٪ الاغاروز مع 10 مل من 2X ACCM-2 وإضافة المضادات الحيوية المناسبة (375 ميكروغرام / مل الكاناميسين أو 3ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول).
- صب مباشرة في طبق بيتري. الحفاظ على طبق بيتري unlidded، والسماح للبارد متوسطة لمدة 30 دقيقة والهواء الجاف لمدة 20 دقيقة.
- إعداد كبار الاغاروز:
- مزيج 1.25 مل من 2X ACCM-2 مع 0.75 مل من الماء في أنبوب البوليسترين 5 مل، إضافة المضادات الحيوية المناسبة (375 ميكروغرام / مل الكاناميسين أو 3 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول)، واحتضان عند 37 درجة مئوية.
- إضافة ثقافة البكتيرية (عادة 1-100 ميكرولتر) ودوامة لمدة 5 ثوان.
- إضافة 0.5 مل من الاغاروز ذاب، ومزيج من أجل مباشرة على الاغاروز السفلي.
- السماح لتبرد لمدة 20 دقيقة، واستبدال غطاء على طبق بيتري واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتسهيل التصلب الاغاروز.
- الهواء الجاف لمدة 20 دقيقة unlidded في MSC. تنمو لوحات عند 37 درجة مئوية في جو مرطب 5٪ CO 2 و 2.5٪ O 2 لمدة 6 إلى 7 أيام.
- إضافة DMSO للبكتيريا المتبقيةثقافات لتر من أجل التوصل إلى تركيز النهائي من 10٪ DMSO وتخزينها في -80 ° C.
- تقييم التخفيف الأمثل كما يلي: التأكد من أن المستعمرات هي 0،5-1 ملم في القطر ويتم عزل بشكل صحيح لتجنب التلوث المتبادل. ذوبان الجليد المتبقية الثقافات البكتيرية من وجهة 1.4.2 وطبق في التخفيف المناسبة على ACCM-2 أجار كما هو موضح في 1.4.1.2 و1.4.1.3. احتضان لمدة 6-7 أيام كما هو موضح في 1.4.1.3.5.
- مرة واحدة المستعمرات قابلة للكشف، وجمع لهم من خلال خفض نهاية 1 مل طرف، واختيار المكونات التي تحتوي على المستعمرات المعزولة وتشتيت مستعمرة من قبل pipetting في 1.5 مل من ACCM-2 التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (375 ميكروغرام / مل الكاناميسين أو 3 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول) في 24 لوحة جيدا. تضخيم المستعمرات الفردية لمدة 6 أيام في ظروف وصفها في 1.3.1. في يوم 3 من الحضانة، وتفريق كتل البكتيرية بواسطة pipetting كل ثقافة.
- تخزين كل تعليق متحولة في 2D أنابيب screwcap barcoded في لوحات 96-جيدا في 10٪ DMSO في -80 ° C.
- إعداد الصلبة ACCM-2 لوحات والطلاء من الكوكسيلا المسوخ ينقول
- تقييم تركيز البكتيريا:
ملاحظة: يمكن تطبيق بروتوكول التالية للحصول على منحنيات نمو المسوخ البكتيرية تكرار في المتوسط ممحوضة (انظر 1.4.4).- معيار إعداد منحنى:
- إعداد 2 ميكروغرام حل / الأسهم مل من dsDNA (عادة البلازميد عشوائي من حجم المعروفة والتركيز) في 1X تريس، EDTA (TE). إعداد 10 أضعاف التخفيفات المسلسل من حل الأسهم للحصول على تركيزات تتراوح بين 2 ميكروغرام / مل إلى 2 نانوغرام / مل. الاستغناء عن 50 ميكرولتر من كل التركيز على الآبار واحدة من صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا مع الجدران السوداء وأسفل (انظر جدول المواد).
- تمييع dsDNA الكميات الكاشف 1: 200 في 1X TE العازلة وإضافة 55 ميكرولتر من كاشف المخفف لكل عينة في صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا. تخلط جيدا باستخدام لوحة شاكر واحتضان لمدة 2-5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في الظلام.
- قياس مضان العينات باستخدام يتألقالامتحانات التنافسية الوطنية قارئ صفيحة ميكروسكوبية والمرشحات لموجات القياسية فلوريسئين (الإثارة ~ 480 نانومتر، والانبعاثات ~ 520 نانومتر).
- رسم حدود تركيز البلازميد ضد قراءات كثافة مضان.
- البكتيرية تعليق الكميات:
- الاستغناء عن 5 ميكرولتر من 10٪ تريتون X-100 لكل بئر في صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا مع الجدران السوداء وأسفل (انظر جدول المواد). إضافة 50 ميكرولتر من تعليق البكتيرية إلى كل بئر واحتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، على لوحة شاكر.
- تمييع dsDNA الكميات الكاشف 1: 200 في 1X TE العازلة وإضافة 55 ميكرولتر من كاشف المخفف لكل عينة في صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا. تخلط جيدا باستخدام لوحة شاكر واحتضان لمدة 2-5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في الظلام.
- قياس مضان العينات باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية مضان والمرشحات لموجات القياسية فلوريسئين (الإثارة ~ 480 نانومتر، والانبعاثات ~ 520 نانومتر).
- للحصول على DN البكتيريةA تركيز، مؤامرة القراءات مضان في الرسم البياني الحصول على نقطة 1.5.1.4. تقسيم تركيز الحمض النووي من قبل كتلة من الجينوم الكوكسيلا (2.2 FG) للحصول على تركيزات البكتيرية. التعبير عن النتائج في الجينوم / المكافئة مل.
