Summary
Utilisation de haute résolution contraste d'interférence différentiel (DIC) microscopie, un ex vivo observation du battement des cils épendymaire mobiles situés dans les ventricules du cerveau de souris est démontrée par live-imagerie. La technique permet un enregistrement de l'unique fréquence ciliaire battant et l'angle battant ainsi que leurs propriétés calcium intracellulaire oscillation de stimulation.
Abstract
Cellules épendymaires multiciliées bordent les ventricules dans le cerveau adulte. La fonction anormale ou de la structure des cils épendymaire est associé à divers déficits neurologiques. Le courant ex vivo l'imagerie en direct de la technique de cils épendymaire mobiles permet une étude détaillée de la dynamique ciliaires suit plusieurs étapes. Ces mesures comprennent: l'euthanasie des souris avec du dioxyde de carbone selon les protocoles de l'Université du institutionnels de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) de Tolède; craniectomy suivie de l'élimination du cerveau et sagittale dissection du cerveau avec un vibratome ou lame tranchante pour obtenir sections très minces à travers les ventricules latéraux du cerveau, où les cils épendymaire peuvent être visualisées. L'incubation des tranches du cerveau dans une plaque à fond de verre personnalisé contenant milieu de Eagle modifié (DMEM) / Haut-glucose de Dulbecco à 37 ° C en présence de 95% / 5% O / CO 2 mélange 2 est essentiel de garder le tissu vivant pendantl'expérience. Une vidéo du battement de cils est alors enregistrée en utilisant une haute résolution contraste d'interférence différentiel microscope. La vidéo est ensuite analysé image par image pour calculer la fréquence ciliaire battant. Cela permet la classification distincte des cellules épendymaires en trois catégories ou types en fonction de leur fréquence ciliaire battant et l'angle. En outre, cette technique permet l'utilisation de l'analyse d'imagerie de fluorescence à grande vitesse pour caractériser les propriétés uniques intracellulaires d'oscillation de calcium de cellules épendymaires, ainsi que l'effet des agents pharmacologiques sur les oscillations de calcium et la fréquence ciliaire battant. De plus, cette technique est adaptée pour l'imagerie par immunofluorescence pour des études de structure de protéine ciliaire ciliaire et localisation. Ceci est particulièrement important dans les études de diagnostic et de phénotype maladie. La principale limitation de la technique est attribuée à la diminution de la circulation en direct de cils mobiles comme les tissus du cerveau commence à mourir.
Introduction
Les cils sont des organites à base de microtubules sensoriels qui se prolongent à partir de la surface cellulaire dans l'environnement extracellulaire. Selon leur organisation des microtubules, les cils peuvent être classés en deux types - "9 + 0» ou «9 + 2". Sur le plan fonctionnel, en fonction de leur mobilité, elles peuvent être classées comme mobiles ou non mobiles cils 1. Cils primaires est un terme couramment utilisé pour désigner «9 + 0" cils non mobiles. Celles-ci ont neuf microtubules doublets parallèles (désignés par '9') et une paire centrale de microtubules est absent à l'intérieur de la gaine centrale (notée "0"). Toutefois, certains «9 + 0" cils, comme cils nodale, qui règlent l'embryon latéralité sont mobiles 2. D'autre part, les cils mobiles sont caractérisés, en plus des neuf doublets de microtubules parallèles, par une paire de doublets central supplémentaire des microtubules et associé à des protéines motrices de la dynéine pour faciliter la motilité. En outre, certains "9+2 "Cils tels que les cils olfactifs sont non mobiles 3. Cellules épendymaires bordant les ventricules cérébraux et le canal central de la moelle épinière sont caractérisés par ce que les franges sont mobiles à propulser le liquide céphalo-rachidien (LCR) le long des quatre ventricules du cerveau.
L'objectif global de cette méthode est de faciliter l'étude de la dynamique des cils mobiles et des anomalies structurelles. La santé et le développement du cerveau dépendent fortement sur la circulation efficace des CSF dans les ventricules cérébraux. Par exemple, les flux de CSF normale et l'équilibre des fluides exigent battement normal et cils épendymaire fonctionnelle 5,6, qui à son tour jouer un rôle critique dans la régulation du mouvement directionnel des cellules neuronales et la migration des cellules souches 7. En tant que tel, la fonction des cils épendymaire anormale ou une structure peut conduire à l'écoulement de CSF anormale, qui est associé à une hydrocéphalie, une condition médicale dans laquelle il ya une accumulation anormale de CSF dans les ventricules du bpluie. Cela peut par conséquent entraîner une augmentation de la pression intracrânienne et l'élargissement progressif de la tête, convulsions, vision en tunnel, et la déficience mentale 8.
