Summary
Coxiella burnetii это облигатные внутриклеточные грамотрицательные бактерии ответственны за зоонозных заболеваний лихорадкой Ку. Здесь мы опишем методы генерации Coxiella люминесцентные транспозонов мутантов, а также автоматической идентификации и анализа полученных интернализации, репликации и цитотоксических фенотипов.
Abstract
Вторжение и колонизации клеток-хозяев бактериальными патогенами зависит от активности большого числа прокариотических белков, определяемой как факторов вирулентности, которые могут подорвать и манипулировать ключевые функции хоста. Изучение хост / патогена взаимодействия Поэтому крайне важно, чтобы понять, бактериальных инфекций и развивать альтернативные стратегии по борьбе с инфекционными заболеваниями. Этот подход, однако, требует разработки новых высокопроизводительных анализов для объективной, автоматизированной идентификации и характеризации бактериальных вирулентных детерминант. Здесь мы опишем метод для генерации GFP-тегами мутанта библиотеке транспозонов мутагенеза и развитие высокого содержания скрининга подходит для одновременного выявления нескольких транспозонов связанный фенотипов. Наша рабочая модель внутриклеточной бактериальный возбудитель Coxiella burnetii, этиологический агент зоонозов лихорадки Ку, который связан с SEВере вспышек с последующим здоровья и экономического бремени. Облигатные внутриклеточные природа этого патогена не имеет, до недавнего времени, сильно затруднено выявление бактериальных факторов, участвующих в хост патогена взаимодействия, изготовление Coxiella идеальную модель для реализации подходов с высокой пропускной / высоких контента.
Introduction
Emerging, эндемичных бактерия Coxiella burnetii несет ответственность за крупных вспышек лихорадки Ку, изнурительной гриппа, как зоонозов с тяжелой здоровья и экономического влияния 1. Основные резервуары Coxiella являются отечественные и животные, и, по оценкам, более 90% молочного скота в США несут С. burnetii 2. Люди случайные хозяева, которые заражены при вдыхании загрязненной аэрозолей. Человек лихорадка Ку проявляется либо в виде острого или хронического заболевания, которое может иметь фатальные осложнения с уровнем смертности достигает 65% 1,3. С инфекционного дозе 1 - 10 организмов, Coxiella наиболее инфекционного патогена известны и он был исследован в качестве потенциального биологического оружия 4. Недавнее взрывное вспышка лихорадки Ку в Нидерландах (2007 - 2010), с случаев эскалации от 182 до более чем 2000 год, стоит в качестве примера серьезного вирулентности патогена5.
Примечательно, эффективность Coxiella инфекций, скорее всего, связано с его устойчивостью к экологическому стрессу, в сочетании с уникальной адаптации для размещения клеток. Действительно, Coxiella присутствует в окружающей среде в виде неактивных метаболически небольших вариантов клеток (SCV), которые удивительно устойчивы к нескольким суровых условиях (высыхания, температура и т.д.). КСМ которые принимаются до фагоцитирующих клеток с помощью α V β 3 интегринов 6, а вторжение без фагоцитирующих клеток при посредничестве Coxiella адгезии / инвазии OmpA 7 и еще неизвестному рецептора. После поглощения, Coxiella проживает в облегающие вакуолей, положительных на ранних маркеров эндосомных Rab5 и EEA1 8. Бактерии реагируют на подкисление эндосомный путем преобразования в метаболически активных крупных вариантов клеток (легких коммерческих автомобилей) и активации типа 4 системы секреции точка / ICM (T4SS) 9Высоко гомологичны, что легионелл 10. Секреция точка / ICM эффекторов позволяют Coxiella генерировать большой, ЛАМПА1-положительных кислой отсек, содержащий активные лизосомальные ферменты, где бактерии могут процветать и активно защищают инфицированные клетки от апоптоза 11. Следовательно, внутриклеточный цикл Coxiella контролируется Точка / ICM-опосредованной транслокации бактерий эффекторов 12, однако, микробные факторы, участвующие в инвазии клеток хозяина, бактериальной репликации и распространения инфекции остаются в значительной степени неизвестными.
Сочетание транспозонов мутагенеза и флуоресценции на основе анализов, мы разрабатываем беспристрастные подходы для одновременной идентификации бактериальных факторов, участвующих в основных шагов Coxiella инфекций: 1) интернационализация в клетках-хозяевах, 2) внутриклеточный репликации, 3) спред от клетки к клетке и 4) сохранение. На сегодняшний день, мы скрининг более 1000 мutations в 500 кодирующих последовательностей Coxiella, которые предоставили нам беспрецедентные идеи в хозяин-патоген взаимодействий, которые регулируют Coxiella патогенеза 7. Следует отметить, что этот подход может быть применен к изучению других внутриклеточных патогенов, которые разделяют особенности клеточной биологии с Coxiella.
Protocol
1. Генерация библиотеки GFP-тегами Coxiella транспозонов мутантов
Манипулирование Coxiella burnetii RSA439 NMII в защитной биобезопасности уровня 2 (BSL-2) в микробной безопасности кабинета (MSC) в соответствии с местными правилами. Если совместимы с бактериальной модели, используемой, повторите шаги с 1.4.1 до 1.4.4, чтобы увеличить вероятность получения клоновых мутантов. Типичный мутант библиотека состоит (по крайней мере) из ряда мутантов, которая равна утроенной числа кодирующих последовательностей аннотированные в геноме организма, используемой.
- Подготовка электрокомпетентные Coxiella RSA439 NMII:
- Приготовьте 1х ACCM-2 13: 13.4 мМ лимонной кислоты, 16,1 мМ цитрат натрия, 3,67 мМ фосфат калия, 1 мМ хлорид магния, 0,02 мМ хлорида кальция, 0,01 мМ сульфата железа, 125,4 мМ хлорида натрия, 1,5 мМ L-цистеин, 0,1 г / л Бакто Neopeptone, 2,5 г / л казаминокислот, 1 г / л метил бета циклодекстрина, 125 мл / л среды RPMI, Отрегулируйте рН до 4,75 и фильтра стерилизуют (не автоклав). Примечание: Жидкость ACCM-2 является стабильным при 4 ° С в течение приблизительно 1 месяца.
