Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van doi: 10.3791/52851 Published: May 13, 2015

Summary

Coxiella burnetii is een obligaat intracellulaire Gram-negatieve bacterie die verantwoordelijk is voor de zoönose Q-koorts. Hier beschrijven we werkwijzen voor het genereren van Coxiella fluorescent transposon mutanten en de geautomatiseerde identificatie en analyse van de verkregen internalisatie, replicatie en cytotoxische fenotypes.

Abstract

Invasie en kolonisatie van gastheercellen door bacteriële pathogenen afhangen van de activiteit van een groot aantal prokaryotische eiwitten, gedefinieerd als virulentiefactoren die kan ondermijnen en manipuleren belangrijkste gastheerfuncties. De studie host / pathogen interactions is daarom van groot belang om bacteriële infecties te begrijpen en alternatieve strategieën om infectieziekten bestrijden. Deze benadering vereist echter de ontwikkeling van nieuwe high-throughput assays voor de onbevooroordeelde, geautomatiseerde identificatie en karakterisering van bacteriële virulentie determinanten. Hier beschrijven we een werkwijze voor het genereren van een GFP-gelabeld mutantbibliotheek door transposon mutagenese en de ontwikkeling van high content benaderingen voor de gelijktijdige identificatie van verschillende transposon-geassocieerde fenotypes. Ons werkmodel is de intracellulaire bacteriële pathogenen Coxiella burnetii, het etiologische agens van de zoönose Q-koorts, die wordt geassocieerd met SEvere uitbraken met een daaruit voortvloeiende gezondheid en economische last. De obligate intracellulaire karakter van deze pathogeen tot voor kort aanzienlijk bemoeilijkt de identificatie van bacteriële factoren betrokken bij ontvangst pathogen interactions, waardoor van Coxiella het ideale model voor de uitvoering van high-throughput / high content benaderingen.

Introduction

De opkomende, endemische bacterie Coxiella burnetii is verantwoordelijk voor grote uitbraken van Q-koorts, een slopende griepachtige zoönose met ernstige gezondheids- en economische impact 1. De belangrijkste reservoirs van Coxiella zijn huisdieren en vee, en er wordt geschat dat meer dan 90% van melkvee in de VS dragen C. burnetii 2. Mensen zijn toevallige hosts die geïnfecteerd zijn door inademing van besmette aerosolen. Human Q-koorts manifesteert ofwel als een acute of chronische ziekte, die fatale complicaties met een sterftecijfer bereiken van 65% 1,3 kan hebben. Met een besmettelijke dosis van 1-10 organismen, Coxiella de meest infectieuze pathogenen bekend en is onderzocht als een mogelijke biologisch wapen 4. De recente explosieve uitbraak van Q-koorts in Nederland (2007 - 2010), met cases dosis verhoogd wordt van 182 tot meer dan 2000 per jaar, is een voorbeeld van de zware virulentie van het pathogeen5.

De opmerkelijke efficiëntie van Coxiella infecties is waarschijnlijk geassocieerd met resistentie tegen omgevingsstress, gecombineerd met zijn unieke aanpassing aan gastheercellen. Inderdaad, Coxiella aanwezig in het milieu in de vorm van metabolisch inactieve kleincellige varianten (SCV), die opmerkelijk resistent tegen meerdere zware omstandigheden (uitdroging, temperatuur, etc.). SCVs worden opgenomen door fagocytische cellen via α β V 3 integrinen 6 terwijl invasie van niet-fagocytische cellen wordt gemedieerd door de Coxiella adhesie / invasie OmpA 7 en een ongeïdentificeerde receptor. Na opname, Coxiella woont in nauwsluitende vacuoles, positief voor de vroege endosomale markers Rab5 en EEA1 8. Bacteriën reageren op endosomale verzuring door het omzetten naar metabolisch actief grote cel varianten (lichte bedrijfswagens) en het activeren van een Dot / Icm type 4 secretie systeem (T4SS) 9, Sterk homoloog is met die van Legionella pneumophila 10. De afscheiding van Dot / Icm effectoren laten Coxiella tot een grote, LAMP1-positieve zure compartiment met actieve lysosomale enzymen, waar bacteriën kunnen gedijen en actief te beschermen geïnfecteerde cellen van apoptose 11 genereren. Derhalve wordt de intracellulaire cyclus van Coxiella bestuurd door Dot / Icm-gemedieerde translocatie van bacteriële effectoren 12 echter de microbiële factoren betrokken bij gastheercel invasie, bacteriële replicatie en verspreiding van de infectie blijven grotendeels onbekend.

De combinatie transposon mutagenese en fluorescentie gebaseerde assays ontwikkelen wij onpartijdige benaderingen voor de gelijktijdige identificatie van bacteriële factoren die bij de hoofdstappen van Coxiella infecties: 1) internalisatie in gastheercellen, 2) intracellulaire replicatie, 3) cell-to-cell spread en 4) de persistentie. Tot op heden hebben we meer dan 1.000 m afgeschermdutations in 500 Coxiella coderende sequenties, die ons met ongekende inzichten in de gastheer-pathogeen interacties die Coxiella pathogenese 7 reguleren. We merken kan deze benadering worden toegepast voor de studie van andere intracellulaire pathogenen die celbiologie elementen met Coxiella delen.

Protocol

1. Het genereren van een bibliotheek van GFP-gelabeld Coxiella transposon mutanten

Manipuleren Coxiella burnetii RSA439 NMII in een bioveiligheid containment 2 (BSL-2) in een microbiële veiligheidskabinet (MSC) in overeenstemming met de lokale regels. Als verenigbaar met de bacteriële gebruikte model Herhaal stap 1.4.1 tot 1.4.4 van de kans op het verkrijgen klonale mutanten te verhogen. Een typische mutantenbank bestaat (tenminste) een aantal mutanten die gelijk aan driemaal het aantal coderende sequenties geannoteerde in het genoom van het organisme gebruikte.