Les avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'il a permis pour la première fois de signaler trois types de cellules épendymaires distinctes: I, II, et III, en fonction de leur fréquence ciliaire battant unique et angle de battre. Ces cellules épendymaires sont localisées à l'intérieur de certaines régions dans les ventricules du cerveau. En outre, les effets de l'âge et des agents pharmacologiques tels que l'alcool et cilostazol sur la modification des types de cellules épendymaires ou leurs localisations peuvent être démontrés, ce qui était impossible avant cette classification des cellules épendymaires. Le cilostazol est un inhibiteur de la phosphodiestérase-3, une enzyme qui métabolise l'AMPc en AMP et il régule également calcium intracellulaire 9. En utilisant l'analyse de l'imagerie de fluorescence à haute vitesse permet l'imagerie et à la quantification de l'intracellulaire uniquespropriétés d'oscillation de calcium des cellules épendymaires. Par exemple, l'alcool et cilostazol modifiées de manière significative la fréquence ciliaire épendymaire battant ainsi que les oscillations de calcium intracellulaire propriétés qui, à son tour, pourrait conduire à un changement dans le volume de remplacement liquide céphalo-rachidien par cils épendymaire 10. En résumé, cette technique a été la clé pour fournir la première preuve de trois types distincts de cellules épendymaires avec différentes propriétés d'oscillation de calcium.
Dans la section suivante, un aperçu détaillé étape par étape de la procédure est prévue, en accordant une attention particulière à la préparation des tissus et de la manutention.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les procédures pour l'utilisation des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) de l'Université de Toledo, conformément aux directives du Comité soin et l'utilisation institutionnelle animal aux National Institutes of Health et le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
1. Extraction du cerveau, le sectionnement et de tissus Préparation
- Sacrifiez-souche de type sauvage de la souris C57BL / 6 par euthanasie profondément avec le CO 2 asphyxie pendant 5 min. Assurer la mort par dislocation cervicale.
- Nettoyez la tête de souris avec 70% d'éthanol.
- Effectuer craniectomy l'aide de ciseaux et des pinces stériles d'abord en tirant la peau de, en commençant par le haut de la tête pour exposer le crâne.
- Puis, quand le crâne est exposé, éliminer le crâne par pelage la pièce par pièce osseuse, à partir du côté postérieur et se déplaçant vers le côté antérieur. Soyez prudent de ne pas détruire les ventricules du cerveau.
- Recueillir l'ensemble du cerveau.
- Placer le cerveau dans une boîte de 100 mm de Pétri contenant du milieu DMEM / haut-glucose supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et une solution de pénicilline / streptomycine 1% contenant 10 000 unités / ml de pénicilline et 10 000 ug / ml de streptomycine et préchauffé à 37 ° C.
- Trancher le cerveau sur le plan sagittal médian à la main avec une lame tranchante, et d'obtenir la première section de 100-200 mm de chaque moitié en utilisant un vibratome.
- Rincer le tissu cérébral avec une solution saline tamponnée au phosphate C (1x PBS) préchauffé à 37 °.
- Placer immédiatement la section du cerveau dans du DMEM / media Haute-Glucose préchauffé à 37 ° C.
2. Configuration d'imagerie en direct et configuration
- Placez les coupes de tissus du cerveau dans des boîtes de culture à fond de verre de 30 mm contenant 1 ml de DMEM / médias haute-glucose. Réglez l'environnement de la chambre fermée de microscope à 37 ° C, 95% / 5% de O 2 / CO 2 contenu (Figure 1
- En utilisant un objectif 60X lentille à immersion d'huile, de recueillir les cellules épendymaires / images de cils en plaçant d'abord une goutte d'huile sur la 60X objectif et se concentrant sur les cellules avec régulière DIC lumière transmise.
- Ensuite, suivez la direction du mouvement de la bulle DMEM comme un guide pour l'emplacement des cils épendymaire mobiles comme les coups ciliaires créent une sorte de mouvement de bulle dans la zone. Choisissez une zone contenant des cellules saines de cils mobiles dans le ventricule latéral du cerveau en utilisant le filtre DIC. Une fois les cils épendymaire sont trouvés, ajuster la lumière et de se concentrer pour obtenir une image satisfaisante.