- Инокуляции 100 мл ACCM-2 с 2 х 10 6 генома эквивалента (GE) / мл Coxiella RSA439 NMII (из бактериального наличии ранее сгенерированного и количественно, как в шаге 1.5) от -80 ° C запасов и распространять бактериальной суспензии в 75 см 2 клеточные культуры колбы с вентилируемыми колпачками (10 - 15 мл бактериальной суспензии в колбе). Расти в течение 7 дней при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 и 2,5% O 2.
- Бассейн в результате бактериальной суспензии в 50 мл пробирки и центрифуги при 3900 мкг в течение 1 ч при 4 ° С.
- Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 30 мл 10% глицерина. Центрифуга на 3900 мкг в течение 1 ч при 4 ° С.
- Ресуспендируют осадок в адекватной объему 10% глицерина (обычно 2 мл) и аликвоты по 50 мкл в 500 мкл трубки. Держите ресуспендировали бacteria на льду в течение всего процесса. Примечание: На этом этапе, бактерии Электрокомпетентные и одну аликвоту достаточно для выполнения одной электропорации. Бактериальные суспензии можно хранить при -80 ° С в течение 6 месяцев, или непосредственно использовали для электропорации ДНК плазмиды.
- Электропорация компетентным Coxiella с transposon- и транспозазы-кодирования плазмид:
Примечание: для следующего протокола, мобильных элементов и транспозаза кодируются с помощью двух различных плазмид (питри-CAT-GFP и pUC19-Himar1C9, соответственно) 7. Обе плазмиды хватает Coxiella конкретных репликации, что делает их самоубийства плазмиды, когда электропорации в Coxiella. Это гарантирует стабильные транспозона вставки. Транспозонов элемент содержит кассету сопротивления хлорамфеникол под регулирования промоутер p1169 Coxiella для отбора и гена GFP под регулирования Coxiella промоутер P311 помечать сгенерированные мутантов с GFP.- Прэлектронной охлаждения 0,1 см кювету для электропорации в течение 10 мин на льду. Смешайте 50 мкл электрокомпетентные Coxiella с 10 мкг плазмиды транспозонов и 10 мкг плазмиды транспозазы 7. Убедитесь, что концентрация плазмида выше, чем 500 мкг / мл, чтобы свести к минимуму разбавление глицерина.
- Электропорации, используя следующие настройки: 18 кВ, 500 Ω, 25 мкФ. Убедитесь, что в результате постоянной времени составляет от 9 до 13 мс.
- Сразу добавить 950 мкл RPMI, ресуспендируйте электропорации бактерии и передать на винт крышки трубки и держать при комнатной температуре.
- Возьмем 200 мкл электропорации бактерий и добавить 3 мл ACCM-2, дополненной 1% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) в 6-луночных планшетах. Добавить 88 мкл ДМСО для остального объема электропорации бактерий (до конечной концентрации 10% ДМСО) и хранить при температуре -80 ° С.
- Выбор транспозонов мутантов:
- IncubaTE 6-луночные планшеты в инокулируют, как описано выше (1.2.4) в течение ночи при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% CO 2 и 2,5% O 2. Добавить соответствующие антибиотики (375 мкг / мл канамицина или 3 мкг / мл хлорамфеникола). Инкубируйте бактериальной культуры в течение 3 дополнительных дней в условиях, описанных выше.
- Выделение отдельных мутантов:
- Подготовка твердых ACCM-2 пластин и обшивка Coxiella транспозонов мутантов
Примечание: Инструкции Ниже приведены за 1 чашке Петри, несколько разведения бактериальных культур должны быть проверены, чтобы оценить оптимальный объем прививка для изоляции колоний.- Нагрейте 10,5 мл 0,5% агарозы в микроволновой печи и дайте ему остыть в водяной бане при 55 °. Тепло 11,25 мл 2Х ACCM-2 (рН 4,75) при 37 ° С.
- Подготовьте нижний агарозы:
- Смешайте 10 мл расплавленного 0,5% агарозном с 10 мл 2 раза ACCM-2 и добавить соответствующие антибиотики (375 мкг / мл канамицина или 3мкг / мл хлорамфеникола).
- Налейте непосредственно в чашке Петри. Держите блюдо Петри unlidded, пусть средний остыть в течение 30 мин и воздушно-сухой в течение 20 мин.
- Подготовьте верхнюю агарозы:
- Смешайте 1,25 мл 2x ACCM-2 с 0,75 мл воды в 5 мл полистирола трубки, добавить соответствующие антибиотики (375 мкг / мл канамицина или 3 мкг / мл хлорамфеникола) и инкубировали при 37 ° С.
- Добавить бактериальной культуры (обычно от 1 до 100 мкл) и вихрь в течение 5 сек.
- Добавить 0,5 мл расплавленной агарозы, перемешать и сразу же разлить по нижней агарозы.
- Дают остыть в течение 20 мин, закрыть крышкой на чашке Петри и инкубируют при 4 ° С в течение 20 мин, чтобы облегчить агарозном затвердевание.
- Воздух сухой в течение 20 мин unlidded в MSC. Выращивают пластин при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 и 2,5% O 2 от 6 до 7 дней.
- Добавить ДМСО остальных бактерийл культуры, чтобы достичь конечной концентрации 10% ДМСО и хранить при -80 ° С.
- Определения оптимальной разбавление следующим образом: гарантировать, что колонии от 0,5 до 1 мм в диаметре, и должным образом изолированы, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Оттепель остальные бактериальные культуры из точки 1.4.2 и пластины на соответствующем разведении на ACCM-2 агар, как описано в 1.4.1.2, 1.4.1.3 и. Инкубировать в течение от 6 до 7 дней, как описано в 1.4.1.3.5.