  1. Voorbereiding van de electrocompetente Coxiella RSA439 NMII:
    1. Bereid 1x ACCM-2 13: 13,4 mM citroenzuur, 16,1 mM natriumcitraat, 3,67 mM kaliumfosfaat, 1 mM magnesiumchloride, 0,02 mM calciumchloride, 0,01 mM ijzersulfaat, 125,4 mM natriumchloride, 1,5 mM L-cysteïne, 0,1 g / l Bacto Neopeptone, 2,5 g / l casaminozuren, 1 g / l methyl beta-cyclodextrine, 125 ml / l RPMI. Pas de pH op 4.75 en filter steriliseren (niet autoclaaf). Opmerking: Liquid ACCM-2 stabiel is bij 4 ° C gedurende ongeveer 1 maand.
    2. Inoculeren 100 ml ACCM-2 met 2 x 10 6 genoom equivalent (GE) / ml van Coxiella RSA439 NMII (van een bacteriële voorraad eerder gegenereerde en gekwantificeerd zoals in stap 1.5) van -80 ° C voorraden en distribueren van de bacteriële suspensie in 75 cm 2 celkweek kolven met geventileerde caps (10 - 15 ml van de bacteriële suspensie per fles). Kweek gedurende 7 dagen bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 2,5% O 2.
    3. Verzamel de verkregen bacteriële suspensie in 50 ml en centrifugeer bij 3900 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C.
    4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 30 ml van 10% glycerol. Centrifugeer bij 3900 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C.
    5. Resuspendeer de pellet in een geschikt volume van 10% glycerol (kenmerkend 2 ml) en 50 pi aliquot in 500 pi tubes. Houd geresuspendeerde bBacteriën op ijs gedurende het gehele proces. Opmerking: In dit stadium elektrocompetente bacteriën en een portie volstaat één elektroporatie voeren. De bacteriële suspensies kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende 6 maanden of direct gebruikt voor elektroporatie plasmide DNA.
  2. Elektroporatie van de bevoegde Coxiella met transposon- en-transposase coderen plasmiden:
    Let op: voor de volgende protocol de transponeerbare element en het transposase worden gecodeerd door twee verschillende plasmiden (Pitr-CAT-GFP en pUC19-Himar1C9, respectievelijk) 7. Beide plasmiden missen een Coxiella specifiek replicatieoorsprong waardoor ze zelfmoord plasmiden als geëlektroporeerd in Coxiella. Dit zorgt voor een stabiele transposon toevoegingen. De transponeerbare element bevat een chlooramfenicol weerstand cassette onder de regeling van de Coxiella promotor p1169 voor de selectie en het GFP-gen onder de regeling van de Coxiella promotor P311 om de gegenereerde mutanten met GFP taggen.
    1. Pre-koelen een 0,1 cm elektroporatie cuvet gedurende 10 min op ijs. Meng 50 pl elektrocompetente Coxiella met 10 ug transposon plasmide en 10 ug plasmide transposase 7. Controleer plasmide concentratie hoger dan 500 pg / ml verdunning van de glycerol minimaliseren.
    2. Electroporate met de volgende opstelling: 18 kV, 500 Ω, 25 uF. Zorg ervoor dat de resulterende tijdconstante ligt tussen 9 en 13 msec.
    3. Voeg onmiddellijk 950 pl RPMI, resuspendeer de geëlektroporeerde bacteriën en overbrengen in een schroefdop buisje en bewaar bij kamertemperatuur.
    4. Neem 200 ul van de bacteriën geëlektroporeerd en aan 3 ml ACCM-2 aangevuld met 1% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) in 6-well platen. Voeg 88 pl van DMSO om de resterende hoeveelheid bacteriën geëlektroporeerd en opslag (tot een eindconcentratie van 10% DMSO bereiken) bij -80 ° C.
  3. Selectie van het transposon mutanten:
    1. Incubate van de 6-well platen geïnoculeerd zoals hierboven (1.2.4) beschreven nacht bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 2,5% O 2. Voeg de juiste antibiotica (375 pg / ml kanamycine of 3 ug / ml chlooramfenicol). Incubeer de bacteriële kweek gedurende 3 bijkomende dagen in de hiervoor beschreven omstandigheden.
  4. Isolatie van afzonderlijke mutanten:
    1. Bereiding van vaste ACCM-2 borden en plating van Coxiella transposon mutanten
      Opmerking: De volgende instructies zijn 1 petrischaal, verschillende verdunningen van bacterieculturen moeten worden getest om optimale inoculatie volume kolonie isolatie beoordelen.
      1. Verwarm 10,5 ml van 0,5% agarose in een magnetron en laat het afkoelen in een 55 ° C waterbad. Verwarm 11,25 ml 2x ACCM-2 (pH 4,75) bij 37 ° C.
      2. Bereid bodem agarose:
        1. Meng 10 ml gesmolten 0,5% agarose met 10 ml 2x ACCM-2 en voeg de juiste antibiotica (375 pg / ml kanamycine of 3ug / ml chlooramfenicol).
        2. Onmiddellijk giet in de petrischaal. Houd de petrischaal unlidded, laat het medium afkoelen gedurende 30 minuten en de lucht drogen gedurende 20 minuten.
      3. Bereid top agarose:
        1. Meng 1,25 ml 2x ACCM-2 met 0,75 ml water in een 5 ml polystyreen buis, voeg de juiste antibiotica (375 pg / ml kanamycine of 3 ug / ml chlooramfenicol) en incubeer bij 37 ° C.
        2. Voeg de bacteriecultuur (typisch 1 tot 100 pi) en vortex gedurende 5 sec.
        3. Voeg 0,5 ml van gesmolten agarose, mengen en giet onmiddellijk op de bodem agarose.
        4. Laat afkoelen gedurende 20 min, vervangt het deksel op de petrischaal en incuberen bij 4 ° C gedurende 20 min aan agarose stolling te bevorderen.
        5. Lucht drogen gedurende 20 min unlidded in een MSC. Groeien platen bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 2,5% O 2 gedurende 6 tot 7 dagen.
    2. Voeg DMSO de resterende bacteriënl kweken teneinde een eindconcentratie van 10% DMSO en bewaar bij -80 ° C bereikt.
    3. De optimale verdunning beoordelen als volgt: zorgen dat kolonies zijn 0,5 tot 1 mm in diameter en goed zijn geïsoleerd om kruisbesmetting te voorkomen. Ontdooi resterende bacterieculturen van punt 1.4.2 en de plaat op de juiste verdunning op ACCM-2 agar zoals beschreven in 1.4.1.2 en 1.4.1.3. Incubeer gedurende 6-7 dagen overeenkomstig 1.4.1.3.5.
    4. Wanneer kolonies detecteerbaar, te verzamelen door het snijden na een 1 ml tip, kiezen van de plug die geïsoleerde kolonies en dispergeren van de kolonie door pipetteren in 1,5 ml ACCM-2 die de geschikte antibiotica (375 pg / ml kanamycine of 3 ug / ml chlooramfenicol) in een 24-wells plaat. Amplify individuele kolonies gedurende 6 dagen in de in 1.3.1 beschreven omstandigheden. Op dag 3 van de incubatie, de verspreiding van de bacterie bosjes door pipetteren elke cultuur.
    5. Bewaar elke mutant suspensie in 2D barcodes schroefkap buizen in 96-well platen in 10% DMSO bij -80 ° C.
  5. Evaluatie van bacteriële concentraties:
    Opmerking: De volgende protocol kan worden toegepast op de groeicurven van bacteriemutanten repliceren in axenic medium (zie 1.4.4) te verkrijgen.
    1. Standard curve voorbereiding:
      1. Bereid een 2 ug / ml voorraad oplossing van dsDNA (meestal een willekeurige plasmide van bekende grootte en concentratie) in 1x Tris-EDTA (TE). Bereid 10-voudige seriële verdunningen van de voorraadoplossing tot concentraties variërend van 2 ug / ml tot 2 ng / ml. Breng 50 pl van elke concentratie enkelvoudige putjes van een 96 putjes microplaat met zwarte wanden en bodem (zie tabel of Materials).
      2. Verdun het dsDNA kwantificatie reagens 1: 200 in 1 x TE-buffer en voeg 55 ul van het verdunde reagens aan elk monster in de 96-well microplaat. Meng goed met een platenschudder en incubeer gedurende 2 tot 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
      3. Meet de monsters fluorescentie met behulp van een fluorescerendenvu microplaataflezer en filters voor standaard fluoresceïne golflengten (excitatie ~ 480 nm, emissie ~ 520 nm).
      4. Plot het plasmide concentratiegebied tegen de fluorescentie-intensiteit lezingen.
    2. Bacteriële suspensie kwantificering:
      1. Pipetteer 5 ul van 10% Triton X-100 per putje in een 96-well microplaat met zwarte wanden en bodem (zie tabel of Materials). Voeg 50 ul van de bacteriële suspensies aan elk putje en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur op een plaat schudder.
      2. Verdun het dsDNA kwantificatie reagens 1: 200 in 1 x TE-buffer en voeg 55 ul van het verdunde reagens aan elk monster in de 96-well microplaat. Meng goed met een platenschudder en incubeer gedurende 2 tot 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
      3. Meet de monsters fluorescentie met fluorescentie- microplaat reader en filters voor standaard fluoresceïne golflengtes (~ excitatie 480 nm, emissie ~ 520 nm).
      4. Om de bacteriële DN te verkrijgenEen concentratie, plot van de fluorescentie metingen in de grafiek verkregen bij punt 1.5.1.4. Verdeel de DNA concentratie door de massa van de Coxiella genoom (2,2 fg) voor bacteriële verdunningen bereid. Resultaten in Genoom Equivalent / ml uiten.
      5. Gooi mutanten vertonen een aanzienlijke groei defect in ACCM-2.