- Définissez les paramètres d'imagerie en direct selon un but précis en utilisant un logiciel d'imagerie Metamorph. Dans la présente démonstration, d'acquérir vingt-quatre bits images avec la caméra binning mis à 1 x 1 combiné avec 60X objective et 5-10 ms temps d'exposition.
- Recueillir les images DIC en ouvrant l'ouverture de microscope à un niveau optimal afin d'avoir une exp minimumOsure temps. Respecter les flux des images en direct à la caméra pour permettre l'acquisition d'image rapide et immédiate sans délai. Calculer la vitesse de battement des cils sur la base de l'exigence des temps d'exposition minimum pour obtenir un contraste d'image suffisante.
3. Visualisation et analyse de données
- Calculer le nombre de coups de cils en comptant le nombre de coups en 1 min. Pour ce faire, en diminuant la vitesse de la vidéo et de compter le nombre de battements en utilisant un compteur de cellules ou un outil similaire.
- Pour calculer la fréquence des passages à tabac, multiplier le temps d'exposition au cours de laquelle la vidéo est enregistrée par le nombre de cadres ou d'images time-lapse acquis pour obtenir le nombre de sec. (Exemple: temps d'exposition 5 ms 200 images = 1,000 ms ou 1 sec).
- Calculer le nombre de coups par seconde pour obtenir la fréquence qui est exprimée par le nombre de coups par un sec. Pour ce faire, en divisant le nombre de coups de cils plus d'une seconde entre tempsval (Exemple: cils bat 50 fois dans une vidéo de 200 images enregistrées au temps d'exposition de 5 ms soit 5 ms x 200 images = 1 sec; désormais diviser 50 battements par 1 sec = 50 Hz).
- Calculer l'angle ciliaire battant en évaluant le chemin emprunté par les cils épendymaire pendant les deux coups de puissance et de récupération. Effectuez cette selon une méthode décrite précédemment, avec des modifications mineures 11. La précision du mouvement des cils individu est observée au cours du cycle complet de battement.
- Sur une feuille d'acétate placé sur le moniteur, tracez une ligne horizontale le long du bord épendymaire et une ligne verticale à travers la position médiane des cils au début de la course de puissance.
- Tracer la position précise du cadre de cil par image comme il se déplace vers l'avant pendant la course de puissance. D'une manière similaire, tracer le mouvement des cils lors de la course de récupération.
- Calculer l'angle ciliaire raclée de la déviation maximale du cil de la ligne médiane lors de til course de puissance ainsi que la course de récupération.
4. Calcium enregistrement d'un signal
- Après trancher le cerveau, rincer rapidement la tranche de cerveau avec 1x PBS ou du PBS de Dulbecco (pH 7,0). Préparer une solution fraîche Fluo-2 pour éviter l'extinction de fluorescence et d'obtenir un bon rapport signal-sur-bruit.
- Préparer mM solution 1 de Fluo-2 solution dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), mélanger et vortex la solution pendant au moins 5 minutes afin de garantir Fluo-2 est homogène dissous dans du DMSO.
- Diluer la solution mère de Fluo-2 dans 500 ml de DMEM / haut-glucose supplémenté avec 2% de B27 préchauffée à 37 ° C jusqu'à une concentration finale de 20 mg / ml.
NOTE: B-27 est un supplément gratuit de sérum optimisé contenant de la vitamine A, cocktail antioxydant et de l'insuline utilisé pour soutenir la viabilité à court ou à long terme de l'hippocampe et d'autres neurones du SNC. - Incuber immédiatement la tranche de cerveau avec 20 mg / ml Fluo-2 pendant 30 min à 37 ° C dans une plaque à fond de verre.
- Pour déterminer la concentration de charge optimal de fluorophore de calcium Fluo-2 et pour éviter la toxicité de cellules de colorant de calcium, les cellules de provocation avec de l'ATP, et de vérifier la viabilité des cellules en déterminant le déroulement dans le temps et l'amplitude de crête de signaux de calcium en réponse à l'ATP.
- Noter la vidéo pour l'oscillation de calcium à un taux de capture de 5 ms pour un minimum de 1 seconde (200 images par seconde), avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 488 nm et 515 nm, respectivement (film 2).
- Pour distinguer le signal Fluo-2 de calcium autofluorescence ou mouvement artefacts, veiller à ce que les intensités émises à 515 nm sont surveillés séparément.