- После колонии могут быть обнаружены, собрать их разрезанием конец 1 мл наконечником, выбирая вилку, содержащий изолированные колонии и диспергирующие колонию с помощью пипетки в 1,5 мл ACCM-2, содержащей соответствующие антибиотики (375 мкг / мл канамицина или 3 мкг / мл хлорамфеникола) в 24-луночного планшета. Amplify отдельных колоний в течение 6 дней в условиях, описанных в 1.3.1. На 3-й день инкубации, разогнать бактериальные скопления с помощью пипетки каждой культуры.
- Хранить каждый мутант суспензии в 2D штрих-кодом завинчивающейся крышкой труб в 96-луночных планшетах в 10% ДМСО при -80 ° С.
- Подготовка твердых ACCM-2 пластин и обшивка Coxiella транспозонов мутантов
- Оценка концентрации бактерий:
Примечание: следующий протокол может быть применен, чтобы получить кривые роста бактериальных мутантов реплицироваться в аксенными среды (см 1.4.4).- Стандартный подготовка кривая:
- Приготовьте 2 мкг / мл исходного раствора двухцепочечной ДНК (обычно случайное плазмиду известного размера и концентрации) в 1x Трис-ЭДТА (ТЭ). Готовят 10-кратным серийных разведений из исходного раствора с получением концентраций от 2 мкг / мл до 2 нг / мл. Разлить по 50 мкл каждой концентрации в отдельных лунках 96-луночного микропланшета с черными стенками и дном (табл материалов).
- Развести дцДНК количественный Реагент 1: 200 в 1x ТЕ-буфера и добавить 55 мкл разбавленного реагента к каждому образцу в микропланшете 96-луночного. Хорошо перемешать, используя планшетный шейкер и инкубировать в течение от 2 до 5 мин при комнатной температуре, в темноте.
- Измерение флуоресценции образцов с использованием флуоресцирующихсть микропланшет читатель и фильтры для стандартных длин волн флуоресцеина (возбуждения ~ 480 нм, эмиссия ~ 520 нм).
- Участок диапазон концентрации плазмиды против показаний интенсивности флуоресценции.
- Бактериальной суспензии количественное:
- Разлить по 5 мкл 10% Triton X-100 на лунку в 96-луночный микропланшет с черными стенками и дном (табл материалов). Добавить 50 мкл бактериальной суспензии в каждую лунку и инкубируют 10 мин при комнатной температуре, в планшетном шейкере.
- Развести дцДНК количественный Реагент 1: 200 в 1x ТЕ-буфера и добавить 55 мкл разбавленного реагента к каждому образцу в микропланшете 96-луночного. Хорошо перемешать, используя планшетный шейкер и инкубировать в течение от 2 до 5 мин при комнатной температуре, в темноте.
- Измерьте флуоресценции образцов с помощью флуоресцентной планшетного и фильтры для стандартных длин волн флуоресцеина (возбуждения ~ 480 нм, эмиссия ~ 520 нм).
- Чтобы получить бактериальный DNКонцентрация, сюжет показания флуоресценции на графике, полученного в точке 1.5.1.4. Разделить концентрацию ДНК по массе Coxiella генома (2,2 FG), чтобы получить бактериальные концентрации. Экспресс результаты в Геном экв / мл.
- Отбросить мутанты, проявляющие существенный дефект роста в ACCM-2.
- Стандартный подготовка кривая:
2. Одноместный Грунтовка ПЦР колоний, последовательности и Аннотация
Примечание: следующий протокол для амплификации ДНК из 96 образцов, многоканальной пипетки рекомендуется для следующих шагов. Очистка на колонке продуктов ПЦР с использованием магнитных шариков и секвенирования ДНК с транспозонов-специфического праймера (2.3) на субподряд к сторонней компании.
- Убедитесь, что усиление грунт предназначен для того, чтобы гибридизоваться между 100 и 200 пар оснований выше по течению от перевернутой тандемных повторов (ITR), чтобы получить продукты ПЦР, охватывающих вставки сайт транспозонов на Coxiellгеном. Готовят 3 мл ПЦР смеси (1x высокой верности, буфер 200 мкМ дНТФ, 1 мкМ праймера амплификации, 20 ед / мл с высокой точностью ДНК-полимеразы) и обойтись 29 мкл на лунку в 96-луночный ПЦР пластины, установленной на льду. Передача 1 мкл каждого мутанта в стационарной фазе в ACCM-2 к смеси ПЦР.
- Выполнить ПЦР с первоначальной денатурации (98 ° С, 1 мин), 20 циклов высокие жесткости (98 ° C, 10 сек; 50 ° С, 30 сек; 72 ° С, 90 сек), 30 циклов низкие жесткости (98 ° C, 10 сек; 30 ° С, 30 сек; 72 ° С, 90 сек) и 30 циклов высокие жесткости (98 ° C, 10 сек; 50 ° С, 30 сек; 72 ° С, 90 сек) с последующим конечным удлинением при 72 ° С в течение 7 мин.
- Очищают продуктов ПЦР, используя магнитные шарики и ДНК последовательности с транспозонов-специфического праймера. Дизайн транспозонов-специфического праймера с предсказанным температуры плавления между 50 ° C и 75 ° C, содержание GC между 40% и 60%, длиной от 18 до 25 нуклеотидов и отжига сиТе вниз по течению от сайта гибридизации праймера амплификации и, по крайней мере 100 пар оснований в обратном направлении от первой базовой пары транспозона ITR.
- Использование программного обеспечения для анализа последовательности, загрузите полный, аннотированный геном Coxiella burnetii 493 НМИ. Используйте функцию "выровнять по ссылке", чтобы загрузить и выровнять (BLASTN) результаты секвенирования и определения сайт транспозиции. Откажитесь мутантов с несоответствующим и / или отображения двойной reads.To контролировать насыщенность мутантного библиотеки, вести учет возникновения нескольких вставок транспозонов в том же месте.