2. Single Primer Kolonie PCR, Sequencing en annotatie

Let op: de volgende protocol is voor DNA-amplificatie van 96 monsters wordt een meerkanaalspipet aanbevolen voor de volgende stappen. Column zuivering van PCR-producten met behulp van magnetische kralen en DNA-sequencing met een transposon-specifieke primer (2.3) worden uitbesteed aan een extern bedrijf.

  1. Controleer of de amplificatie primer is ontworpen om te hybridiseren tussen 100 en 200 basenparen stroomopwaarts van de geïnverteerde tandem repeat (ITR), PCR producten die de transposon insertie plaats op Coxiell vindeneen genoom. Bereid 3 ml PCR mix (1x high fidelity buffer, 200 uM dNTP, 1 uM amplificatie primer, 20 U / ml high fidelity DNA polymerase) en verdeel 29 gl per putje in een 96-well PCR plaat die op ijs. Overdracht 1 pi van elke mutant in stationaire fase ACCM-2 aan de PCR mix.
  2. Run PCR met een initiële denaturatie (98 ° C, 1 min), 20 cycli hoge stringentie (98 ° C, 10 seconden; 50 ° C, 30 seconden; 72 ° C, 90 sec), 30 lage stringentie cycli (98 ° C, 10 sec, 30 ° C, 30 seconden; 72 ° C, 90 sec) en 30 hoge stringentie cycli (98 ° C, 10 sec; 50 ° C, 30 seconden; 72 ° C, 90 sec) gevolgd door een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 7 min.
  3. Zuiver PCR producten via magnetische partikels en DNA sequentie met een transposon-primer. Ontwerp van de transposon-specifieke primer met een voorspelde smelt- temperatuur tussen 50 ° C en 75 ° C, een GC-gehalte tussen 40% en 60%, een lengte tussen 18 en 25 nucleotiden en een annealing site stroomafwaarts van de amplificatie primer hybridisatieplaats en ten minste 100 basenparen stroomopwaarts van de eerste basenparen van het transposon ITR.
  4. Met behulp van sequentie-analyse software, laadt u de volledige, geannoteerde genoom van Coxiella burnetii 493 NMI. Gebruik de functie "af te stemmen op verwijzing" om te laden en af ​​te stemmen (BLASTN) de sequencing resultaten en het bepalen van de plaats van de omzetting. Gooi mutanten met niet-matching en / of weergeven dubbele reads.To toezicht op de verzadiging van de mutant bibliotheek, een register bijhouden van het optreden van meerdere transposon toevoegingen op dezelfde plaats.

3. Eukaryote Cellen Daag met Coxiella Mutanten en Bewaking van de intracellulaire groei

Opmerking: Een meerkanaalspipet wordt aanbevolen voor de volgende stappen. Infecties werden uitgevoerd in triplo in steriele 96-putjes met zwarte wanden en vlakke transparante bodem. gew Coxiella burnetii die GFP 14 wzoals voorzien door Dr. Robert Heinzen.