- المسوخ تجاهل اظهار خلل النمو الكبير في ACCM-2.
- معيار إعداد منحنى:
2. واحدة التمهيدي مستعمرة PCR، والتسلسل، والشرح
ملاحظة: بروتوكول التالي هو لتضخيم DNA 96 عينة، ويوصى ماصة الأقنية للخطوات التالية. يتم التعاقد من الباطن تنقية عمود من المنتجات PCR باستخدام حبات مغناطيسية وتسلسل الحمض النووي مع التمهيدي ينقول محددة (2.3) إلى شركة خارجية.
- تأكد من أن التمهيدي التضخيم صمم من أجل هجن بين 100 و 200 قاعدة أزواج المنبع من تكرار جنبا إلى جنب مقلوب (ITR)، للحصول على منتجات PCR تغطي الموقع الإدراج ينقول على Coxiellالجينوم. إعداد 3 مل من مزيج PCR (1X عازلة الدقة العالية، و 200 ميكرومتر dNTPs، 1 ميكرومتر التضخيم التمهيدي، 20 U / مل عالية الدقة DNA البلمرة) والاستغناء عن 29 ميكرولتر لكل بئر في 96-جيدا PCR لوحة تعيين على الجليد. نقل 1 ميكرولتر من كل متحولة في مرحلة ثابتة في ACCM-2 إلى مزيج PCR.
- تشغيل PCR مع تمسخ الأولي (98 ° C، 1 دقيقة)، و 20 دورات عالية الصرامة (98 ° C، 10 ثانية و 50 درجة مئوية، و 30 ثانية و 72 درجة مئوية، 90 ثانية)، 30 دورات صرامة منخفضة (98 ° C، 10 ثانية و 30 درجة مئوية، و 30 ثانية و 72 درجة مئوية، 90 ثانية) و 30 دورات صرامة عالية (98 ° C، 10sec، 50 ° C، 30 ثانية؛ 72 ° C، 90 ثانية)، يليه ملحق النهائي في 72 ° C لمدة 7 دقائق.
- تنقية المنتجات PCR باستخدام حبات مغناطيسية وDNA التسلسل مع التمهيدي ينقول محددة. تصميم التمهيدي ينقول محددة مع درجة حرارة انصهار توقع تضم ما بين 50 درجة مئوية و 75 درجة مئوية، وهو محتوى GC بين 40٪ و 60٪، وطولها ما بين 18 و 25 النيوكليوتيدات والاشتراكية الصلبالشركة المصرية للاتصالات المصب الموقع التهجين التضخيم التمهيدي ولا يقل عن 100 قاعدة أزواج المنبع من الزوج قاعدة الأول من ITR ينقول.
- استخدام برامج تحليل تسلسل، تحميل كامل، الجينوم مشروحة الكوكسيلا البورنيتية 493 NMI. استخدام وظيفة "محاذاة إلى مرجعية" لتحميل ومواءمة (blastn) نتائج التسلسل وتحديد الموقع للتبديل. تجاهل المسوخ مع غير مطابقة و / أو عرض مزدوج reads.To مراقبة تشبع مكتبة متحولة، والحفاظ على سجل وقوع الإدراج ينقول متعددة في نفس الموقع.
3. خلايا حقيقية النواة التحدي مع الكوكسيلا المسوخ ورصد النمو بين الخلايا
ملاحظة: ينصح ماصة الأقنية للخطوات التالية. وأجريت العدوى في يثلث في العقيمة 96-جيدا microplates مع الجدران السوداء وأسفل شفافة مسطحة. البورنيتية بالوزن الكوكسيلا معربا عن GFP 14 ثعلى النحو المنصوص عليه من قبل الدكتور روبرت هاينزن.
- زراعة خلايا فيرو في RPMI دون الفينول الأحمر تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) في حالة عدم وجود المضادات الحيوية (أكمل RPMI وسائل الإعلام).
- قبل يوم واحد العدوى، وغسل خلايا فيرو من متموجة أو دون متموجة ثقافة الخلية قارورة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني.
- فصل خلايا فيرو عن طريق إضافة 1 مل من محلول التربسين EDTA إلى قارورة زراعة الخلايا واحتضان لمدة 3-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب 5٪ CO 2.
- خلايا resuspend في 10 مل من وسائل الاعلام RPMI كاملة. عدد الخلايا وإعداد تعليق خلية من 10 5 خلايا لكل مل.
- الاستغناء عن 100 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر من السود لوحة 96-جيدا مع أسفل شفافة مسطحة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 x ج في RT لتسهيل التصاق الخلايا في الجزء السفلي من الآبار واحتضان ليلا 37 درجة مئوية في جو مرطب 5٪ CO 2.
- ذوبان الجليد لوحات 96-جيدا تحتوي على الرئيسينالمسوخ xiella في RT وتمييع 150 ميكرولتر من تعليق البكتيرية في 300 ميكرولتر من RPMI دون الفينول الأحمر وFBS في بئر عميق لوحة 96-جيدا.
- إزالة وسائل الاعلام من صفيحة ميكروسكوبية تحتوي على خلايا فيرو والاستغناء عن 100 ميكرولتر / بئر المسوخ الكوكسيلا المخفف (MOI 100). استخدام A1 كذلك السالب (الخلايا غير المصابة) مراقبة والآبار A2 و A3 والضوابط الإيجابية (الخلايا المصابة مع بالوزن الكوكسيلا معربا عن GFP 14 في مولتيبليكيتييس من العدوى (وزارة الداخلية) 100 و 200).
- أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة 10 دقيقة في 400 x ج في RT باستخدام لوحة أجهزة الطرد المركزي حامل-الهباء الجوي ضيق.
- احتضان عند 37 درجة مئوية في جو مرطب من CO 2 5٪ لمدة 2 ساعة ثم استبدال البكتيريا التي تحتوي على المتوسطة مع 100 ميكرولتر / بئر جديدة، واستكمال المتوسطة RPMI.
- قياس GFP مضان كل يوم لمدة 7 أيام باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية مضان والمرشحات لموجات القياسية فلوريسئين (الإثارة ~ 480 نانومتر، والانبعاثات ~ 520 نانومتر). لتجنبالتدخل بسبب التكثيف وإشارة تشتت في مستنبت، استخدام الإثارة أسفل وتسجيل الانبعاثات على القارئ صفيحة ميكروسكوبية.
4. إعداد العينات الآلي لاكتساب صورة
ملاحظة: هذا الإجراء هو لأحد وحة 96-جيدا، رفع مستوى أحجام وفقا لذلك. خطوات من 4.2 قد الاستفادة من لوحة غسالة.
- على ال 7 العدوى بعد يوم، وإزالة المتوسطة من لوحة واستبدالها مع 50 ميكرولتر / بئر جديدة، المتوسطة كاملة تحتوي على خلية قابلة للاختراق صبغة الفلورسنت في التخفيف المناسب (عادة 1: 1000، إلى أن يكون الأمثل وفقا للخط الخلايا المستخدمة ). احتضان الخلايا لمدة 30 - 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب 5٪ CO 2.
- استبدال المتوسطة مع 50 ميكرولتر / بئر بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) ثم إزالة العازلة PFA التي تحتوي على ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- إزالة برنامج تلفزيوني وdispensه 50 ميكرولتر / بئر عرقلة الحل (0.5٪ ألبومين المصل البقري، 50 ملي NH 4 الكلورين في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4) تستكمل مع 0.05٪ سابونين. في احتضان RT لمدة 30 دقيقة.
- استبدال حل حجب مع 40 ميكرولتر / بئر عرقلة الحل جديدة تستكمل مع سابونين (كما سبق) ومع الأجسام المضادة لمكافحة LAMP1 في 1: 500 التخفيف. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في RT.
- إزالة عرقلة الحل وغسل لوحة 96-جيدا 5 مرات مع 100 ميكرولتر / جيد من برنامج تلفزيوني.
- الاستغناء عن 40 ميكرولتر / بئر عرقلة الحل تستكمل مع سابونين (كما سبق)، والأجسام المضادة الثانوية المناسبة fluorescently المسمى (في التخفيف من 1: 1000) للكشف عن الأجسام المضادة لمكافحة LAMP1 تطبيقها في خطوة 4.4، ومع هويشت 33258 في 5 ميكروغرام / مل. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في RT.
- إزالة عرقلة الحل وغسل لوحة 96-جيدا 5 مرات مع 100 ميكرولتر / جيد من برنامج تلفزيوني. ترك حجم PBS المقابلة لغسل الماضي في لوحة 96-جيدا، حيث أن الخلايا الثابتة يجب أن لا تجف.
- صورة لوحة فورا أو متجر لوحة في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء، لتحليلها لاحقا.
5. الحصول على الصور
- الحصول على صور في GFP (488 نانومتر، والبكتيريا)، هويشت 33258 (350 نانومتر، نواة الخلية المضيفة) والأحمر (~ 555 نانومتر، خلية غشاء علامة) والحمراء الأقصى (~ 615 نانومتر، LAMP1) قنوات باستخدام مجهر epifluorescence الآلي مجهزة مع الهدف 20X. الحصول على 21 حقول مستقلة لكل بئر من أجل صورة ما لا يقل عن 5000 خلية لكل عينة. تطبيق autofocusing باستخدام قناة نواة الخلية المضيفة كمرجع. عند العمل مع مسببات الأمراض البكتيرية التي تصيب نسبة منخفضة من خلايا المضيف، يمكن للمستخدمين ضبط عدد الحقول مستقلة تصوير لكل بئر، من أجل الحصول على ما لا يقل عن 500 الخلايا المصابة لتحليلها.
تجهيز 6. صورة
ملاحظة: الخطوات التالية هي محددة لاستخدام CellProfiler صورة برامج التحليل. في جميع الحالات، وalgorit الأمثليجب أن يعرف صاحب الجلالة للتجزئة تجريبيا وينبغي القضاء على الكائنات لمس الحدود للصورة مع وظيفة مناسبة.
- تحميل جميع الصور في CellProfiler.
- استخدام وحدة "ImageMath" لطرح قناة GFP من قناة هويشت، لتجنب الكشف عن المستعمرات الكوكسيلا (المسمى أيضا هويشت) كما نواة الخلية المضيفة في الخطوات التالية.
- استخدام وحدة "IdentifyPrimaryObjects" لنواة الخلية المضيفة جزء من الصورة الناتجة من الخطوة 6.2. تسمية الأشياء مجزأة "نوى".
- استخدام وحدة "IdentifySecondaryObjects" إلى الخلايا المضيفة جزء من 555 نانومتر الصور باستخدام نوى الكشف في خطوة 6.3 كما البذور. تسمية الأشياء مجزأة "خلايا".
- (اختياري) استخدام وحدة "IdentifyTertiaryObjects" لطرح النوى التي تم تحديدها في الخطوة 6.3 من الخلايا التي تم تحديدها في الخطوة 6.4. تسمية الأشياء مجزأة "السيتوبلازم221 ؛.