3. эукариотических клеток Вызов с Coxiella мутантов и мониторинга внутриклеточного роста
Примечание: многоканальные пипетки рекомендуется для следующих шагов. Инфекции были выполнены в трех повторах в стерильной 96-луночных микропланшетов с черными стенами и плоской прозрачной нижней части. вес Coxiella burnetii выражающие GFP 14 Вткак это предусмотрено доктором Робертом Гейнценом.
- Выращивают клетки Vero в среде RPMI без фенолового красного, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в отсутствие антибиотиков (полный RPMI носитель).
- За день до инфекции, мыть Vero клеток из сливной или суб-сливной культуры клеток колбу с 10 мл PBS.
- Отделить Vero клеток путем добавления 1 мл трипсина ЭДТА в клеточной культуральной колбы и инкубируют в течение от 3 до 5 мин при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО 2.
- Ресуспендируют клеток в 10 мл полной среды RPMI. Граф клеток и подготовить суспензии клеток 10 5 клеток на мл.
- Распределить 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку черного 96-луночного планшета с плоским прозрачным дном.
- Центрифуга в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре, чтобы облегчить адгезию клеток на дне лунки и инкубируют в течение ночи при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО 2.
- Оттепель 96-луночных на содержащие Coxiella мутанты при комнатной температуре и разбавляют 150 мкл бактериальной суспензии в 300 мкл среды RPMI без фенола красного и FBS в глубине скважины 96-луночного планшета.
- Удалить носитель из микропланшет, содержащий Vero клетки и внесите 100 мкл / лунку разбавленного Coxiella мутантов (МВД 100). Используйте также А1, как негативный (не инфицированные клетки) управления и колодцы A2 и A3 в качестве положительного контроля (клеток, инфицированных мас Coxiella выражая GFP 14 на кратности инфекции (МВД) 100 и 200).
- Центрифуга пластины в течение 10 мин при 400 х г при комнатной температуре с помощью аэрозольного непроницаемого держателя центрифуги пластины.
- Инкубируют при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 в течение 2 ч, затем заменить бактерии среде, содержащей 100 мкл / лунку свежим полной RPMI среде.
- Измерьте каждый день флуоресценции GFP в течение 7 дней с использованием флуоресценции планшетного и фильтры для стандартных длин волн флуоресцеина (возбуждения ~ 480 нм, эмиссия ~ 520 нм). Избегатьвмешательство из-за конденсации и дисперсии сигнала в культуральной среде, использовать нижнюю возбуждения и регистрации излучения на микропланшетного.
4. Подготовка проб для автоматизированного захвата изображений
Примечание: Эта процедура в течение одного 96-луночного планшета, наращивать объемы соответственно. В нескольких шагах от 4.2 может воспользоваться пластины шайбой.
- На 7-й день после заражения, снимите с плиты среду и заменить его 50 мкл / лунку свежим, полным среде, содержащей клетки проницаемой флуоресцентный краситель на соответствующем разведении (обычно 1: 1000, должны быть оптимизированы в соответствии с клеточной линии, используемой ). Инкубируйте клетки в течение 30 - 60 мин при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО 2.
- Заменить среду с 50 мкл / лунку 4% параформальдегида (PFA) в PBS, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре (RT), то удалить из PFA-содержащий буфер и промыть 3 раза PBS.
- Удалить PBS и dispensE 50 мкл / лунку блокирующего раствора (0,5% бычий сывороточный альбумин, 50 мМ NH 4 Cl в PBS, рН 7,4) с добавлением 0,05% сапонина. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Заменить блокирующего раствора с 40 мкл / лунку блокирующего свежего раствора с добавлением сапонина (как указано выше) и с анти-антителом LAMP1 в разведении 1: 500. Инкубируйте пластины в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Удалить блокирующий раствор и промывают 96-луночного планшета 5 раз 100 мкл / лунку PBS.
- Разлить 40 мкл / лунку блокирующего раствора с добавлением сапонина (как описано выше), соответствующую флуоресцентно меченого вторичного антитела (в разведении 1: 1000), чтобы показать анти-антитела ЛАМПА1 применяется на шаге 4.4, и Hoechst 33258 при 5 мкг / мл. Инкубируйте пластины в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Удалить блокирующий раствор и промывают 96-луночного планшета 5 раз 100 мкл / лунку PBS. Оставьте объем PBS, соответствующий последней промывки в 96-луночного планшета, а фиксированные клетки не должны высыхать.
- Изображение пластины немедленно или магазин пластины на 4 ° С, в защищенном от света, для последующего анализа.
5. Image Acquisition
- Получение изображений в GFP (488 нм, бактерии), Hoechst 33258 (350 нм, клетка-хозяин ядра), красный (~ 555 нм, клеточная мембрана маркер) и дальнего красного (~ 615 нм, ЛАМПА1) каналы, использующие автоматизированные эпифлуоресцентной микроскоп оборудованные с целью 20X. Приобретение 21 независимых полей на лунку, чтобы изображение не менее 5000 клеток на образец. Применить автофокусировки с использованием канала хост клеточных ядер в качестве эталона. При работе с бактериальные патогены заражать низкий процент клеток-хозяев, пользователи могут регулировать количество независимых полях отображаемого на лунку, чтобы получить минимум 500 инфицированных клеток для анализа.
Обработка изображения 6.
Примечание: следующие шаги специфичны для использования программного обеспечения для анализа изображений CellProfiler. Во всех случаях оптимальный algoritхм для сегментации должны быть определены экспериментально и объекты, затрагивающие границы изображения должны быть устранены с соответствующей функцией.
- Загрузите все изображения в CellProfiler.