  1. Groeien Vero-cellen in RPMI zonder fenolrood, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij afwezigheid van antibiotica (complete RPMI-medium).
  2. De dag voor infectie wassen Vero-cellen van een confluente of sub-confluente celkweek kolf met 10 ml PBS.
  3. Trek Vero-cellen door het toevoegen van 1 ml van trypsine EDTA-oplossing aan de celkweek kolf en incubeer gedurende 3 tot 5 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2.
  4. Resuspendeer cellen in 10 ml compleet RPMI-medium. Tellen cellen en voor te bereiden van een cel suspensie van 10 5 cellen per ml.
  5. Pipetteer 100 ul van de celsuspensie in elk putje van een zwarte 96-well plaat met vlakke transparante bodem.
  6. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g bij kamertemperatuur celadhesie aan de onderkant van de putjes vergemakkelijken en incubeer overnacht bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2.
  7. Ontdooi de 96-well platen bevattende Coxiella mutanten bij kamertemperatuur en verdun 150 gl bacteriesuspensie in 300 ul RPMI zonder fenolrood en FBS in een diepe put 96-putjesplaat.
  8. Verwijder het afdrukmateriaal uit de microplaat met Vero-cellen en afzien 100 ul / putje van verdund Coxiella mutanten (MOI van 100). Gebruik zowel A1 als negatief (niet-geïnfecteerde cellen) controle en putten A2 en A3 als positieve controles (cellen geïnfecteerd met wt Coxiella die GFP 14 in veelvouden van infecties (MOI) van 100 en 200).
  9. Centrifugeer de plaat gedurende 10 min bij 400 xg bij RT met behulp van een spuitbus-tight centrifuge kentekenplaathouder.
  10. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 gedurende 2 uur vervang bacteriën bevattend medium met 100 gl / putje van vers compleet medium RPMI.
  11. Meet GFP fluorescentie dagelijks gedurende 7 dagen gebruik van een fluorescentie microplaat lezer en filters voor standaard fluoresceïne golflengten (excitatie ~ 480 nm, emissie ~ 520 nm). Vermijdeninterferentie door condensatie en het signaal dispersie in het kweekmedium, gebruikt onder excitatie en emissie opname op de microplaat reader.

4. Voorbereiding van de monsters voor Automated Image Acquisition

Opmerking: De procedure is voor een 96-putjesplaat, opschalen volumes aangepast. Stappen van 4,2 kunnen gebruik maken van een plaat wasmachine.

  1. Op 7 dagen na infectie, verwijdert medium van de plaat en vervangen door 50 pl / putje van vers compleet medium dat een celpermeabel fluorescerende kleurstof bij de juiste verdunning (gewoonlijk 1: 1000, te optimaliseren volgens de cellijn ). Incubeer cellen gedurende 30-60 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2.
  2. Vervang medium met 50 gl / putje van 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS, incubeer 30 min bij kamertemperatuur (RT) verwijder de PFA-bevattende buffer en was 3 maal met PBS.
  3. Verwijder PBS en dispense 50 pl / putje blokkerende oplossing (0,5% runderserumalbumine, 50 mM NH4Cl in PBS, pH 7,4) gesupplementeerd met 0,05% saponine. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
  4. Vervang blokkeeroplossing met 40 gl / putje van verse blokkerende oplossing aangevuld met saponine (zoals hierboven) en met een anti-LAMP1 antilichaam bij een 1: 500 verdunning. Incubeer de plaat gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
  5. Verwijder blokkeringsoplossing en was de 96-well plaat 5 maal met 100 ul / putje PBS.
  6. Pipetteer 40 ul / putje blokkerende oplossing aangevuld met saponine (zoals hierboven), de juiste fluorescent gelabeld secundair antilichaam (bij een verdunning van 1: 1000) bij de anti-LAMP1 antilichaam toegepast bij stap 4.4 worden vastgesteld en met Hoechst 33258 bij 5 ug / ml. Incubeer de plaat gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
  7. Verwijder blokkeringsoplossing en was de 96-well plaat 5 maal met 100 ul / putje PBS. Laat het volume PBS overeenkomend met het laatste wassing in de 96-well plaat, de gefixeerde cellen niet zou uitdrogen.
  8. De plaat onmiddellijk of op te slaan plaat staan ​​bij 4 ° C, beschermd tegen licht, voor verdere analyse.

5. Image Acquisition

  1. Acquire beelden in de GFP (488 nm, bacteriën), Hoechst 33258 (350 nm, gastheercel kernen), rood (~ 555 nm, celmembraan marker) en veel rood (~ 615 nm, LAMP1) kanalen met behulp van een geautomatiseerd epifluorescentie microscoop uitgerust met een 20X objectief. Verwerven van 21 onafhankelijke velden per putje in om het imago van een minimum van 5.000 cellen per monster. Breng autofocus de host cell nuclei kanaal als referentie. Bij het werken met bacteriële pathogenen infecteren van een laag percentage gastheercellen kunnen gebruikers het aantal onafhankelijke velden afgebeeld per putje passen, teneinde ten minste 500 geïnfecteerde cellen te verkrijgen om te analyseren.

6. Beeldverwerking

Opmerking: De volgende stappen zijn specifiek voor het gebruik van de beeldanalyse software CellProfiler. In alle gevallen is de optimale algorithm voor segmentatie moet proefondervindelijk worden bepaald en de objecten de rand van het beeld te raken moet worden geëlimineerd met de juiste functie.