REMARQUE: Fluo-2 ne soit pas la fluoremetric de calcium apte à quantifier calcium intracellulaire. Cependant, il est d'une excellente dynamique colorant de calcium pour détecter des changements rapides de calcium, tels que les oscillations de calcium. Pour la quantification de calcium plus précis, Fura-2 est recommandé. Cependant, les changements dynamiques de Fura-2 sont limitées par son ratiométriquenature du colorant. - Suivez les formules fournies par le fabricant pour calculer les valeurs de calcium intracellulaires libres exactes. Exemple [Ca 2+] = K d × (R - R min) / (R max - R). Où Kd est la constante de dissociation du colorant libéré à partir du calcium, R est la fluorescence mesurée à 488, et R et R min max sont les rapports de fluorescence à minimum et maximum de concentration 12 ionique.
5. immunofluorescence Microscopie
- Fixer les coupes de cerveau avec une solution saline tamponnée au phosphate contenant 4% de paraformaldehyde (PFA) et 2% de saccharose pendant 10 min. Alternativement, fixer l'ensemble du cerveau à l'article PFA, puis 4% en sections de 50 mm en utilisant un cryostat.
- Laver le tissu trois fois avec PBS 1x pendant 5 minutes à chaque fois.
- Incuber la tranche de cerveau avec une solutià 0,1% de Triton-X dans 1 x PBS pendant 5 minutes, puis rincer trois fois avec du 1 x PBS pendant 5 min à chaque fois.
- Incuber la tranche de cerveau avec un anticorps primaire de souris, antiacetylated a-tubuline, utilisé à une dilution de 1: 5000 dans 10% de FBS dans du PBS 1x pendant une heure à température ambiante (TA) ou une nuit à 4 ° C.
- Laver le tissu trois fois avec PBS 1x pendant 5 minutes à chaque fois.
- Incuber la tranche de cerveau dans un anticorps secondaire anti-IgG de souris fluorescéine à une dilution de 1: 500 dans 10% de FBS dans du PBS 1x solution pendant 1 heure à température ambiante.
- Avant d'observation sous un microscope à fluorescence, contre-coloration avec la section 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 minutes pour colorer le noyau (ou ADN) 13. Pour minimiser photoblanchiment, l'image des sections immédiatement avec un minimum de temps possible de l'exposition.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mesure de la fonction des cils épendymaire dans le cerveau de souris en direct
La méthode décrite dans ce protocole est utilisé pour surveiller la fonction des cils épendymaire et de la structure dans le tissu frais disséqué à partir du cerveau de la souris ainsi que pour surveiller et étudier cils fréquence de battement. Les étapes suivies pour réaliser une expérience complète sont représentés sur un diagramme schématique (figure 1). Il est fortement recommandé que l'expérience est menée dans un court laps de temps afin de garder les cils mobiles aussi actif que possible. Un film et des images de cellules épendymaires et leurs cils mobiles time-lapse représentant sont également présentés (Film 1 et la figure 2a). L'analyse des données dans le flux obtenu est accomplie en comptant le motif de coups et l'angle des cils en mouvement. Les critères pour diviser les cils en trois types sont présentés dans le tableau 1. La présence de cils épendymaire est confirmé avec un marqueur ciliaire, acétyle-a-tubuline, et les cellules épendymaires sont DAPI (marqueur de l'ADN) pour montrer le noyau (Figure 2b). Selon nos observations de cellules épendymaires dans le ventricule latéral du cerveau à partir d'au moins 22 expériences indépendantes, nous avons pu classer les cellules épendymaires en trois types en fonction de leur fréquence ciliaire battant. De plus, nous avons démontré que l'éthanol à une concentration de 0,25% réprimée de façon significative la fréquence cils battant indépendamment de leur type (Figure 3). Plus important encore, ces données sont en cohérence avec nos résultats précédents 10.
Mesurer la signalisation du calcium par les cils épendymaire
Il a été précédemment montré que la flexion des cils peut déclencher un cil calcium intracellulaire dépendant de signalisation 14-16. Cette technique permet aux chercheurs d'étudier et de mesurer le signal du calcium intracellulaire dans les ventricules du cerveau
Figure 1:. Épendymaire cils protocole d'imagerie organigramme cils épendymaire protocole d'imagerie illustre étapes pour terminer une expérience à partir de brainextraction de la souris, la coupe et la préparation des tissus à l'acquisition et l'analyse d'images. Une chronologie approximative d'une heure est présenté à la procédure étape par étape.
e 2 "src =" / files / ftp_upload / 52853 / 52853fig2.jpg "/>
Figure 2:. Épendymaire localisation de cils dans les ventricules du cerveau voit ici sont des cellules épendymaires du ventricule latéral du cerveau de la souris. (A) des images DIC de cellules individuelles épendymaires (flèches en bas) et des cils (les flèches du haut) sont présentés. (B) Une image de superposition d'une section du cerveau est coloré avec un anticorps dirigé contre un marqueur ciliaire, acétyle a-tubuline, représenté en vert (flèches du haut), et contre-avec un marqueur nucléaire / ADN, DAPI, représenté en bleu (flèches en bas) . S'il vous plaît noter que les panneaux a et b représentent des sections différentes du cerveau.