- Используйте модуль "ImageMath" вычесть GFP канал от канала Hoechst, чтобы избежать обнаружения Coxiella колоний (также помеченных Hoechst) в качестве принимающей клеточных ядер в следующих шагах.
- Используйте модуль "IdentifyPrimaryObjects" в ядрах клеток-хозяев сегмент из полученного изображения на этапе 6.2. Назовите сегментированные объекты "ядер".
- Используйте модуль "IdentifySecondaryObjects" в принимающих сегмент клеток из-нм изображений с использованием 555 ядер, обнаруженных на этапе 6.3, как семена. Назовите сегментированные объекты "клетки".
- (Необязательно) Используйте модуль "IdentifyTertiaryObjects" вычесть ядра выявленных на этапе 6.3 из клеток, выявленных на этапе 6.4. Назовите сегментированные объекты "Цитоплазма221 ;.
- Используйте модуль "EnhanceOrSuppressFeatures" на нм изображений 615, чтобы удалить фон и облегчить следующую идентификацию LAMP1-положительных отсеков.
- Используйте модуль "IdentifyPrimaryObjects" на изображении, полученном на шаге 6.6, чтобы определить LAMP1-положительных отсеков. Назовите сегментированные объектов "лизосом".
- Используйте модуль "IdentifyPrimaryObjects" на изображении 488 нм, чтобы определить Coxiella колонии. Назовите сегментированные объекты "колонии".
- Используйте модуль "IdentifySecondaryObjects" на нм изображений 615, чтобы узнать о Coxiella содержащие вакуоли, используя колонии Coxiella обнаруженные на этапе 6.8, как семена. Назовите сегментированные объекты "CCVS".
- Используйте модуль "MaskObjects", чтобы выбрать CCVS обнаруженные на клетках (как клетки соприкасаются границы изображения были устранены некоторые CCVs могут быть обнаружены "снаружи" клетки). Имя ВИЭulting объектов «отфильтрованных» CCVS.
- Используйте модуль "MaskObjects", чтобы выбрать колонии, обнаруженные на клетках (как клетки соприкасаются границы изображения были устранены некоторые колонии могут быть обнаружены "снаружи" клетки). Назовите полученные объекты "Фильтры" Колонии.
- Используйте модуль "MaskObjects", чтобы связать лизосомы клеток. Назовите полученные объекты "с фильтром лизосом".
- Используйте модуль "MaskObjects", чтобы выбрать ячейки, содержащие Coxiella колонии. Назовите полученные объекты "инфицированные клетки".
- Используйте модуль "связывают объекты", чтобы установить объекты "Фильтры" CCVS как детей родительские объекты "Элементы". Это позволит подсчета количества CCVS / Cell.
- Используйте модуль "связывают объекты", чтобы установить объекты "Фильтры" Колонии, как дети объектов родительских "клетки". Это будетпозволяют подсчета количества колоний / Cell.
- Используйте модуль "связывают объекты", чтобы установить объекты "с фильтром лизосом" как дети в родительских объектов "Элементы". Это позволит подсчета количества лизосом / Cell.
- Используйте модуль "MeasureObjectSizeShape", чтобы получить морфологический анализ ядер клетки, фильтруют CCVS, фильтруют колоний и фильтруют лизосом
- Используйте модуль "MeasureObjectIntensity" для количественной оценки GFP флуоресценции, связанное с фильтром CCVs и оценить эффективность Coxiella репликации в CCVs.
- Использование модулей "OverlayOutlines" и "SaveImages" наложить результаты сегментации и исходное изображение для контроля качества.
- Используйте модуль "ExportToSpreadsheet", чтобы экспортировать все или выбор результатов анализа изображения.
- (Необязательно) Используйте модуль "ExportToDatabase", чтобы проанализировать результатыс помощью программного обеспечения CellProfiler аналитик.
Анализ данных 7.
- Для каждого параметра, полученные, выявить и устранить выбросы (из-за ошибок в сегментации изображений), то вычислить средние значения за мутанта.
- Используйте Z-баллы, чтобы выявить существенные фенотипы. Рассмотрим фенотипы с Z-счетом> -2, как не существенный, фенотипы с Z-счетом между -2 и -4, как мягкий и фенотипов с Z-счет ≤ -4, как сильный.
- Земля комбинации параметров по экспериментальным потребностей.
Representative Results
После выделения транспозонов мутантов, одну колонию ПЦР-праймер, является надежной, метод с высокой пропускной для идентификации сайта вставки транспозона для каждого мутанта. Этот подход исходит из типичных вложенного протокола ПЦР, но здесь один праймер специфическую гибридизацию и / или не специально для матричной ДНК в зависимости от жесткости температуры отжига (рис 1А). Типичные продукты ПЦР состоит из нескольких фрагментов ДНК, большинство из которых являются специфическими (рис 1б). Использование другого праймера секвенирования, что отжигов правой вверх по течению от транспозона ITR и ниже последовательности признанной праймера амплификации обеспечивает специфичность для секвенирования стадии (рис 1С). Автоматизированная программа для анализа последовательности выравнивает полученные последовательности к Coxiella генома, обеспечивающей точное местонахождение транспозонов вставок (рис 1в). Все транспозонов вставки могут быть затем Эннotated на Coxiella генома (рис 1D).
Каждый Coxiella мутант выделяют и усиливается в axenically ACCM-2 среде перед хранением или любой скрининга. Рисунок 2 иллюстрирует пример 38 транспозонов мутантов в 16 точек / ICM Coxiella генов (фиг.2А). Чтобы оценить жизнеспособность Coxiella мутантов, аксенными кривые роста получены путем отбора проб с бактериальными культурами в течение 7 дней после инокуляции и применения бактериальной концентрации для анализа, описанного в 1.5 (Figurie 2b). Усиленные мутанты затем инкубировали с эпителиальных клеток, в трех повторах в 96-луночных планшетах в течение 7 дней. Все мутанты, полученные Coxiella быть GFP-тегами, внутриклеточные кривые роста получают путем измерения интенсивности флуоресценции GFP в каждую лунку, каждые 24 ч, и построения измеренных значений в зависимости от времени (фиг.2с).
Intrбесклеточные кривые роста обеспечивают количественный анализ фенотипов, связанных с каждым вставки транспозонов в геноме Coxiella. Чтобы добавить качественную информацию о тех же транспозонов мутантов, мы решили для автоматизированного сбора и анализа изображений. Через семь дней после заражения, пластины установлены, обрабатываются для иммунофлуоресценции, как описано в 4 и анализировали с помощью автоматизированного, эпифлуоресцентной микроскопа, как описано в 5 автоматизированное программное обеспечение анализа изображений, таких как CellProfiler (Broad Institute, www.cellprofiler.com ) обрабатывает полученные каналы самостоятельно и сегменты определены объекты для сравнительного анализа (рис 3). Это позволяет идентифицировать и морфологическое описание ядер клеток-хозяев, сотовые контуров, лизосом и Coxiella колоний (рис 3 верхние панели). Соотнося Coxiella колонии с клетками и лизосом позволяет identificatiна и конкретные морфологический анализ Coxiella -содержащих вакуолей (которые ЛАМПА1 положительным, рис 3 слева внизу панели). Соотнося Coxiella колонии с клетки-хозяина контуров позволяет идентифицировать и конкретные морфологический анализ зараженных клеток (рисунок 3 внизу в центре панели). Наконец, 4 канала объединяются для иллюстрации и целей контроля качества (рис 3 внизу справа панели).
Данные, полученные от автоматизированного анализа изображений, могут быть нанесены друг против друга, чтобы получить "мульти-фенотипические разброс участков". В качестве примера, на фиг.4А Средняя площадь (в мкм 2) Coxiella колоний представлен в зависимости от количества колоний на мобильный (фиг.4А), с тем чтобы определить мутации, которые влияют на внутриклеточную репликацию Coxiella (фенотип репликации) и / или Объем бактерий вторгнуться в клетки-хозяева (междунализация фенотип). Статистический анализ был использован для определения областей в результате рассеяния участка, соответствующего мягких (-4 <Z-счет ≤ -2) и тяжелой (Z-счет) ≤ -4 фенотипов. Мутанты были обнаружены в 3 основные группы: мутации, которые привели к дефектной внутриклеточного роста Coxiella были сгруппированы в самой левой части участка (рис 4А, розовые и красные точки); мутации, которые повлияли Coxiella интернализации в клетках были сгруппированы в нижней части участка (рис 4А, светло- и темно-синие точки) и, наконец, зеленые точки на крайней правой области графике соответствуют мутаций, в результате не-значимых фенотипов ( Z-оценка> -2). Важно отметить, что мутанты, которые не повторить, но все еще в состоянии вторгнуться клеток-хозяев, обнаруживаются через 7 дней после заражения в виде отдельных бактерий или небольших колоний, прилегающих к принимающей клеточные ядра (рис 4C, вторая панель). Следовательно, размер Coxiella "Колообществах »будет в значительной степени зависеть но количество инфицированных клеток не будет отличаться по сравнению с WT Coxiella -infected клеток. Напротив, мутации, которые влияют на способность Coxiella о вторжении в клетки-хозяева, приводит к уменьшению количества колоний / ячейку. Когда это число значительно ниже 1, это указывает, что, в среднем, происходит снижение в общем количестве инфицированных клеток. Кроме того, средняя площадь (в мкм 2) Coxiella колоний может быть в виде зависимости от количества выживших клеток-хозяев инфекции (фиг.4В), чтобы определить мутации, которые придают цитотоксичность в Coxiella (цитотоксические фенотип). Как и выше, статистический анализ был использован для определения областей в результате рассеяния участка, соответствующего мягких (-4 <Z-счет ≤ -2) и тяжелой (Z-счет) ≤ -4 фенотипов. Большинство скрининг мутаций существенно не влияет на выживаемость клеток, независимо от бактериальной репликации в хозяинеклетки (рис 3B зеленые точки). 37 мутации выживание мягко пострадавших клетка-хозяин (рис 3B, светло-красные точки), и 7 мутаций были особенно вредно для размещения выживания клеток (рис 3B, темно-красные точки). Пожалуйста, обратите внимание, что дополнительные параметры, полученные по автоматизированной методике анализа изображения может быть использован для получения других схем, в соответствии с экспериментальными потребностей.