  1. Laad alle beelden in CellProfiler.
  2. Met de module "ImageMath" naar de GFP kanaal aftrekken van de Hoechst kanaal, om detectie van Coxiella kolonies (ook gelabeld door Hoechst) als gastheer celkernen in de volgende stappen te voorkomen.
  3. Gebruik de module "IdentifyPrimaryObjects" naar segment gastheer celkernen van het resulterende beeld van stap 6.2. Noem de gesegmenteerde objecten "Nuclei".
  4. Gebruik de module "IdentifySecondaryObjects" naar segment gastheercellen van de 555 nm beelden met behulp van de gedetecteerde bij stap 6.3 als zaden kernen. Noem de gesegmenteerde objecten "Cells".
  5. (Optioneel) Gebruik de module "IdentifyTertiaryObjects" te kernen geïdentificeerd in stap 6.3 uit cellen geïdentificeerd in stap 6.4 aftrekken. Noem de gesegmenteerde objecten "Cytoplasma221 ;.
  6. Gebruik de module "EnhanceOrSuppressFeatures" op de 615 nm beelden op de achtergrond te verwijderen en de volgende identificatie van LAMP1-positieve compartimenten vergemakkelijken.
  7. Gebruik de module "IdentifyPrimaryObjects" op het beeld verkregen bij stap 6,6 tot LAMP1-positieve compartimenten identificeren. Noem de gesegmenteerde objecten "Lysosomen".
  8. Gebruik de module "IdentifyPrimaryObjects" op het 488 nm tot Coxiella kolonies te identificeren. Noem de gesegmenteerde objecten "Kolonies".
  9. Gebruik de module "IdentifySecondaryObjects" op de 615 nm beelden te Coxiella bevatten vacuolen met behulp van de Coxiella kolonies gedetecteerd bij stap 6.8 als zaden te identificeren. Noem de gesegmenteerde objecten "CCV".
  10. Gebruik de module "MaskObjects" te CCV gedetecteerd op cellen te selecteren (zoals cellen de rand van het beeld te raken zijn geëlimineerd, kunnen sommige CCV worden opgespoord "buiten" cellen). Noem de resulting objecten "Gefilterd CCV".
  11. Met de module "MaskObjects" naar kolonies gedetecteerd op cellen te selecteren (zoals cellen de rand van het beeld te raken geëlimineerd, kunnen sommige kolonies gedetecteerd "buiten" cellen). Noem de resulterende objecten "Gefilterd Kolonies".
  12. Gebruik de module "MaskObjects" te associëren Lysosomen aan cellen. Noem de resulterende objecten "Filtered Lysosomen".
  13. Gebruik de module "MaskObjects" om cellen met Coxiella kolonies te selecteren. Noem de resulterende objecten "geïnfecteerde cellen".
  14. Gebruik de module "Relate Objects" om de objecten "Gefilterd CCV" als kinderen van de bovenliggende objecten "Cellen" set. Hierdoor kan het tellen van het aantal CCV / Cell.
  15. Gebruik de module "Relate Objects" om de objecten "Gefilterd Kolonies" als kinderen van de bovenliggende objecten "Cellen" set. Dit zaltoestaan ​​dat het tellen van het aantal kolonies / Cell.
  16. Gebruik de module "Relate Objects" om de objecten "Filtered Lysosomen" ingesteld als kinderen van de bovenliggende objecten "Cells". Hierdoor kan het tellen van het aantal Lysosomen / Cell.
  17. Gebruik de module "MeasureObjectSizeShape" naar een morfologische analyse van de kernen, Cells, Gefilterd CCV, Gefilterd Koloniën en Filtered Lysosomen verkrijgen
  18. Gebruik de module "MeasureObjectIntensity" om de GFP fluorescentie geassocieerd met Filtered CCV kwantificeren en schat de efficiëntie van Coxiella replicatie binnen CCV.
  19. Met behulp van de modules "OverlayOutlines" en "SaveImages" overlay de segmentatie resultaten en de oorspronkelijke afbeelding voor de kwaliteitscontrole van de.
  20. Gebruik de module "ExportToSpreadsheet" om alle of een selectie van de resultaten beeldanalyse exporteren.
  21. (Optioneel) Gebruik de module "ExportToDatabase" om de resultaten te analyserenmet behulp van de software CellProfiler Analyst.

7. Data Analysis

  1. Voor elke parameter verkregen, te identificeren en te elimineren uitschieters (door fouten in beeldsegmentatie) bereken dan de gemiddelde waarden per mutant.
  2. Gebruik Z-scores significant fenotypes te identificeren. Overweeg fenotypes met een Z-score> -2 als niet significant, fenotypen met een Z-score tussen -2 en -4 als mild en fenotypes met een Z-score ≤ -4 zo sterk.
  3. Plot combinaties van parameters volgens de experimentele behoeften.

Representative Results

Na isolatie van transposon mutanten enkele primer kolonie-PCR is een robuuste, high-throughput werkwijze voor de plaats van transposon insertie zijn voor elke mutant. Deze aanpak haalt uit een typische geneste PCR-protocol maar hier één primer hybridiseert specifiek en / of niet-specifiek aan het matrijs-DNA afhankelijk van de stringentie van de annealing temperatuur (figuur 1A). De typische PCR producten uit meerdere DNA-fragmenten, waarvan de meeste specifieke (Figuur 1B). Het gebruik van een andere sequentie primer die direct stroomopwaarts van het transposon ITR en stroomafwaarts van de sequentie die door de amplificatie primer hybridiseert verschaft specificiteit voor de sequentiestap (figuur 1C). Geautomatiseerde software voor sequentieanalyse lijnt de verkregen sequenties de Coxiella genoom die de juiste ligging van transposon inserties (figuur 1C). Alle transposon inserties kan dan annotated de Coxiella genoom (figuur 1D).

Elke Coxiella mutant geïsoleerd en geamplificeerd in axenisch ACCM-2 medium voordat hetzij opslag of screening. Figuur 2 toont een voorbeeld van 38 transposon mutanten in 16 dot / icm Coxiella genen (Figuur 2A). Om de levensvatbaarheid van Coxiella mutanten te beoordelen, wordt axenic groeicurven verkregen door bemonstering bacterieculturen gedurende 7 dagen na inoculatie en toepassen van de bacteriële concentratie assay 1,5 (Figurie 2B) beschreven. Versterkte mutanten worden vervolgens geïncubeerd met epitheelcellen in drievoud 96-well platen gedurende 7 dagen. Alle Coxiella mutanten gegenereerd worden GFP-gelabeld, intracellulaire groeicurven worden verkregen door meting van de fluorescentie-intensiteit van GFP per put, elke 24 uur, en het uitzetten van de gemeten waarden als functie van de tijd (Figuur 2C).