- استخدام وحدة "EnhanceOrSuppressFeatures" على 615 نانومتر الصور لإزالة الخلفية وتسهيل التعرف التالية حجرات-LAMP1 إيجابي.
- استخدام وحدة "IdentifyPrimaryObjects" على الصورة التي تم الحصول عليها في الخطوة 6.6 لتحديد مقصورات LAMP1 إيجابي. تسمية الأشياء مجزأة "الجسيمات الحالة".
- استخدام وحدة "IdentifyPrimaryObjects" على الصورة 488 نانومتر لتحديد المستعمرات الكوكسيلا. تسمية الأشياء مجزأة "المستعمرات".
- استخدام وحدة "IdentifySecondaryObjects" على 615 نانومتر الصور لتحديد الفجوات التي تحتوي على الكوكسيلا باستخدام المستعمرات الكوكسيلا الكشف في خطوة 6.8 كما البذور. تسمية الأشياء مجزأة "CCVs".
- استخدام وحدة "MaskObjects" لتحديد CCVs الكشف على الخلايا (كخلايا لمس الحدود من الصورة قد تم القضاء عليها، قد يتم الكشف عن بعض CCVs خلايا "الخارجية"). اسم الدقةulting الكائنات "CCVs تصفيتها".
- استخدام وحدة "MaskObjects" لتحديد المستعمرات الكشف على الخلايا (كخلايا لمس الحدود من الصورة قد تم القضاء عليها، قد يتم الكشف عن بعض المستعمرات خلايا "الخارجية"). اسم الناتجة الكائنات "المستعمرات التي تمت تصفيتها".
- استخدام وحدة "MaskObjects" لربط الجسيمات الحالة إلى الخلايا. اسم الناتجة الكائنات "المصفاة الجسيمات الحالة".
- استخدام وحدة "MaskObjects" لتحديد الخلايا التي تحتوي على المستعمرات الكوكسيلا. اسم الناتجة الكائنات "الخلايا المصابة".
- استخدام وحدة "ربط الكائنات" لتعيين الكائنات "CCVs المصفاة" كأبناء الكائنات الأم "خلايا". وهذا سوف يسمح إحصاء عدد CCVs / خلية.
- استخدام وحدة "ربط الكائنات" لتعيين الكائنات "المستعمرات التي تمت تصفيتها" كأبناء الكائنات الأم "خلايا". هذه الإرادةالسماح بإحصاء عدد المستعمرات / خلية.
- استخدام وحدة "ربط الكائنات" لتعيين الكائنات "المصفاة الجسيمات الحالة" كأبناء الكائنات الأم "خلايا". وهذا سوف يسمح حساب عدد الجسيمات الحالة / خلية.
- استخدام وحدة "MeasureObjectSizeShape" للحصول على التحليل الصرفي من الأنوية، خلايا، CCVs تصفيتها، المستعمرات التي تمت تصفيتها وتصفيتها الجسيمات الحالة
- استخدام وحدة "MeasureObjectIntensity" لقياس مضان GFP المرتبطة المصفاة CCVs وتقدير كفاءة الكوكسيلا تكرارها داخل CCVs.
- باستخدام وحدات "OverlayOutlines" و "SaveImages" تراكب نتائج تجزئة والصورة الأصلية لمراقبة الجودة.
- استخدام وحدة "ExportToSpreadsheet" لتصدير جميع أو مجموعة مختارة من نتائج تحليل الصور.
- (اختياري) استخدام وحدة "ExportToDatabase" لتحليل النتائجباستخدام محلل البرمجيات CellProfiler.
تحليل 7. البيانات
- لكل معلمة التي تم الحصول عليها، وتحديد وإزالة القيم المتطرفة (بسبب أخطاء في صورة تجزئة) ثم حساب متوسط القيم في متحولة.
- استخدام Z-درجات لتحديد الظواهر الهامة. النظر في الظواهر مع Z-درجة> -2 أنها غير مهمة، الظواهر مع Z-النتيجة بين -2 و -4 كما خفيفة والظواهر مع ≤ Z-درجة -4 قوي.
- مجموعات مؤامرة من المعلمات وفقا للاحتياجات التجريبية.
Representative Results
على عزل المسوخ ينقول، مستعمرة التمهيدي واحدة PCR هو القوي، طريقة الإنتاجية العالية لتحديد موقع ينقول الإدراج لكل متحولة. هذا النهج مستمد من بروتوكول PCR متداخلة نموذجية ولكن هنا التمهيدي واحد يهجن تحديدا و / أو غير تحديدا على الحمض النووي القالب اعتمادا على التشدد في درجة الحرارة الصلب (الشكل 1A). تتكون المنتجات PCR نموذجية من شظايا متعددة DNA، وهي في معظمها محددة (الشكل 1B). استخدام التمهيدي التسلسل المختلفة التي anneals الحق المنبع من ITR ينقول، والمصب من تسلسل المعترف بها من قبل التمهيدي التضخيم يوفر خصوصية للخطوة التسلسل (الشكل 1C). برامج الحاسوب الآلي لتحليل تسلسل محاذاة تسلسل الحصول على الجينوم الكوكسيلا تقديم الموقع الدقيق للالإدراج ينقول (الشكل 1C). ويمكن لجميع الملاحق ينقول عندئذ آنotated على الجينوم الكوكسيلا (1D الشكل).
يتم عزل كل متحولة الكوكسيلا وتضخيم axenically في ACCM-2 متوسطة قبل إما تخزين أو فحص الشكل 2 يوضح مثال 38 المسوخ ينقول في 16 نقطة / ICM الجينات الكوكسيلا (الشكل 2A). لتقييم الجدوى من المسوخ الكوكسيلا، ويتم الحصول على منحنيات النمو ممحوضة عن طريق أخذ عينات الثقافات البكتيرية لمدة 7 أيام بعد التلقيح وتطبيق فحص تركيز البكتيريا وصفها في 1.5 (Figurie 2B). ثم يتم تحضين المسوخ تضخيم مع الخلايا الظهارية، في ثلاث نسخ لوحات 96-جيدا لمدة 7 أيام. كل المسوخ الكوكسيلا ولدت يجري الموسومة GFP، ويتم الحصول على منحنيات النمو داخل الخلايا عن طريق قياس كثافة GFP مضان من كل جانب، كل 24 ساعة، والتآمر القيم المقاسة بوصفها وظيفة من الزمن (الشكل 2C).
INTRتوفر منحنيات النمو ديكي التحليل الكمي من الظواهر المرتبطة مع كل الإدراج ينقول في الجينوم الكوكسيلا. لإضافة معلومات نوعية حول نفس المسوخ ينقول، اخترنا لاكتساب صورة الآلي والتحليل. سبعة أيام إصابة آخر، يتم إصلاحها لوحات، والمجهزة للالمناعي كما هو موضح في 4 و تحليلها باستخدام الآلي، المجهر epifluorescence كما هو موضح في الصورة 5. الآلي برامج التحليل مثل CellProfiler (معهد برود، www.cellprofiler.com ) بمعالجة قنوات المكتسبة بشكل مستقل والقطاعات التي تم تحديدها الأجسام للتحليل المقارن (الشكل 3). وهذا يسمح للتحديد وتوصيف الصرفي من نوى الخلايا المضيفة، ملامح الخلية، الجسيمات الحالة والمستعمرات الكوكسيلا (الشكل 3 العليا لوحات). ربط المستعمرات الكوكسيلا مع الخلايا والجسيمات الحالة يسمح للidentificatiعلى والتحليل الصرفي محدد من الكوكسيلا الفجوات التي تحتوي (والتي هي LAMP1 إيجابي، الشكل 3 اللوحة اليسرى السفلى). ربط المستعمرات الكوكسيلا مع ملامح الخلية المضيفة يسمح للتحديد وتحليل الصرفي محدد من الخلايا المصابة (الشكل 3 أسفل لوحة في الوسط). وأخيرا، يتم دمج 4 قنوات من أجل التوضيح وأغراض مراقبة الجودة (الشكل 3 اللوحة اليمنى السفلى).
البيانات التي تم الحصول عليها من تحليل الصور الآلي يمكن رسم ضد بعضها البعض للحصول على "المؤامرات مبعثر متعددة المظهرية". على سبيل المثال، في الشكل 4A متوسط مساحة (في ميكرون 2) من المستعمرات الكوكسيلا المرسومة ضد عدد من المستعمرات في كل خلية (الشكل 4A)، من أجل تحديد الطفرات التي تؤثر على تكرار الخلايا من الكوكسيلا (تكرار النمط الظاهري) و / أو قدرة البكتيريا على غزو الخلايا المضيفة (الغائرlization النمط الظاهري). تم استخدام التحليل الإحصائي لتحديد المناطق في الناتج مؤامرة مبعثر الموافق خفيفة (-4 <Z-درجة ≤ -2) والشديدة (Z-درجة ≤ -4) الظواهر. وقد لوحظت المسوخ في 3 مجموعات رئيسية: تم تجميع الطفرات التي أسفرت عن نمو الخلايا عيب من الكوكسيلا في اليسرى معظم جزء من مؤامرة (الشكل 4A، والوردي والنقاط الحمراء)؛ تم تجميع الطفرات التي تؤثر على استيعاب الكوكسيلا في الخلايا في الجزء السفلي من مؤامرة (الشكل 4A، وعلى ضوء الأزرق الداكن نقاط) وأخيرا، النقاط الخضراء في أقصى اليمين المنطقة من مؤامرة تتوافق مع الطفرات الناتجة في الظواهر غير هامة ( Z-درجة> -2). الأهم من ذلك، المسوخ التي تفشل في تكرار لكنها لا تزال قادرة على غزو الخلايا المضيفة، يتم الكشف بعد 7 أيام من العدوى عن البكتيريا واحدة، أو مستعمرات صغيرة، المجاورة لاستضافة نواة الخلية (الشكل 4C، الفريق الثاني). وبالتالي، فإن حجم الكوكسيلا "كولوالاقتصادات الحديثة التصنيع "ستتأثر بشكل كبير إلا أن عدد الخلايا المصابة لا تختلف بالمقارنة مع خلايا -infected WT الكوكسيلا. على العكس من ذلك، والطفرات التي تؤثر على قدرة الكوكسيلا لغزو الخلايا المضيفة تؤدي إلى انخفاض في عدد المستعمرات / خلية. عندما يكون هذا الرقم هو أقل بكثير من 1، فإنه يشير إلى أنه، في المتوسط، هناك انخفاض في العدد الكلي للخلايا المصابة. بدلا من ذلك، كان متوسط مساحة (في ميكرون 2) من المستعمرات الكوكسيلا يمكن رسم على عدد من الخلايا المضيفة على قيد الحياة العدوى (الشكل 4B)، لتحديد الطفرات التي تضفي السمية الخلوية لالكوكسيلا (النمط الظاهري السامة للخلايا). على النحو الوارد أعلاه، تم استخدام التحليل الإحصائي لتحديد المناطق في الناتج مؤامرة مبعثر الموافق خفيفة (-4 <Z-درجة ≤ -2) والشديدة (Z-درجة ≤ -4) الظواهر. الأكثر عرضه لم الطفرات لا تؤثر تأثيرا كبيرا على بقاء الخلية، بغض النظر عن تكرار البكتيريا داخل المضيفالخلايا (الشكل 3B النقاط الخضراء). وكانت 37 الطفرات بقاء الخلية المضيفة المتضررين بشكل معتدل (الشكل 3B، النقط الحمراء الخفيفة)، و 7 الطفرات الضارة لا سيما لاستضافة بقاء الخلية (الشكل 3B، بقع حمراء داكنة). يرجى ملاحظة أن المعلمات الإضافية التي حصلت عليها صورة إجراء التحليل الآلي يمكن استخدامها لاستخلاص المخططات الأخرى، وفقا لاحتياجات التجريبية.