Рисунок 1:. Секвенирование и аннотирование Coxiella транспозонов мутантов () одной колонии ПЦР-праймер используется для амплификации фрагментов ДНК, содержащих сайт вставки транспозонов. Праймера амплификации (Amp) используется как в качестве специфического и неспецифического грунтовки в зависимости от жесткости температуры отжига. (В) Типичная результат одной колонии грунт ПЦР. Каждый Reactiна производит количество фрагментов различного размера, некоторые из которых содержат вставки на сайт транспозона; некоторые другие случайным усиливается в качестве побочных продуктов в низкой жесткости ПЦР цикла. (С) Использование секвенирования праймер (SEQ), которая гибридизуется с последовательностью транспозонов позволяет секвенирование фрагментов интерес. Программное обеспечение (D) Анализ последовательности позволяет автоматически аннотацию транспозонов вставок на бактериальном геноме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Аксенными и внутриклеточный рост Coxiella транспозонов мутантов (А) В пилотной экран, мы изолировали, секвенировали и подвергали скринингу 38 транспозона мутанты в 16 г базовогоены системы секреции точка / ICM Coxiella (обозначена красным). (Б) Для того чтобы оценить жизнеспособность каждого мутанта транспозонов, рост каждого изолята в аксенными культуральной среде контролируется в течение 8 дней с использованием флуоресцентно помеченные интеркалирования ДНК агента. (С) каждый мутант затем используется для инфицируют эпителиальные клетки. Как транспозонов обладает GFP кассету, внутриклеточный бактериальный рост контролируется более 7 дней после заражения, следуя вариации GFP флуоресценции, связанного с Coxiella репликации, используя микропланшет-ридера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Автоматизированный анализ изображения Coxiella инфекций авто.Mated эпифлуоресцентной микроскоп используется для изображения 21 позиции на лунку в трех повторах в 96-луночных планшетах. Сегменты программного обеспечения анализа изображений объектов в каждом приобретенных каналов для количественного и анализа. Во всех случаях, объекты, затрагивающие границу изображений исключены. () Канала Hoechst используется для идентификации хоста клеточные ядра (зелёный). (Б) Они используются в качестве затравки для идентификации клетки-хозяина контуры в канале Cy3 (положение ядер окружены синим, клеточные контуры в зеленый цвет). (С) канала Су5 используется для идентификации LAMP1-положительных отсеков (зелёный); только объекты, включенные в ранее выявленных клеточных контуров (в красном) сохраняются для анализа изображений. (D), GFP канала используется для идентификации Coxiella колонии (зелёный). (Е) Соотнося Coxiella колонии с LAMP1-положительных отсеков позволяет идентифицировать Coxiella (F) Соотнося Coxiella колонии с сотовыми контуров позволяет идентифицировать инфицированных клеток (псевдоцветной). (G) Изображения, полученные в флуоресценции каналов 4 (соответствует Coxiella колоний (зеленый), хост клеточных ядер (синий), плазмы клетки-хозяина мембраны (серый), LAMP1-положительных отсеков (красный)) сливаются и используется для иллюстрации и качества контроль. Масштаб бары 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Масштабная идентификация Coxiella факторов, участвующих в хозяина / возбудитель взаимодействуютионы. (A) Средняя площадь (в мкм 2) Coxiella колоний представлен в зависимости от относительного количества колоний на клетку, чтобы определить репликации и интернализации фенотипы интерес. Зеленые точки представляют фенотипы, которые отличаются от WT Coxiella по Z-счет> -2 (не значительный). Розовый и голубой точки представляют репликации и интернализации фенотипы, соответственно, с Z-счетом между -2 и -4 (мягких фенотипов). Красный и темно-синие точки представляют фенотипы с Z-счет ≤ -4 (сильные фенотипов). (В) Средняя площадь (в мкм 2) Coxiella колоний рассчитывают относительно общего количества клеток (инфицированных и не инфицированных), которые выжили 7 дней после заражения, чтобы оценить цитотоксическое действие в результате транспозонов вставок. Зеленые точки представляют фенотипы, которые отличаются от WT Coxiella по Z-счет> -2 (не значительный). Розовые точки представляют цитотоксической телenotypes с Z-счетом между -2 и -4 (мягких фенотипов). Красные точки представляют цитотоксические фенотипы с Z-счет ≤ -4 (сильные фенотипов). Стрелки указывают мутантов, показанных на соответствующий строчной буквы в С (С) Типичные изображения репликации, интернализации и цитотоксических фенотипов. Во всех случаях, хозяин клеточные ядра в красный, Coxiella колонии в зеленый. Масштаб бары 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Изучение хост / патогена взаимодействия оказалась замечательным способом понять бактериальных инфекций и развивать альтернативные стратегии по борьбе с инфекционными заболеваниями. Тем не менее, из-за разнообразия стратегий, разработанных различными бактериальными патогенами, идентификация и характеристика бактериальных факторов вирулентности и хозяина сигнальных путей, которые целевой при инфекциях представляют собой реальную проблему. Это требует разработки новых подходов к крупномасштабной идентификации ключевых узлов взаимодействия хоста / патогена. Недавнее развитие инновационной, высокой пропускной и высокого содержания методов скрининга представляет собой бесценный ресурс, который может быть адаптирован к изучению внутриклеточных бактериальных патогенов 15. Здесь мы использовали зоонозных бактериальный возбудитель Coxiella burnetii в качестве модели для разработки скрининга подходы, которые сочетают транспозонов мутагенеза и флуоресценции на основе анализов. ImportanTLY, этот метод скрининга позволяет одновременный мониторинг нескольких шагах внутриклеточного цикла Coxiella, обеспечивая глобальный обзор стратегий, разработанных этой бактерией вторгнуться, тиражировать и сохраняются в течение инфицированных клеток.
Описанный здесь подход основан на двух хорошо известных методов, транспозонов мутагенеза и флуоресценции основе анализа, которые были успешно применены к изучению бактериальных патогенов. Сочетание этих методов в контексте экранов высокой пропускной / высокого содержания позволяет оценить воздействие большого количества бактериальных мутаций, анализируя очень большое количество событий (обычно 15000 инфицированных клеток за бактериальных мутаций вошедшие и анализируются). Это обеспечивает важную статистический анализ событий, таких как бактериальной инвазии клеток-хозяев и внутриклеточного репликации, которые, по своей природе, с учетом высокой изменчивости. Важно отметить, что другие клеточные линии, чем ЕРithelial могут быть использованы для этого типа скрининга. Тем не менее, плоские и большие эпителиальные клетки являются оптимальными для анализа изображений, как хост клеточные органеллы легче обнаружить. Поскольку большинство автоматизированных микроскопов может автоматически обрабатывать большое количество пластин, не существует практически никаких ограничений на количество мутантов, которые могут быть подвергнуты скринингу одновременно. В зависимости от возбудителя, пользователь может привилегия использование эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии. Время получения изображения во многом будет зависеть от чувствительности камеры микроскопа, от количества полей, полученных на лунку и по количеству каналов, полученных в поле зрения. Пользователь может решить, как корректировать эти факторы для оптимизации протокола скрининга. В качестве примера, мы отображаемого один 96-луночного планшета / ч с использованием условий, указанных в пункте 5.1. Анализ изображения значительной степени зависит от машины (или группе машин) используется. Мы используем 12-ядро (2 х 3,06 ГГц 6-Core), 48 ГБ оперативной памяти рабочей станции. Эта машина требует Approxiсчете 40 мин для анализа изображений, полученных с одной пластины.