Intracellulair groeicurven bieden kwantitatieve analyse van de fenotypen geassocieerd met elke transposon insertie in het genoom Coxiella. Om kwalitatieve informatie toe te voegen ongeveer hetzelfde transposon mutanten, hebben we gekozen voor geautomatiseerde beeldacquisitie en analyse. Zeven dagen na infectie platen gefixeerd, verwerkt voor immunofluorescentie zoals beschreven in 4 en toepassing van een geautomatiseerde, epifluorescentiemicroscoop zoals beschreven in 5. Geautomatiseerde beeldanalyse software zoals CellProfiler (Broad Institute, geanalyseerd www.cellprofiler.com ) verwerkt de verkregen kanalen onafhankelijk en segmenten geïdentificeerd objecten vergelijkende analyse (Figuur 3). Dit maakt de identificatie en morfologische karakterisering van gastheer celkernen, cel contouren, lysosomen en Coxiella kolonies (Figuur 3 bovenste panelen). Correleren Coxiella kolonies met cellen en lysosomen kan de identificatiop en specifieke morfologische analyse van Coxiella bevattende vacuolen (die LAMP1 positief, Figuur 3 linksonder paneel). Correleren Coxiella kolonies met gastheercel contouren maakt de identificatie en specifieke morfologische analyse van geïnfecteerde cellen (figuur 3 onderaan in het midden paneel). Tenslotte worden de 4 kanalen samengevoegd ter illustratie en kwaliteitscontrole (figuur 3 rechterbenedenhoek).

De gegevens verkregen uit geautomatiseerde beeldanalyse kunnen tegen elkaar worden uitgezet om "multi-fenotypische puntgrafieken" te verkrijgen. Als voorbeeld, in figuur 4A de gemiddelde oppervlakte (in um 2) van Coxiella kolonies uitgezet tegen het aantal kolonies per cel (Figuur 4A), teneinde mutaties die intracellulaire replicatie van Coxiella (replicatie fenotype) en / of van invloed identificeren de capaciteit van de bacteriën om gastheercellen binnenvallen (internabiliseren fenotype). Statistische analyse werd gebruikt om de regio's in de resulterende puntgrafiek overeenkomt met milde (-4 <Z-score ≤ -2) en ernstige (Z-score ≤ -4) fenotypes definiëren. Mutanten werden waargenomen bij 3 hoofdclusters: mutaties die resulteren in een gebrekkige intracellulaire groei van Coxiella werden gegroepeerd in de meest linkse gedeelte van de grafiek (Figuur 4A, roze en rode stippen); mutaties die Coxiella internalisatie in cellen beïnvloed werden gegroepeerd in het onderste gedeelte van de grafiek (Figuur 4A, licht en donker blauwe stippen) en tenslotte, groene stippen in de meest rechtse gebied van het perceel corresponderen met mutaties resulteren in niet-significante fenotypen ( Z-score> -2). Belangrijk mutanten die niet te repliceren, maar nog kunnen gastheercellen binnendringen, worden gedetecteerd na 7 dagen na infectie als enkele bacterie of kleine kolonies, naast celkernen (Figuur 4C, tweede paneel) systeem. Vandaar dat de grootte van Coxiella "colonies "aanzienlijk worden beïnvloed maar het aantal geïnfecteerde cellen wordt niet beïnvloed in vergelijking met WT Coxiella geïnfecteerde cellen. Integendeel, mutaties die het vermogen van Coxiella gastheercellen binnendringen beïnvloeden resulteren in een afname in het aantal kolonies / cel. Is dit aantal ver onder 1, betekent dit dat, gemiddeld, is er een afname van het aantal geïnfecteerde cellen. Als alternatief kan de gemiddelde oppervlakte (in um 2) van Coxiella kolonies tegen het aantal gastheercellen dat infectie (figuur 4B), wordt uitgezet mutaties die cytotoxiciteit voor Coxiella (cytotoxische fenotype) verlenen identificeren. Zoals hierboven, werd een statistische analyse gebruikt om de regio's in de resulterende puntgrafiek overeenkomt met milde (-4 <Z-score ≤ -2) en ernstige (Z-score ≤ -4) fenotypes definiëren. Het meest afgeschermde mutaties hadden geen significant effect celoverleving, ongeacht bacteriële replicatie in gastheercellen (Figuur 3B groene stippen). 37 mutaties mild aangetaste gastheercel overleving (figuur 3B, licht rode stippen), en 7 mutaties waren bijzonder schadelijk voor het hosten van de cel overleving (figuur 3B, donker rode stippen). Let op: er parameters verkregen door geautomatiseerde beeldanalyse procedure kan worden gebruikt om andere overzichten afleiden Volgens experimentele behoeften.