Figure 3:. Alcool et les différences de cils battant fréquences entre les différents types de cellules épendymaires du ventricule latéral du cerveau de la souris L'ex vivo tranche de cerveau a été incubé sans (contrôle) ou avec (ETHANOL) 0,25% d'alcool pendant 5 min. Comparé à un contrôle, traitement de l'alcool a diminué de manière significative cils fréquence de battement, comme indiqué par un astérisque. Au moins 10/05 préparations indépendantes ont été utilisées pour chaque groupe de traitement et le type cellule épendymaire.
Film 1: Enregistrement des cils épendymaire dans des cellules de type épendymales III Voici les enregistrements de cils épendymaire, caractérisé en battant la fréquence et l'angle unique de type III cellules épendymaires du troisième ventricule du cerveau.. Ce chiffre a été rapporté précédemment 10 et a été réutilisé avec sa permission.
Film 2: intracellulaire oscillation de calcium dans les cellules épendymaires Montré ici sont des enregistrements d'oscillations de calcium des cellules épendymaires à travers une section de ven latéral du cerveau.tricle après incubation de la tranche de cerveau avec 20 mg / ml indicateur de calcium, Fluo-2, pendant 30 min à 37 ° C. Le niveau de calcium de la section du cerveau a été étudié et coloré pseudo. La barre de couleur indique le niveau de calcium des cellules épendymaires; où le noir-violet et rouge-jaune représente les niveaux de calcium bas et haut, respectivement. Pour la quantification intracellulaire de calcium, le calcium cellulaire épendymaire est calculée à partir de plusieurs cellules épendymaires individuels, comme mentionné dans le texte du protocole et en moyenne entre les groupes témoins et de traitement. La vidéo d'oscillation de calcium a été observée à 200 images par seconde avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 488 nm et 515 nm, respectivement. Ce chiffre a été rapporté précédemment 10 et a été réutilisé avec sa permission.
| Type de cellule épendymaire | Cilia fréquence de battement | Cilia angle de battement |
| Type I | > 60 Hz | <90 ° |
| Type II | 30-60 Hz | 90-135 ° |
| Type III | <30 Hz | > 135 ° |
Tableau 1:. Types de cils épendymaire La classification des cils épendymaire en type I, II ou III reposait principalement sur la fréquence de battement et l'angle de cils épendymaire situé à l'intérieur des régions distinctes du troisième ventricule du cerveau battre. Parties de ces données ont déjà été publiées et ont été réutilisés ici avec permission.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
On décrit ici est un protocole de préparation de tissu de cerveau de souris à la fois pour l'imagerie en temps réel, et la microscopie de fluorescence qui fournit une observation attentive rapide et sensible des cils épendymaire dans les ventricules du cerveau. Cette technique ne se limite pas au seul ventricule latéral; il pourrait être utilisé pour observer les franges dans une autre ventricules du cerveau. Cette technique d'imagerie fournit un flux en direct qui ressemble le mouvement de la CSF par battement ciliaire dans un cadre ex vivo. En outre, il permet d'analyser le mouvement directionnel des cils. Ceci est principalement facilitée par l'utilisation d'une haute résolution et DIC Système d'imagerie par fluorescence. Un avantage de ce système est que le microscope est enfermé dans une enceinte climatique, ce qui permet une régulation fine de la température, l'humidité et la concentration de CO 2. Ce sont des paramètres très importants qui devraient être considérés pour la survie des cellules et des tissus lors de l'exécution imagerie exper en directmodes de. Le système est également équipé de modules XY et Z automatiques ainsi que d'une caméra de commutation de longueur d'onde et le filtre numérique, qui sont tous des caractéristiques importantes pour faciliter l'imagerie de comportements cellulaires dynamiques tels que des mouvements de cils. Le microscope est connecté à un ordinateur et l'acquisition d'images de haute qualité est facilitée par logiciel d'imagerie.
En utilisant cette technique pour classer les cellules épendymaires en types distincts offre une avancée significative par rapport aux méthodes existantes / précédentes utilisées pour étudier cils épendymaire. Par exemple, l'effet de certains agents pharmacologiques ou toxiques tels que l'alcool pourrait être contraire minimisé ou annulé si les cellules épendymaires sont considérés comme une population 17. Il est important de garder à l'esprit que, malgré le fait que les caractéristiques des cils battant fréquences et les angles sont très différents entre ces trois types de cils épendymaire, nous venons juste de commencer à comprendre la physiologie de ces cellules. Par Conséquent, Selon nos travaux précédents, notre classification est assez robuste si la procédure est effectuée correctement, comme décrit dans ce protocole.
Identifier les cils épendymaire distincte est fondamentalement important d'acquérir une compréhension de base de la physiologie épendymaire. Cette méthode permet de distinguer entre trois types distincts de cellules épendymaires unique et spécifique positionnés dans le troisième ventricule en ce qui concerne la fréquence de battement et de l'angle, conduisant à la classification en trois types différents (tableau 1). Afin de confirmer que les différences de cils qui battent fréquences ne sont pas dues à des différences de viabilité des cellules épendymaires ou des différences dans l'âge de l'animal, il est recommandé que les bandes épendymaires ou des tranches uniquement intactes et non détachées qui sont attachés au tissu neuronal et à moins 100 mm d'épaisseur sont utilisés. En outre, ciliaire fréquence de battement doit être mesurée à différents endroits le long de chaque section épendymaire. Nous avons précédemment démontré que les données de fréquence des battements ciliaires générés en utilisant cette technique a toujours été reproductible entre 87 10 observations expérimentales. Par conséquent, les cellules épendymaires sont classés avec précision en fonction de leur battement ciliaire. En outre, lors de l'utilisation des agents pharmacologiques qui sont connus pour diminuer la fréquence ciliaire de battage, la fréquence de battement des cils devrait théoriquement revenir à la fréquence de battement normal après le retrait de ces agents pharmacologiques.
Une étape cruciale dans ce protocole est principalement liée à la manipulation du tissu cérébral et le temps nécessaire pour compléter l'expérience. Il est impératif de traiter les tissus du cerveau en douceur afin de préserver la structure et la fonction des cils épendymaire ainsi que pour réduire le traumatisme au tissu fragile. Plus important encore, et pour éviter la détérioration et la mort du tissu cérébral, ce qui pourrait être un facteur limitant pour le succès de cette technique, il est fortement red que les mesures liées à cette technique sont effectuées en tant que près d'une heure que possible. Toutefois, cette limitation pourrait être surmonté à l'avenir avec les progrès de la culture et épendymaire croissance ou types de cellules similaires avec cils mobiles in vitro ou à l'utilisation de milieux nutritifs alternative. L'utilisation d'autres milieux nutritifs, tels que aCSF et des sels de Earle pour l'incubation des coupes de cerveau a été démontré dans la littérature 5. Cependant, dans les mains, l'utilisation de DMEM / haut-glucose était plus avantageux que aCSF probablement en raison de la présence d'une quantité élevée de glucose (4,500 mg / ml) dans le milieu en tant que source d'énergie potentielle. Ainsi, le principal critère utilisé pour évaluer la viabilité du tissu et donc la validité de l'approche évalue cils battre, car cela est un signe représentatif de cellules vivantes.
Imagerie en temps réel des cils épendymaire offre un outil puissant pour analyser les voies de signalisation en aval de l'activation des cilstels que la signalisation du calcium et oscillations. Par exemple, en utilisant l'imagerie de fluorescence en temps réel, il a été démontré que, quel que soit le type de la cellule épendymaire / cils, les cellules épendymaires sont caractérisés par les propriétés uniques de calcium 10 d'oscillation. Dans l'ensemble, ce protocole est pertinente à la fois les connaissances scientifiques de base et la pratique clinique. Du point de vue de la science fondamentale, cette technique offre une évaluation des rôles fonctionnels et physiologiques de la structure des cils épendymaire, la fonction et les voies de signalisation en aval mécanistes. Du point de vue de la pratique clinique, cette méthode est très pertinente pour la recherche de médicaments qui ciblent les cils épendymales comme une nouvelle cible thérapeutique pour les troubles neurologiques tels que l'hydrocéphalie et l'abus d'alcool.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).