Важный аспект необходимо учитывать при разработке этих анализов является множество из новых (или оптимизации существующих протоколов), чтобы позволить манипуляцию и обработку большого числа образцов. Типичным примером является развитие единого грунт колонии ПЦР подхода, который позволил нам быстро усилить и фрагменты последовательности Coxiella ДНК, содержащие сайт вставки каждого транспозонов, от очень маленьких образцов. Основываясь на нашем опыте, высококачественный полимеразной должен быть тщательно отобраны и протестированы для того, чтобы получить воспроизводимые результаты. Единственное ограничение этого подхода может скрывать в наблюдении, что, в большинстве случаев, около 30% из полученных образцов не являются годный для использования, либо из-за ПЦР или шагов секвенирования. Однако, учитывая, что изоляция новых Coxiella транспозонов мутантов не ограничение скорости шаг, это не предстанаправил важный вопрос. Аналогичным образом, разработка надежного анализа количественного определения концентрации бактерий мутантных запасов играет ключевую роль в этом подходе. В связи с тенденцией к агрегации Coxiella, когда в суспензии, использование показаний оптической плотности не применяется для расчета концентрации Coxiella культур и единственной существующей альтернативой количественный ПЦР (КПЦР). Здесь использование флуоресцентно меченых ДНК интеркалирующего агента значительно ускорить бактерий количественное.
Этот подход также может воспользоваться использованием стабильных клеточных линий, экспрессирующих флуоресцентные маркеры для нескольких внутриклеточные компартменты, в зависимости от возбудителя используется. Другим важным аспектом является использование клеточной культуральной среде, лишенной фенолового красного. Мы наблюдали, что этот показатель рН имеет естественную флуоресценцию охватывающей красный и зеленый спектр, который насыщает сигнала, записанного на автоматизированном считывания флуоресценции.
Тон стратегия, представленная здесь опирается на случайный транспозонов мутагенеза. Для мутантов интерес, мы рекомендуем проверки уникальные перестановки (и клональности) с помощью Саузерн-блоттинга и ПЦР амплификации сайта вставки транспозона.
Кроме оборудования, описанного в разделе протокола, команды, заинтересованные в использовании скрининга подход, представленный здесь, доставит огромное преимущество в заданной реляционной базы данных для сбора данных, сервер для хранения данных и рабочих станций для быстрого анализа изображений.
Важно отметить, что метод здесь описано подходит для изучения других внутриклеточных бактериальных патогенов при условии случайного мутагенеза существует для возбудителя, клеточные линии могут быть заражены возбудителем, и это одна отображает определенный фенотип при заражении.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Citric acid | Sigma | C0759-500G | ACCM-2 medium component |
| Sodium citrate | Sigma | S4641-500G | ACCM-2 medium component |
| Potassium phosphate | Sigma | 60218-100G | ACCM-2 medium component |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670-100G | ACCM-2 medium component |
| Calcium chloride | Sigma | C5080-500G | ACCM-2 medium component |
| Iron sulfate | Sigma | F8633-250G | ACCM-2 medium component |
| Sodium chloride | Sigma | S9625-500G | ACCM-2 medium component |
| L-cysteine | Sigma | C6852-25G | ACCM-2 medium component |
| Bacto Neopeptone | BD (Beckton-Dickinson) | 211681 | ACCM-2 medium component |
| Casamino acids | BD (Beckton-Dickinson) | 223050 | ACCM-2 medium component |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma | C4555-10G | ACCM-2 medium component |
| RPMI w/glutamax | Gibco | 61870-010 | ACCM-2 medium component |
| RPMI w/glutamax, without phenol red | Gibco | 32404-014 | For cell culture and infection |
| Fetal bovine serum | GE healthcare | SH30071 | For cell culture |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | For cell culture |
| Saponin | Sigma | 47036 | For immunofluorescence staining |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | For immunofluorescence staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | For immunofluorescence staining |
| Electroporation cuvette 0.1 cm | Eurogentec | ce0001-50 | For Coxiella transformation |
| Trackmates screw top tubes with caps | Thermo Scientific | 3741 | 2D barcoded screwcap |
| 96-well microplate with black walls and bottom | Greiner | 655076 | Flat dark bottom, for dsDNA quantitation |
| 96-well PCR microplate | Biorad | 2239441 | DNAse/RNAse free |
| 96-well plate, deepwell | Labcon | 949481 | For Coxiella mutants infections |
| PicoGreen | Life Technologies | P7581 | For dsDNA quantitation |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | For dsDNA quantitation |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | For single primer colony PCR |
| Celltracker Red CMTPX | Life Technologies | C34552 | For imaging |
| Anti-LAMP1 antibody | Sigma | 94403-1ML | For immunofluorescence staining |
| Hoechst 33258 | Sigma | L1418 | For imaging |
| Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro | Tecan | ||
| Epifluorescence automated microscope Cellomics | Thermo Scientific |
References
- Maurin, M., Raoult, D. Q fever. Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).
- Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States. Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).
- Kazar, J. Coxiella burnetii. infection. Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).
- Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).
- Der Hoek, W. V. an, et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).
- Capo, C., et al. Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3. Journal of immunology. 163 (11), Baltimore, Md. 6078-6085 (1999).
- Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Berón, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell. Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Newton, H. J., Mcdonough, J. a, Roy, C. R. Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole. PloS one. 8 (1), e54566 (2013).
- Vogel, J. P. Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii. Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).
- Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii. Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).
- Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. mBio. 2, (2011).
- Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium. Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).
- Beare, P. a, Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).
- Brodin, P., Christophe, T. High-content screening in infectious diseases. Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).