يستخدم تسلسل والشرح من الكوكسيلا المسوخ ينقول (A) التمهيدي واحدة مستعمرة PCR لتضخيم شظايا الحمض النووي الذي يحتوي على موقع ينقول الإدراج: الرقم 1. يتم استخدام التمهيدي التضخيم (الأمبير) على حد سواء باعتبارها التمهيدي محدد وغير محدد اعتمادا على التشدد في درجة الحرارة الصلب. (B) نتيجة النموذجية للمستعمرة واحدة التمهيدي PCR. كل reactiعلى تنتج عددا من شظايا من حجم متغير، وبعضها يحتوي الموقع ينقول الإدراج. البعض الآخر وتتضخم بشكل عشوائي بوصفه من المنتجات من انخفاض صرامة PCR دورة. (C) استخدام التمهيدي تسلسل (تسلسل) أن يهجن لتسلسل ينقول يسمح تسلسل شظايا من الفائدة. برنامج (D) تحليل تسلسل يسمح الشرح التلقائي الإدراج ينقول على جينوم بكتيري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ممحوضة والنمو داخل الخلايا الكوكسيلا المسوخ ينقول (A) في شاشة الطيار، لقد عزل، التسلسل وفحص 38 المسوخ ينقول في الأساسية 16 زأنيس للنظام إفراز نقطة / ICM الكوكسيلا (أشار باللون الأحمر). (B) من أجل تقييم جدوى كل متحولة ينقول، ونمو كل عزل في ممحوضة مستنبت يتم رصد أكثر من 8 أيام باستخدام الموسومة fluorescently وكيل الإقحام DNA. يستخدم بعد ذلك (C) كل متحولة لتصيب الخلايا الظهارية. كما ينقول يمتلك الكاسيت GFP، ويتم رصد نمو البكتيريا داخل الخلايا خلال 7 أيام من العدوى عن طريق اتباع أشكال مختلفة من مضان GFP المرتبطة الكوكسيلا النسخ المتماثل باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: الآلي تحليل الصور من التهابات الكوكسيلا لصناعة السيارات.ويستخدم المجهر epifluorescence تزاوج إلى صورة 21 مناصب لكل بئر من ثلاث نسخ لوحات 96-جيدا. شرائح برمجيات تحليل الصور الكائنات في كل القنوات المكتسبة للالكمي والتحليل. في جميع الحالات، يتم استبعاد الأشياء لمس الحدود من الصور. (A) ويستخدم قناة هويشت لتحديد نواة الخلية المضيفة (دائري باللون الأخضر). (B) وتستخدم هذه البذور لتحديد ملامح الخلية المضيفة في القناة CY3 (وحلقت موقف نوى في الزرقاء، ملامح الخلية هي باللون الأخضر). (C) ويستخدم قناة Cy5 لتحديد مقصورات LAMP1 الإيجابي (دائري باللون الأخضر)؛ فقط يتم الاحتفاظ الكائنات المدرجة في محيط الخلية التي تم تحديدها سابقا (باللون الأحمر) لتحليل الصور. يستخدم (D) القناة GFP لتحديد المستعمرات الكوكسيلا (دائري باللون الأخضر). (E) ربط المستعمرات الكوكسيلا مع مقصورات LAMP1 إيجابي يسمح بتحديد الكوكسيلا (F) ربط المستعمرات الكوكسيلا مع ملامح خلية يسمح بتحديد الخلايا المصابة (pseudocolored). (G) الصور المكتسبة في القنوات مضان 4 (الموافق المستعمرات الكوكسيلا (الأخضر)، ونواة الخلية المضيفة (الأزرق)، وغشاء الخلية المضيفة البلازما (الرمادي)، مقصورات LAMP1 إيجابي (الحمراء)) تم دمجها واستخدامها من أجل التوضيح والجودة التحكم. على نطاق ويمنع 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: تحديد نطاق واسع من العوامل الكوكسيلا تشارك في المضيف / تتفاعل العوامل المسببة للأمراضالأيونات. (A) منطقة المتوسط (في ميكرون 2) من المستعمرات الكوكسيلا يتم رسم مقابل العدد النسبي للمستعمرات في كل خلية، لتحديد التكرار واستيعاب الظواهر المثيرة للاهتمام. وتمثل النقاط الخضراء الظواهر التي تحيد عن WT الكوكسيلا من Z-درجة> -2 (لا كبيرة). الوردي والأزرق الفاتح النقاط تمثل تكرار واستيعاب الظواهر على التوالي، مع Z-النتيجة بين -2 و -4 (الظواهر خفيفة). الأحمر والأزرق الداكن النقاط تمثل الظواهر مع ≤ Z-درجة -4 (الظواهر قوية). وقد تآمر (B) ومتوسط مساحة (في ميكرون 2) من المستعمرات الكوكسيلا ضد العدد الكلي للخلايا (المصابين وغير المصابين) التي نجت 7 أيام من العدوى لتقدير تأثير السامة للخلايا الناتجة من عمليات الإدراج ينقول. وتمثل النقاط الخضراء الظواهر التي تحيد عن WT الكوكسيلا من Z-درجة> -2 (لا كبيرة). النقاط الوردية تمثل السامة للخلايا فتاهenotypes مع Z-النتيجة بين -2 و -4 (الظواهر خفيفة). وتمثل النقاط الحمراء الظواهر السامة للخلايا مع ≤ Z-درجة -4 (الظواهر قوية). السهام تشير المسوخ يتضح من حرف صغير المقابلة في C. (C) صور الممثل النسخ المتماثل، واستيعاب والظواهر السامة للخلايا. في جميع الحالات، نواة الخلية المضيفة باللون الأحمر، المستعمرات الكوكسيلا هي باللون الأخضر. على نطاق ويمنع 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وقد أثبتت دراسة التفاعلات المضيف / الممرض أن تكون طريقة رائعة لفهم الالتهابات البكتيرية ووضع استراتيجيات بديلة لمواجهة الأمراض المعدية. ولكن نظرا لتنوع الاستراتيجيات التي وضعتها مسببات الأمراض البكتيرية المختلفة، وتحديد وتوصيف عوامل الفوعة البكتيرية وللمضيف مسارات الإشارات التي تستهدف خلال العدوى تمثل تحديا حقيقيا. هذا يدعو إلى تطوير أساليب جديدة لتحديد نطاق واسع من المحاور الرئيسية تفاعل المضيف / الممرض. التطورات الأخيرة في المبتكرة، عالية الإنتاجية وتقنيات فحص عالية المحتوى تمثل مصدرا قيما التي يمكن تكييفها لدراسة مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا 15. هنا، وقد استخدمنا الحيوانية البكتيرية الممرضة الكوكسيلا البورنيتية كنموذج لوضع نهج الفحص التي تجمع بين الطفرات ينقول والمقايسات القائم على مضان. الاهميهTLY، وهذا الأسلوب يسمح فحص رصد في وقت واحد من خطوات متعددة من دورة الخلايا الكوكسيلا، وتوفير نظرة شاملة للاستراتيجيات التي وضعتها هذه البكتيريا لغزو وتكرارها وتستمر داخل الخلايا المصابة.
ويستند هذا النهج المبين هنا على اثنين من تقنيات راسخة، الطفرات ينقول والمقايسات القائم على مضان، والتي تم تطبيقها بنجاح في دراسة مسببات الأمراض البكتيرية. الجمع بين هذه التقنيات في سياق شاشات عالية الإنتاجية / عالية المحتوى يسمح لنا لتقييم الآثار المترتبة على عدد كبير من الطفرات البكتيرية عن طريق تحليل عدد كبير جدا من الأحداث (عادة 15000 الخلايا المصابة في الطفرات البكتيرية يتم تصويرها وتحليلها). وهذا يوفر تحليلا إحصائيا مهما من أحداث مثل الغزو الجرثومي للخلايا المضيفة وتكرار داخل الخلايا، والتي هي، بطبيعتها، تخضع لتقلبات عالية. من المهم أن نلاحظ أن خطوط الخلايا الأخرى من الجيش الشعبيithelial يمكن استخدامها لهذا النوع من الفحص. ومع ذلك، الخلايا الظهارية مسطحة وكبيرة هي الأمثل لتحليل الصور كما عضيات الخلية المضيفة هي أسهل للكشف. لأن الغالبية العظمى من المجاهر الآلي يمكن التعامل تلقائيا عدد كبير من لوحات، وتكاد لا توجد أية حدود لعدد من المسوخ التي يمكن فرزهم في وقت واحد. اعتمادا على العوامل المسببة للأمراض، يمكن للمستخدم امتياز استخدام وسيلة epifluorescence أو المجهر متحد البؤر. ووقت الحصول على الصور تعتمد في الغالب على حساسية الكاميرا المجهر، على عدد من المجالات المكتسبة لكل بئر وعلى عدد من القنوات المكتسبة في مجال الرؤية. يمكن للمستخدم أن تقرر كيفية ضبط هذه العوامل لتحسين بروتوكول الفرز. وكمثال على ذلك، ونحن تصوير واحدة 96-جيدا لوحة / ساعة باستخدام الظروف المشار إليها في النقطة 5.1. تحليل الصور يعتمد إلى حد كبير على الجهاز (أو مجموعة من الآلات) المستخدمة. نستخدم النواة 12 (2 × 3.06 جيجاهرتز 6 النواة)، 48 GB RAM محطة العمل. هذا الجهاز يتطلب يقاربالمطاف 40 دقيقة لتحليل الصور تم الحصول عليها من لوحة واحدة.