Figuur 1
Figuur 1:. Sequentiebepaling en annotatie van Coxiella transposon mutanten (A) Single kolonie PCR primer wordt gebruikt om DNA fragmenten die de plaats van transposon insertie amplificeren. Een amplificatieprimer (Amp) wordt gebruikt als een specifieke en niet-specifieke primer, afhankelijk van de stringentie van de hybridisatie temperatuur. (B) Typisch resultaat van enkele primer kolonie PCR. Elke reactiOp produceert een aantal fragmenten van variabele grootte, waarvan sommige het transposon insertie site; anderen worden willekeurig geamplificeerd als bijproducten van de lage stringentie PCR-cyclus. (C) Het gebruik van een primer sequentie (Seq) dat hybridiseert met het transposon functie kan de volgorde van de fragmenten van belang. (D) Sequentieanalyse software laat de automatische annotatie van transposon toevoegingen op het bacteriële genoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2:. Axenische en intracellulaire groei van Coxiella transposon mutanten (A) In de pilot scherm, hebben we geïsoleerd, gesequenced en gescreend 38 transposon mutanten kern 16 genes van de Coxiella dot / icm secretie systeem (aangegeven in rood). (B) Teneinde de levensvatbaarheid van elk transposon mutant te beoordelen, de groei van elk isolaat in axenische kweekmedium wordt gevolgd gedurende 8 dagen onder toepassing van een fluorescent gelabeld DNA intercalatiemiddel. (C) Elke mutant wordt vervolgens gebruikt om epitheelcellen te infecteren. Omdat de transposon bezit een GFP cassette, wordt de intracellulaire groei van bacteriën dan 7 dagen van de infectie gecontroleerd door de variaties van GFP fluorescentie geassocieerd met Coxiella replicatie, met behulp van een microplaat reader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Geautomatiseerde beeldanalyse van Coxiella infecties Een auto.Gekoppelde epifluorescentie microscoop wordt gebruikt om de afbeelding 21 posities per putje van 96 triplo-putjes. Het beeld analyse software segmenten objecten in elke verworven kanalen voor kwantificering en analyse. In alle gevallen worden de voorwerpen rand van de beelden raken uitgesloten. (A) De Hoechst kanaal wordt gebruikt om gastheercellen te identificeren kernen (omcirkeld in groen). (B) Deze worden gebruikt als zaden gastheercel contouren in het Cy3 kanaal te identificeren (de positie van de kernen wordt omcirkeld in blauw, cel contouren zijn in het groen). (C) De Cy5 kanaal wordt gebruikt om LAMP1-positieve compartimenten te identificeren (omcirkeld in groen); alleen de objecten opgenomen in de eerder geïdentificeerde cel contouren (in het rood) worden bewaard voor beeldanalyse. (D) De GFP-kanaal wordt gebruikt om Coxiella kolonies te identificeren (omcirkeld in groen). (E) Correleren Coxiella kolonies met LAMP1-positieve compartimenten maakt de identificatie van Coxiella (F) Correleren Coxiella kolonies met mobiele contouren maakt de identificatie van geïnfecteerde cellen (pseudocolored). (G) beelden die in de 4 fluorescentie kanalen (corresponderend met Coxiella kolonies (groen) talrijke celkernen (blauw), de gastheercel plasmamembraan (grijs), LAMP1-positief compartimenten (red)) worden samengevoegd en gebruikt voor illustratie en kwaliteit control. Schaal bars 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: Grootschalige identificatie van Coxiella factoren betrokken bij gastheer / ziekteverwekker interactionen. (A) De gemiddelde oppervlakte (in um 2) van Coxiella kolonies uitgezet tegen het relatieve aantal kolonies per cel replicatie en internalisatie fenotypen van belang te identificeren. Groene stippen vertegenwoordigen fenotypes die afwijken van WT Coxiella door een Z-score> -2 (niet significant). Roze en licht blauwe stippen vertegenwoordigen replicatie en internalisatie fenotypes respectievelijk met een Z-score tussen -2 en -4 (mild fenotypes). Rode en donker blauwe stippen vertegenwoordigen fenotypes met een Z-score ≤ -4 (sterke fenotypes). (B) De gemiddelde oppervlakte (in um 2) van Coxiella kolonies werd uitgezet tegen het aantal cellen (geïnfecteerd en niet geïnfecteerd) die 7 dagen na infectie overleefden het schatten van de cytotoxische werking voortvloeiende uit transposon inserties. Groene stippen vertegenwoordigen fenotypes die afwijken van WT Coxiella door een Z-score> -2 (niet significant). Roze stippen vertegenwoordigen cytotoxische phenotypes met een Z-score tussen -2 en -4 (mild fenotypes). Rode stippen vertegenwoordigen cytotoxische fenotypes met een Z-score ≤ -4 (sterke fenotypes). Pijlen geven mutanten blijkt uit de overeenkomstige kleine letter C. (C) Representatieve beelden van replicatie, internalisatie en cytotoxische fenotypes. In alle gevallen gastheercel kernen in rood, Coxiella kolonies in groen. Schaal bars 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De studie host / pathogen interactions heeft bewezen een opmerkelijke methode om bacteriële infecties te begrijpen en alternatieve strategieën om infectieziekten teller. Vanwege de verscheidenheid aan strategieën, door verschillende bacteriële pathogenen, de identificatie en karakterisering van bacteriële virulentiefactoren en de ontvangende signaalroutes die zijn gericht bij infecties vormen een uitdaging. Dit vraagt ​​om de ontwikkeling van nieuwe benaderingen voor de grootschalige identificatie van de belangrijkste gastheer / ziekteverwekker interactie hubs. De recente ontwikkeling van innovatieve, high-throughput en high content technieken vertegenwoordigt een waardevolle grondstof die kan worden aangepast aan de studie van intracellulaire bacteriële pathogenen 15. Hier hebben we de zoönotische bacteriële ziekteverwekker Coxiella burnetii gebruikt als model voor selectie technieken die transposon mutagenese en fluorescentie gebaseerde assays combineren ontwikkelen. ImportanTLY, laat deze screening methode de gelijktijdige monitoring van meerdere stappen van de Coxiella intracellulaire cyclus, het verstrekken van een globaal overzicht van de strategieën ontwikkeld door deze bacterie binnen te vallen, te repliceren en blijven binnen de geïnfecteerde cellen.

De hier beschreven benadering is gebaseerd op twee gevestigde technieken, transposon mutagenese en fluorescentie gebaseerde assays, die met succes toegepast op de studie van bacteriële pathogenen. De combinatie van deze technieken in de context van high-throughput / high content schermen kunnen wij de effecten van een groot aantal bacteriële mutaties te beoordelen door het analyseren van een zeer groot aantal events (typisch 15.000 geïnfecteerde cellen per bacteriële mutaties worden afgebeeld en geanalyseerd). Dit levert een belangrijke statistische analyse van gebeurtenissen zoals bacteriële invasie van gastheercellen en intracellulaire replicatie, die, van nature, aan hoge variabiliteit. Het is belangrijk op te merken dat andere dan ep cellijnenithelial kan worden gebruikt voor dit type onderzoek. Echter, vlakke en grote epitheelcellen zijn optimaal voor beeldanalyse als gastheer celorganellen gemakkelijker te detecteren. Omdat de meeste geautomatiseerde microscopen automatisch kan omgaan met een groot aantal platen, er praktisch geen beperkingen aan het aantal mutanten die tegelijkertijd kunnen worden gescreend. Afhankelijk van de pathogeen, de gebruiker privilege het gebruik van een epifluorescentie of confocale microscoop. Het tijdstip van beeldacquisitie zal vooral afhangen van de gevoeligheid van de microscoop camera, het aantal verworven per putje en het aantal kanalen verworven per veld gebieden. De gebruiker kan bepalen hoe deze factoren aan te passen aan de screening protocol te optimaliseren. Als voorbeeld, we imaged een 96-putjesplaat / hr met behulp van de onder 5.1 omstandigheden. Beeldanalyse grotendeels afhankelijk van de machine (of cluster van machines) gebruikt. We maken gebruik van een 12-kern (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 GB RAM werkstation. Deze machine vereist onderlingeveer 40 min tot beelden die van de ene plaat te analyseren.