أحد الجوانب الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار عند وضع هذه المقايسات هو مجموعة تتكون من جديد (أو الاستفادة المثلى من القائمة) بروتوكولات للسماح للتلاعب وتجهيز عدد كبير من العينات. والمثال النموذجي هو تطوير مستعمرة التمهيدي PCR نهج واحد، الأمر الذي سمح لنا لتضخيم بسرعة وشظايا تسلسل الكوكسيلا DNA يحتوي على موقع الإدراج كل ينقول، من عينات صغيرة جدا. بناء على خبرتنا، والبلمرة عالية الدقة لابد من اختيارها بعناية واختبارها من أجل الحصول على نتائج يمكن استنساخه. والقيد الوحيد من هذا النهج قد يخفي في مراقبة ذلك، في معظم الحالات، حوالي 30٪ من العينات المصنعة ليست عرضة للاستغلال، إما بسبب PCR أو الخطوات التسلسل. ومع ذلك، معتبرا أن عزل الجديدة المسوخ ينقول الكوكسيلا ليس الحد من معدل خطوة، وهذا لا ممثلى أعضاءأرسلت قضية رئيسية. وبالمثل، فإن تطوير مقايسة موثوقة لقياس تركيز البكتيريا الأسهم متحولة الرئيسي لهذا النهج. نظرا لميل الكوكسيلا لتجميع عندما تكون في تعليق، واستخدام قراءات الكثافة الضوئية لا ينطبق على حساب تركيز الثقافات الكوكسيلا والبديل موجود الوحيد كان الكمي PCR (QPCR). هنا، استخدام DNA وكيل الإقحام الموسومة fluorescently تسريع بشكل ملحوظ البكتيريا الكميات.
وهذا النهج يمكن أيضا الاستفادة من استخدام خطوط الخلايا مستقرة التعبير عن علامات الفلورسنت لعدة حجرات داخل الخلايا اعتمادا على العوامل المسببة للأمراض المستخدمة. جانب مهم آخر هو استخدام وسائل الإعلام ثقافة الخلية خالية من الفينول الأحمر. لاحظنا أن هذا مؤشر الرقم الهيدروجيني له مضان الطبيعي الذي يمتد الطيف الأحمر والأخضر الذي يشبع الإشارات المسجلة على القارئ مضان الآلي.
تيانه الاستراتيجية المقدمة هنا تعتمد على العشوائية ينقول الطفرات. لطفرات من الفائدة، نوصي التحقق من صحة التبديلات فريدة من نوعها (وقابلية التنسيل) باستخدام صمة عار الجنوبية والتكبير PCR للموقع ينقول الإدراج.
إلى جانب معدات الموضحة في قسم البروتوكول، فرق الراغبة في استخدام نهج فحص المعروضة هنا، سوف تأخذ ميزة كبيرة في مجموعة تتكون من قاعدة بيانات علائقية لجمع البيانات، الخادم لتخزين البيانات ومحطة عمل لتحليل الصور السريع.
الأهم من ذلك، وفرت طريقة الموصوفة هنا هي مناسبة لدراسة مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا الأخرى وجود أسلوب الطفرات العشوائية لمسببات المرض، خطوط الخلايا يمكن أن يصاب من قبل الممرض وهذا واحد يعرض النمط الظاهري محددة خلال العدوى.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Citric acid | Sigma | C0759-500G | ACCM-2 medium component |
| Sodium citrate | Sigma | S4641-500G | ACCM-2 medium component |
| Potassium phosphate | Sigma | 60218-100G | ACCM-2 medium component |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670-100G | ACCM-2 medium component |
| Calcium chloride | Sigma | C5080-500G | ACCM-2 medium component |
| Iron sulfate | Sigma | F8633-250G | ACCM-2 medium component |
| Sodium chloride | Sigma | S9625-500G | ACCM-2 medium component |
| L-cysteine | Sigma | C6852-25G | ACCM-2 medium component |
| Bacto Neopeptone | BD (Beckton-Dickinson) | 211681 | ACCM-2 medium component |
| Casamino acids | BD (Beckton-Dickinson) | 223050 | ACCM-2 medium component |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma | C4555-10G | ACCM-2 medium component |
| RPMI w/glutamax | Gibco | 61870-010 | ACCM-2 medium component |
| RPMI w/glutamax, without phenol red | Gibco | 32404-014 | For cell culture and infection |
| Fetal bovine serum | GE healthcare | SH30071 | For cell culture |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | For cell culture |
| Saponin | Sigma | 47036 | For immunofluorescence staining |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | For immunofluorescence staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | For immunofluorescence staining |
| Electroporation cuvette 0.1 cm | Eurogentec | ce0001-50 | For Coxiella transformation |
| Trackmates screw top tubes with caps | Thermo Scientific | 3741 | 2D barcoded screwcap |
| 96-well microplate with black walls and bottom | Greiner | 655076 | Flat dark bottom, for dsDNA quantitation |
| 96-well PCR microplate | Biorad | 2239441 | DNAse/RNAse free |
| 96-well plate, deepwell | Labcon | 949481 | For Coxiella mutants infections |
| PicoGreen | Life Technologies | P7581 | For dsDNA quantitation |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | For dsDNA quantitation |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | For single primer colony PCR |
| Celltracker Red CMTPX | Life Technologies | C34552 | For imaging |
| Anti-LAMP1 antibody | Sigma | 94403-1ML | For immunofluorescence staining |
| Hoechst 33258 | Sigma | L1418 | For imaging |
| Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro | Tecan | ||
| Epifluorescence automated microscope Cellomics | Thermo Scientific |
References
- Maurin, M., Raoult, D. Q fever. Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).
- Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States. Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).
- Kazar, J. Coxiella burnetii. infection. Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).
- Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).
- Der Hoek, W. V. an, et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).
- Capo, C., et al. Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3. Journal of immunology. 163 (11), Baltimore, Md. 6078-6085 (1999).
- Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Berón, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell. Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Newton, H. J., Mcdonough, J. a, Roy, C. R. Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole. PloS one. 8 (1), e54566 (2013).
- Vogel, J. P. Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii. Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).
- Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii. Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).
- Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. mBio. 2, (2011).
- Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium. Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).
- Beare, P. a, Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).
- Brodin, P., Christophe, T. High-content screening in infectious diseases. Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).