Een belangrijk aspect waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwikkelen van deze assays is het opzetten van een nieuw (of het optimaliseren van bestaande) protocollen voor het manipuleren en verwerken van een groot aantal monsters mogelijk. Een kenmerkend voorbeeld is de ontwikkeling van de enkelvoudige primer kolonie-PCR benadering, waardoor we snel amplificeren sequentie en Coxiella DNA fragmenten die de plaats van invoeging van elk transposon, van zeer kleine monsters. Op basis van onze ervaring, de high-fidelity polymerase moet zorgvuldig worden geselecteerd en getest om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. De enige beperking van deze benadering kan verbergen in de waarneming dat, in de meeste gevallen ongeveer 30% van de verwerkte monsters geen misbruik, hetzij als gevolg van de PCR of sequentiebepaling stappen. Echter, gezien het feit dat de isolatie van nieuwe Coxiella transposon mutanten is geen snelheidsbeperkende stap, betekent dit niet vertegenstuurde een groot probleem. Evenzo heeft het ontwikkelen van een betrouwbare bepaling om de bacteriële concentratie van mutant bestanden kwantificeren pijl op deze aanpak. Vanwege de neiging van Coxiella om te aggregeren wanneer in suspensie is het gebruik van optische dichtheid niet geldt voor de concentratie van Coxiella culturen en de enige bestaande alternatief was kwantitatieve PCR (qPCR) berekenen. Hier is het gebruik van een fluorescent gelabeld DNA intercalatiemiddel aanzienlijk versneld bacteriën kwantificering.

Deze benadering kan ook gebruik maken van het gebruik van stabiele cellijnen die fluorescente merkers voor verschillende intracellulaire compartimenten naargelang het pathogeen gebruikt. Een ander belangrijk aspect is de toepassing van celkweekmedium zonder fenolrood. We vonden dat deze pH indicator een natuurlijke fluorescentie verspreid over de rode en groene spectrum dat het signaal dat op de geautomatiseerde fluorescentielezer verzadigd.

THij strategie hier gepresenteerde berust op willekeurige transposon mutagenese. Voor de mutanten van belang, raden wij valideren unieke omzettingen (en klonaliteit) met behulp van Southern blot en PCR amplificaties van de transposon inbrengplaats.

Naast de in de sectie protocol beschreven apparatuur, teams die geïnteresseerd zijn in het gebruik van de screening aanpak hier wordt gepresenteerd, zal groot voordeel in de set-up van een relationele database voor het verzamelen van gegevens, een server voor data-opslag en een werkstation voor snelle beeldanalyse.

Belangrijk is dat de werkwijze die hier beschreven is geschikt voor de studie van andere intracellulaire bacteriële pathogenen verschaft een random mutagenese methode bestaat voor het pathogeen, kunnen cellijnen geïnfecteerd met het pathogeen en deze toont een specifiek fenotype tijdens infectie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Citric acid Sigma C0759-500G ACCM-2 medium component
Sodium citrate Sigma S4641-500G ACCM-2 medium component
Potassium phosphate Sigma 60218-100G ACCM-2 medium component
Magnesium chloride Sigma M2670-100G ACCM-2 medium component
Calcium chloride Sigma C5080-500G ACCM-2 medium component
Iron sulfate Sigma F8633-250G ACCM-2 medium component
Sodium chloride Sigma S9625-500G ACCM-2 medium component
L-cysteine Sigma C6852-25G ACCM-2 medium component
Bacto Neopeptone BD (Beckton-Dickinson) 211681 ACCM-2 medium component
Casamino acids BD (Beckton-Dickinson) 223050 ACCM-2 medium component
Methyl-B-cyclodextrin Sigma C4555-10G ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax Gibco 61870-010 ACCM-2 medium component
RPMI w/glutamax, without phenol red Gibco 32404-014 For cell culture and infection
Fetal bovine serum GE healthcare SH30071 For cell culture
Trypsin EDTA (0.25%) Life Technologies 25200-056 For cell culture
Saponin Sigma 47036 For immunofluorescence staining
Ammonium chloride Sigma A9434 For immunofluorescence staining
Bovine serum albumin Sigma A2153 For immunofluorescence staining
Electroporation cuvette 0.1 cm Eurogentec ce0001-50 For Coxiella transformation
Trackmates screw top tubes with caps Thermo Scientific 3741 2D barcoded screwcap
96-well microplate with black walls and bottom Greiner 655076 Flat dark bottom, for dsDNA quantitation
96-well PCR microplate Biorad 2239441 DNAse/RNAse free
96-well plate, deepwell Labcon 949481 For Coxiella mutants infections
PicoGreen Life Technologies P7581 For dsDNA quantitation
Triton X-100 Sigma T9284-500ML For dsDNA quantitation
Phusion high fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530L For single primer colony PCR
Celltracker Red CMTPX Life Technologies C34552 For imaging
Anti-LAMP1 antibody Sigma 94403-1ML For immunofluorescence staining
Hoechst 33258 Sigma L1418 For imaging
Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro Tecan
Epifluorescence automated microscope Cellomics Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maurin, M., Raoult, D. Q fever. Clinical microbiology reviews. 12, (4), 518-553 (1999).
  2. Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States. Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).
  3. Kazar, J. Coxiella burnetii. infection. Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).
  5. Der Hoek, W. V. an, et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).
  6. Capo, C., et al. Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3. Journal of immunology. 163, (11), Baltimore, Md. 6078-6085 (1999).
  7. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS pathogens. 10, (3), e1004013 (2014).
  8. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Berón, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell. Cellular microbiology. 9, (4), 891-909 (2007).
  9. Newton, H. J., Mcdonough, J. a, Roy, C. R. Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole. PloS one. 8, (1), e54566 (2013).
  10. Vogel, J. P. Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii. Trends in microbiology. 12, (3), 103-105 (2004).
  11. Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii. Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).
  12. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. mBio. 2, (2011).
  13. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium. Applied and environmental microbiology. 77, (11), 3720-3725 (2011).
  14. Beare, P. a, Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Frontiers in microbiology. 2, (May), 97 (2011).
  15. Brodin, P., Christophe, T. High-content screening in infectious diseases. Current opinion in chemical biology. 15, (4), 534-539 (2011).
Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martinez, E., Cantet, F., Bonazzi, M. Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants. J. Vis. Exp. (99), e52851, doi:10.3791/52851 (2015).More

Martinez, E., Cantet, F., Bonazzi, M. Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants. J. Vis. Exp. (99), e52851, doi:10.3791/52851 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter