Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיה חיה של צילה Ependymal בחדרים לרוחב של מוח העכבר

Published: June 1, 2015 doi: 10.3791/52853
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1
1Department of Pharmacology and Experimental Therapeutics, University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2Life Sciences Institute, University of Michigan, 3Department of Biomedical & Pharmaceutical Sciences, Chapman University, School of Pharmacy, Rinker Health Science campus

Summary

באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC), תצפית vivo לשעבר של המכות של cilia ependymal ניע ממוקם בתוך החדרים במוח העכבר באה לידי ביטוי בחי הדמיה. הטכניקה מאפשרת הקלטה של ​​תדר מכות הריסים הייחודי וזווית מכות וכן נכסי צעדה תנודת סידן תוך תאי שלהם.

Abstract

תאי ependymal Multiciliated שורת חדרי הלב במוח הבוגר. פונקציה או מבנה של cilia ependymal חריגים קשור עם גירעונות נוירולוגיות שונים. הדמיה החיה vivo לשעבר של טכניקת cilia ependymal ניע הנוכחי מאפשר למחקר מפורט של דינמיקת הריסים לאחר מספר צעדים. צעדים אלה כוללים: עכברי המתת חסד עם פחמן דו חמצני על פי פרוטוקולים של האוניברסיטה המוסדית הטיפול בבעלי חיים של טולדו וועדת שימוש (IACUC); craniectomy ואחריו הסרת מוח ונתיחת מוח sagittal עם vibratome או להב חד להשיג חלקים דקים מאוד בחדרים לרוחב המוח, שבו cilia ependymal ניתן דמיינו. דגירה של פרוסות של המוח בצלחת זכוכית תחתונה מותאמת אישית המכילה בינוני של הנשר (DMEM) / גבוהה גלוקוז השתנה Dulbecco על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 95% O / 5% 2 / CO תערובת 2 היא חיונית כדי לשמור על רקמת חיים במהלךהניסוי. וידאו של מכות cilia אז נרשם באמצעות מיקרוסקופ התערבות ההפרש לעומת זאת ברזולוציה גבוהה. הווידאו לאחר מכן נותח על ידי מסגרת מסגרת לחשב את תדירות פעימות הריסים. זה מאפשר סיווג שונה של תאי ependymal לשלוש קטגוריות או סוגים מבוססים על התדירות וזווית מכות הריסים שלהם. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת שימוש בניתוח הדמיה הקרינה במהירות גבוהה כדי לאפיין את המאפיינים הייחודיים תאיים תנודת סיד של תאי ependymal כמו גם את ההשפעה של סוכנים תרופתיים על תנודות סידן ותדירות מכות הריסים. בנוסף, טכניקה זו היא מתאימה להדמיה immunofluorescence ללימודי מבנה הריסים ולוקליזציה חלבון הריסים. הדבר חשוב במיוחד במחקרי אבחון המחלה ופנוטיפ. המגבלה העיקרית של הטכניקה מיוחסת לירידה בתנועת ריסי ניע לחיות כמו רקמת המוח מתחילה למות.

Introduction

Cilia הם אברונים המבוסס על microtubule חושיים הנמשכים מתא השטח לסביבה תאית. בהתאם לארגון microtubule, cilia יכול להיות מסווג לשני סוגים - "9 + 0" או "9 + 2". מבחינה תפקודית, המבוסס על התנועה שלהם, אלה יכולים להיות מסווגים כריסי ניע או אי-ניע 1. cilia העיקרי הוא מונח נפוץ לציון "9 + 0" cilia לא ניע. אלה שיש לי תשעה microtubules מקביל כפיל (כונה על ידי '9') וזוג microtubules מרכזי נעדר בתוך הנדן המרכזי (כונה על ידי '0'). עם זאת, כמה ריסי "9 + 0", כגון cilia קטרי, המסדירים בין צדדים, עובר הם ניעתי 2. מצד השני, cilia ניע מתאפיינים, בנוסף לתשע כפילויות microtubule המקבילות, על ידי זוג מרכזי נוסף של כפילויות microtubule וקשורות לחלבוני מנוע dynein כדי להקל על תנועתיות. בנוסף, כמה "9+2 "Cilia כגון cilia חוש הריח הוא לא ניע 3. תאים המצפים את Ependymal חדרים במוח והתעלה של חוט השדרה המרכזית מאופיינים בריסי ניע המניעים את הנוזל השדרתי (CSF) לאורך 4 חדרים במוח.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להקל לומדת את דינמיקת cilia ומומים מבניים ניע. בריאות המוח ופיתוח תלויה במידה רבה על זרימה יעילה של CSF בתוך החדרים במוח. לדוגמא, זרימת CSF רגילה ומאזן נוזלים דורשים מכות רגילות וcilia הפונקציונלי ependymal 5,6, אשר בתורו לשחק תפקידים קריטיים בויסות התנועה כיוונית של תאים עצביים ותאי גזע הגירת 7. ככזה, תפקוד לא תקין ependymal cilia או מבנה יכול להוביל לזרימת CSF חריגה, אשר מזוהה עם הידרוצפלוס, מצב רפואי שבו יש הצטברות חריגה של CSF בחדרי הלב של bגשם. זה עשוי כתוצאה מכך לגרום להגברת לחץ תוך גולגולתי וגדלה הדרגתית של הראש, עווית, ראיית מנהרה, ונכות נפשית 8.

היתרונות של שיטה זו על פני שיטות קיימות הוא שזה אפשר בפעם הראשונה לדווח שלושה סוגי תאים שונים ependymal: I, II ו- III, המבוסס על התדר שלהם ייחודי מכות הריסים ולהכות זווית. תאי ependymal אלה מקומיים באזורים מסוימים בחדרים במוח. יתר על כן, את ההשפעות של גיל וסוכנים תרופתיים כגון אלכוהול וcilostazol על שינוי סוגי תאי ependymal או המגויר ניתן להדגים, שלא היה אפשרי לפני סיווג זה של תאי ependymal. Cilostazol הוא מעכב של phosphodiesterase-3, אנזים שחילוף חומרי cAMP לAMP וזה גם מסדיר סידן תוך תאי 9. באמצעות ניתוח הדמיה הקרינה במהירות גבוהה מאפשר הדמיה וכימות של תאית הייחודימאפייני תנודת סידן של תאי ependymal. לדוגמא, האלכוהול וcilostazol שינו באופן משמעותי את תדירות ependymal מכות הריסים כמו גם את מאפייני תנודות סידן תוך תאי, אשר בתורו, יכול להוביל לשינוי בהחלפת נפח הנוזל השדרתי ידי cilia ependymal 10. לסיכום, טכניקה זו הייתה מפתח כדי לספק את העדות הראשונה משלושה סוגים שונים של תאי ependymal עם מאפייני תנודת סידן שונים.

בסעיף הבא, סקירת צעד-אחר-צעד מפורטת של ההליך מסופקת, הקדשת תשומת לב להכנה וטיפול ברקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הנהלים לשימוש בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) של אוניברסיטת טולדו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים במכון הלאומי לבריאות והמדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה.

1. הפקת מוח, הכנת חתך ורקמות

  1. להקריב C57BL זן עכבר wild-type / 6 על ידי עמוק והרדמת חסד עם CO 2 מחנק במשך 5 דקות. הבטח מוות על ידי נקע בצוואר הרחם.
  2. נקה את ראש העכבר עם 70% אתנול.
  3. בצע craniectomy באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליות על ידי משיכת הראשונה את העור, החל בחלק העליון של הראש כדי לחשוף את הגולגולת.
  4. לאחר מכן, כאשר הגולגולת חשופה, להסיר את הגולגולת על ידי קילוף פיסה-ידי חלקים העצם, החל מהצד האחורי ונע לעבר הצד הקדמי. היה זהיר כדי לא להרוס את החדרים במוח.
  5. לאסוף את כל המוח.
  6. מניחים את המוח בצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה DMEM / גבוהה גלוקוז בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ו 1% פתרון פניצילין / סטרפטומיצין המכיל 10,000 / מיליליטר יחידות של פניצילין ו10,000 מיקרוגרם / מיליליטר של סטרפטומיצין ומחומם מראש עד 37 מעלות צלזיוס.
  7. פורסים את המוח על מטוס sagittal החציוני ביד עם סכין חד, ולקבל את סעיף 100-200 מ"מ הראשון מכל מחצית באמצעות vibratome.
  8. יש לשטוף את רקמת המוח עם פתרון פוספט C מראש חימם 37 מעלות נאגרו מלוח (1X PBS).
  9. מייד למקם את סעיף המוח בDMEM / תקשורת גבוהה גלוקוז מחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס.

2. בשידור חי הדמיה תצורה והתקנה

  1. מניחים את חלקי רקמת המוח בתרבות מנות 30 מ"מ זכוכית תחתונה המכילות 1 מיליליטר של תקשורת גבוהה גלוקוז DMEM /. התאם סביבת התא הסגורה של מיקרוסקופ כדי 37 מעלות צלזיוס, 95% / 5% 2 / CO תוכן 2 O (איור 1
  2. שימוש בעדשת טבילת שמן אובייקטיבית 60x, לאסוף את תאי ependymal / תמונות cilia על ידי הנחת ראשון טיפת שמן על העדשה האובייקטיבית 60x ומתמקד בתאים עם דסק"ש הרגיל מועבר אור.
  3. לאחר מכן, בצע את הכיוון של תנועת בועת DMEM כמדריך למיקום של cilia ependymal ניע כמכות הריסים ליצור סוג של תנועת בועה באזור. בחר אזור המכיל תאים בריאים עם cilia ניע בחדר לרוחב של המוח באמצעות מסנן דסק"ש. ברגע שcilia ependymal נמצא, להתאים את האור ולהתמקד כדי להשיג תמונת משביעת רצון.
  4. הגדר את הפרמטרים ההדמיה לחיות לפי מטרה ספציפית באמצעות תוכנת הדמיה Metamorph. בהפגנה הנוכחית, לרכוש עשרים תמונות ארבעה סיביות עם סט binning מצלמה עד 1 x 1 בשילוב עם 60x האובייקטיבי ו5-10 זמן חשיפת msec.
  5. לאסוף את תמונות דסק"ש על ידי פתיחת צמצם מיקרוסקופ לרמה אופטימלית על מנת לקבל Exp מינימוםזמן osure. שים לב זרם תמונות בזמן אמת למצלמה כדי לספק רכישת תמונה מהירה ומיידית ללא דיחוי. לחשב את המהירות של מכות cilia מבוסס על הדרישה של זמני חשיפה מינימאליים להשגה לעומת תמונה מספיק.

נתונים להדמיה 3. וניתוח

  1. לחשב את מספר מכות ריסים על ידי ספירת מספר המכות בדקות 1. עושה זאת על ידי הפחתת המהירות של הווידאו ולספור את מספר הפעימות באמצעות דלפק תא או כלי דומה.
  2. כדי לחשב את התדירות של מכות, להכפיל את זמן החשיפה שבווידאו שהוקלט במספר המסגרות או תמונות זמן לשגות רכשו כדי לקבל את מספר שניות. (לדוגמא: זמן חשיפה 5 אלפיות שניים 200 מסגרות = 1,000 אלפיות שני או 1 שניות).
  3. לחשב את מספר המכות בשנייה אחת כדי לקבל את התדר שמתבטא במספר מכות לשניות אחד. עושה זאת על ידי חלוקת מספר מכות ריסים מעל השאר זמן של שנייה אחתval (לדוגמא: cilia פעימות 50 פעמים בוידאו 200 מסגרות נרשמו בזמן חשיפה של 5 אלפיות השני כלומר 5 אלפיות השני x 200 מסגרות = 1 שניות; החברה תחלק 50 פעימות בשנייה 1 = 50 הרץ).
  4. חשב את זווית מכות הריסים על ידי הערכת הדרך שננקטה על ידי cilia ependymal במהלך שתי פעימות הכח והתאוששות. בצע זאת על פי שיטה שתוארה קודם לכן, עם שינויים קלים 11. התנועה המדויקת של cilia הבודד הוא ציין במהלך מחזור הפעימה המלא.
  5. בגיליון אצטט הונח על הצג, למתוח קו אופקי לאורך קצה ependymal וקו אנכי דרך עמדת קו האמצע של cilia בתחילת שבץ הכח.
  6. העלילה המיקום המדויק של מסגרת cilium ידי מסגרת כפי שהוא נע קדימה בשבץ הכח. באופן דומה, העלילה התנועה של cilia בשבץ ההתאוששות.
  7. חשב את זווית מכות הריסים מסטיית המרבית של cilium מקו האמצע בtהוא שבץ כוח, כמו גם שבץ ההתאוששות.

4. סידן איתותים הקלטה

  1. לאחר חיתוך המוח, לשטוף בקצרה את פרוסת המוח עם 1x PBS או PBS של Dulbecco (pH 7.0). הכן Fluo-2 טריים, כדי למנוע מרווה הקרינה ולקבל יחס אות לרעש טוב.
  2. הכן 1 פתרון מניות מ"מ של Fluo-2 פתרון בdimethylsulfoxide (DMSO), לערבב ומערבולת הפתרון לפחות 5 דקות כדי להבטיח שFluo-2 הוא מומס homogenously בDMSO.
  3. לדלל את פתרון Fluo-2 מניות ב 500 מיליליטר של DMEM / גבוהה גלוקוז בתוספת 2% B27 מראש חימם עד 37 ° C לריכוז סופי של 20 מ"ג / מיליליטר.
    הערה: B-27 היא תוספת סרום ללא מותאמת המכילה ויטמין A, קוקטייל נוגד חמצון ואינסולין המשמש לתמיכת כדאיות קצרה או לטווח ארוך של היפוקמפוס ונוירונים במערכת העצבים המרכזית אחרים.
  4. מייד דגירה פרוסת המוח עם 20 מ"ג / מיליליטר Fluo-2 למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בצלחת זכוכית תחתונה.
  5. כדי לקבוע את ריכוז הטעינה האופטימלי של סידן fluorophore Fluo-2 ולהימנע מרעילות צבע סידן תא, תאי אתגר עם ATP, ולבדוק את כדאיות תא על ידי קביעת כמובן הזמן וגודל שיא של אותות סידן בתגובה ל- ATP.
  6. להקליט את הווידאו לתנודת סידן בשיעור של 5 אלפיות שניים לכידה למינימום של 1 שניות (200 מסגרות לשנייה), עם אורכי גל עירור ופליטה של 488 ננומטר ו515 ננומטר, בהתאמה (סרט 2).
  7. כדי להבדיל את אות Fluo-2 סידן מחפצי autofluorescence או תנועה, להבטיח כי את העוצמות הנפלטות ב515 ננומטר היא פיקוח בנפרד.
    הערה: Fluo-2 הוא לא fluoremetric סידן המתאים לכמת סידן תוך תאי. עם זאת, זה צבע סידן דינמי מצוין כדי לזהות שינויים בסידן במהירות, כגון תנודות סידן. לכימות מדויק יותר סידן, פורע-2 מומלץ. עם זאת, השינויים הדינמיים של הפורע-2 מוגבלים על ידי ratiometricהטבע של הצבע.
  8. בצע את נוסחות הניתנות על ידי היצרן כדי לחשב את ערכי סידן המדויקים חופשיים תאיים. דוגמא [Ca 2 +] = ד K × (R - R דקות) (מקסימום R - R) /. איפה ד K הוא קבוע דיסוציאציה של הצבע מסידן שוחרר, R הוא הקרינה שנמדדה ב 488, ודקות R ומקסימום R הם יחס הקרינה במינימום ומקסימום ריכוז יון 12.

5. Immunofluorescence מיקרוסקופית

  1. לתקן את החלקים במוח עם תמיסת מלח שנאגרו פוספט המכילה paraformaldehyde 4% (PFA) וסוכרוז 2% למשך 10 דקות. לחלופין, לתקן את כל המוח עם 4% סעיף PFA ולאחר מכן לתוך 50 חלקי מ"מ באמצעות cryostat.
  2. שטוף את הרקמה שלוש פעמים עם 1x PBS במשך 5 דקות בכל פעם.
  3. דגירה פרוסת המוח עם solutiעל של 0.1% Triton-X ב1x PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS במשך 5 דקות בכל פעם.
  4. דגירה פרוסת המוח עם נוגדן ראשוני עכבר, antiacetylated טובולין, המשמש בדילול של 1: 5000 ב 10% FBS ב1x PBS לשעה אחת בטמפרטורת חדר (RT) או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. שטוף את הרקמה שלוש פעמים עם 1x PBS במשך 5 דקות בכל פעם.
  6. דגירה הפרוסה המוח בנוגדנים משני, אנטי עכבר IgG והעמסת בדילול של 1: 500 FBS ב 10% בפתרון PBS 1x עבור שעה 1 ב RT.
  7. לפני התצפית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, counterstain הסעיף 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) במשך 5 דקות כדי להכתים את הגרעין (או DNA) 13. כדי למזער photobleaching, תמונת החלקים מייד עם זמן חשיפה מינימאלי אפשרי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מדידת פונקצית cilia ependymal במוח עכבר החי

השיטה המתוארת בפרוטוקול זה משמשת כדי לפקח פונקצית ependymal cilia ומבנה ברקמה הטרי גזור ממוח העכבר, כמו גם לפקח וללמוד תדירות מכות cilia. הצעדים אחריו כדי להשיג ניסוי שלם מתוארים בתרשים זרימה סכמטי (איור 1). מומלץ מאוד כי הניסוי נערך במסגרת זמן קצרה על מנת לשמור על ריסי ניע פעילים ככל האפשר. סרט הזמן לשגות נציג ותמונות של תאי ependymal וcilia ניעם מוצגים גם (סרט 1 ואיור 2 א). ניתוח נתונים בזרם מתקבל מושגת על ידי ספירת דפוס מכות וזווית של cilia נע. הקריטריונים לחלוקת cilia לשלושה סוגים מוצגים בטבלה 1. הנוכחות של cilia ependymal היא confirmed עם סמן הריסים, acetylated-טובולין, ותאי ependymal הם counterstained עם DAPI (סמן ה- DNA) כדי להראות את הגרעין (איור 2b). בהתבסס על התצפיות של תאי ependymal בחדר לרוחב המוח מלפחות 22 ניסויים בלתי תלויים שלנו, היינו יכול לסווג תאי ependymal לשלושה סוגים המבוססים על תדר מכות הריסים שלהם. יתר על כן, הראינו כי אתנול בריכוז 0.25% מודחקים תדירות מכות ריסים באופן משמעותי ללא קשר לסוג שלהם (איור 3). יותר מכך, נתונים אלה הם בעקביות עם הממצאים הקודמים שלנו 10.

איתות סידן מדידה על ידי cilia ependymal

זה כבר הראה בעבר כי כיפוף של cilia יכול לעורר סידן תוך תאי cilium תלוי איתות 14-16. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבחון ולמדוד את אות סידן תוך תאי בתוך החדרים במוח > (סרט 2) .One יכול ליישם מתודולוגיה דומה כדי להקליט תנודות סידן cytosolic בתגובה להפעלת cilia ependymal או בתגובה לטיפול עם סוכנים תרופתיים. כדי לבחון סידן cytosolic, הרקמה טופחה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם מחוון סידן, Fluo-2. תמונות בשידור חי של תנודה / רמת סידן cytosolic הם מוזרמים באורכי גל העירור ופליטה של ​​488 ו 515 ננומטר, בהתאמה.

איור 1
איור 1:. תרשים זרימה פרוטוקול ההדמיה cilia Ependymal פרוטוקול ההדמיה cilia Ependymal ממחיש צעדים כדי להשלים את ניסוי החל מbrainextraction העכבר, חתך והכנת רקמה לרכישת תמונה וניתוח. ציר זמן משוער שעה אחת מוצג בהליך צעד-אחר-צעד.

"Src =" דואר 2 "/> / קבצים / ftp_upload / 52,853 / 52853fig2.jpg
איור 2:. לוקליזציה cilia Ependymal בחדרים במוח המוצג כאן הם תאי ependymal מהחדר לרוחב של מוח עכבר. (א) תמונות DIC של תאים בודדים ependymal (חיצים תחתון) וריסים (חיצים למעלה) מוצגות. (ב) תמונת כיסוי של סעיף מוח מוכתמת עם נוגדן נגד סמן הריסים, acetylated טובולין, מוצג ב( חיצים למעלה) ירוקים, וcounterstained עם סמן גרעיני / DNA, DAPI, מוצג ב( חיצים למטה) הכחולים . אנא שים לב כי לוחות וב מייצגים חלקים שונים במוח.

איור 3
איור 3:. אלכוהול והבדלים בcilia להכות תדרים בין סוגי תאי ependymal של החדר לרוחב מוח עכבר פרוסת מוח vivo לשעבר הודגרה ללא (בקרה) או עם (Ethanol) אלכוהול 0.25% במשך 5 דקות. בהשוואה לשליטה, טיפול אלכוהול ירד באופן משמעותי בתדירות מכות cilia, כפי שצוין על ידי כוכבית. לפחות 5-10 הכנות עצמאיות שמשו לכל קבוצת ependymal סוג התא וטיפול.

סרט 1: הקלטה של cilia ependymal בIII תאי ependymal סוג המוצג כאן הן הקלטות של cilia ependymal, מאופיינות במכות תדירות וזווית ייחודית לסוג III תאי ependymal מהחדר השלישי של המוח.. נתון זה כבר דווח בעבר 10 והיה בשימוש חוזר ברשות.

סרט 2: תנודת סידן תוך תאים בתאי ependymal מוצג כאן הן הקלטות של תנודות סידן של תאי ependymal דרך סעיף לאוורור לרוחב של המוח.tricle לאחר דוגרים פרוסת המוח עם 20 מ"ג / מיליליטר מחוון סידן, Fluo-2, למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס. רמת סידן של חלק המוח נחקרה וצבעוני פסאודו. בר הצבע מציין רמת סידן 'תאי ependymal; איפה ושחור-סגול אדום-צהוב מייצג רמות סידן נמוכות וגבוהות, בהתאמה. לכימות סידן תוך תאי, סידן תא ependymal יחושב מכמה תאי ependymal פרט, כאמור בטקסט הפרוטוקול וממוצע בין קבוצות שליטה וטיפול. הווידאו של תנודת סידן נרשם ב 200 פריימים לשנייה עם אורכי גל עירור ופליטה של ​​488 ננומטר ו515 ננומטר, בהתאמה. נתון זה כבר דווח בעבר 10 והיה בשימוש חוזר ברשות.

סוג תא Ependymal תדירות מכות cilia זווית מכות cilia
אני סוג > 60 הרץ <90 °
סוג השני 30-60 הרץ 90-135 °
סוג שלישי <30 הרץ > 135 °

טבלת 1:. סוגים של cilia ependymal סיווג cilia ependymal לסוג I, II או III התבססה בעיקר על תדירות המכות ומכות זווית של cilia ependymal ממוקם בתוך אזורים שונים של החדר השלישי של המוח. חלקים של זה הנתונים שדווחו בעבר ונעשו שימוש חוזר כאן ברשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שתואר כאן הוא פרוטוקול להכנת רקמת מוח עכבר עבור שתי חיות-הדמיה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי המספק תצפית קרובה מהירה ורגישה של cilia ependymal בתוך החדרים במוח. טכניקה זו אינה מוגבלת לחדר לרוחב בלבד; זה יכול להיות מנוצל כדי לבחון את הריסים בחדרים במוח אחרים. טכניקת הדמיה זה מספקת זרם חי דומה לתנועה של CSF על ידי מכות הריסים בהגדרת vivo לשעבר. יתר על כן, היא מאפשרת ניתוח של התנועה כיוונית של cilia. זה בעיקר הקל על ידי השימוש במערכת הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה דסק"ש ו. יתרונה של מערכת זו הוא שמיקרוסקופ סגור בתא סביבתי, המאפשר לויסות עדינה של טמפרטורה, לחות ו- CO 2 רמות. אלה הם פרמטרים קריטיים מאוד שיש לשקול להישרדות של תאים ורקמות בעת ביצוע exper הדמיה חיהiments. המערכת מצוידת גם עם מודולים אוטומטיים XY ו- Z כמו גם מחליף מסנן מצלמה ואורך הגל דיגיטלי, שכולם תכונות חשובות כדי להקל על הדמיה של התנהגויות הסלולר דינמיות כגון תנועות ריסים. המיקרוסקופ מחובר למחשב והרכישה של תמונות באיכות גבוהות היא הקלה על ידי ההדמיה תוכנה.

שימוש בטכניקה זו כדי לסווג תאי ependymal לסוגים שונים מציע התקדמות משמעותית על פני שיטות קיימות / קודמות שימשו ללמוד cilia ependymal. לדוגמא, את ההשפעה של סוכנים מסוימים תרופתיים או רעילים כגון אלכוהול יכולה להיות ממוזערת אחרת או ביטלה אם תאי ependymal נחשבים כאוכלוסייה אחת 17. חשוב לזכור כי, למרות שהמאפיינים של cilia להכות תדרים וזוויות שונים מאוד בין שלושת סוגים אלה של cilia ependymal, יש לנו רק התחילו להבין את הפיסיולוגיה של תאים אלה. לפיכך, על פי העבודה הקודמת שלנו, הסיווג שלנו הוא חזק מספיק אם ההליך מתבצע כראוי כפי שתואר בפרוטוקול זה.

זיהוי cilia ependymal הברור הוא חשוב ביסודו כדי להשיג הבנה בסיסית של הפיסיולוגיה ependymal. שיטה זו מאפשרת להבחין בין שלושה סוגים שונים של תאי ependymal ייחודיים ובמיוחד ממוקמים בתוך החדר השלישי בכל הקשור לתדירות המכות וזווית, שהוביל לסיווג לשלושה סוגים שונים (טבלה 1). על מנת לאשר כי ההבדלים בcilia להכות תדרים אינם בשל הבדלים ביכולת הקיום של תאי ependymal או להבדלים בגיל בעלי החיים, מומלצת שרצועות רק בשלמותה ולא אובייקטיביות ependymal או פרוסות שמחוברות לרקמות עצביות וב לפחות 100 מ"מ עובי משמש. יתר על כן, תדירות מכות הריסים יש למדוד במקומות שונים לאורך כל קטע ependymal. אנחנו הוכחנו בעבר כי נתוני תדר פעימת הריסים שנוצרו באמצעות טכניקה זו היה לשחזור באופן עקבי בין 87 תצפיות ניסיוניות 10. לפיכך, תאי ependymal הם מדויקים מסווגים בהתאם למכות הריסים שלהם. יתר על כן, בעת שימוש בסוכנים תרופתיים אשר ידוע להפחית את תדירות פעימות הריסים, תדירות פעימות cilia צריכה תיאורטית לחזור לתדירות פעימות נורמלית לאחר הסרת הסוכנים תרופתיים אלה.

שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא בעיקר קשור לטיפול ברקמת המוח ואת הזמן הדרוש כדי להשלים את הניסוי. זה הכרחי כדי להתמודד עם רקמת המוח בעדינות כדי לשמר את המבנה ותפקוד של cilia ependymal כמו גם להפחית את הטראומה לרקמה השבירה. יותר חשוב, וכדי למנוע הידרדרות ומוות של רקמת המוח, שיכול להיות גורם מגביל להצלחה של טכניקה זו, זה recommende ביותרד כי הצעדים הקשורים לטכניקה זו מבוצעים בקרובה לשעה אחת ככל האפשר. עם זאת, מגבלה זו ניתן להתגבר בעתיד עם ההתקדמות בculturing וependymal גדל או סוגים דומים תא עם cilia ניע במבחנה או בשימוש באמצעי תקשורת תזונתי החלופי. השימוש במדיה תזונתיים חלופיים כגון aCSF ומלחים של ארל לדגירה של פרוסות המוח הודגם בספרות 5. עם זאת, בידיים שלנו, השימוש בDMEM / גבוהה גלוקוז היה מועיל יותר מאשר aCSF אולי בשל נוכחותם של כמות הגבוהה של גלוקוז (4,500 מ"ג / מיליליטר) במדיום כמקור אנרגיה פוטנציאלי. לפיכך, הקריטריון העיקרי המשמש להערכת הכדאיות של הרקמות ומכות cilia מכאן את תוקפו של הגישה בוחן, כזה סימן נציג של תאי חיים.

הדמיה חיה של ריסי ependymal מציעה כלי רב עוצמה כדי לנתח מסלולי איתות במורד הזרם של הפעלת ciliaכמו איתות סידן ותנודות. לדוגמא, באמצעות הדמיה הקרינה חיות, זה כבר הוכיח כי ללא קשר לסוג התא / cilia ependymal, תאי ependymal מתאפיינים בתכונות ייחודי תנודת סידן 10. בסך הכל, בפרוטוקול זה הוא רלוונטי לשני ידע מדעי בסיסי וקליני. מנקודת המבט המדעית הבסיסית, טכניקה זו מציעה הערכה של התפקידים הפונקציונליים ופיסיולוגיים של מבנה ependymal cilia, פונקציה ומסלולי איתות מכניסטית במורד הזרם. מנקודת המבט הקלינית בפועל, שיטה זו היא רלוונטית ביותר לחיפוש תרופות המכוונות cilia ependymal כמטרה טיפולית חדשה לטיפול בהפרעות נוירולוגיות כגון התעללות הידרוצפלוס ואלכוהול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/HIGH GLUCOSE Cellgro Mediatech Inc. 10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30088-03
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific SV30010
Phosphate buffered saline Thermo Scientific SH30256-01
Paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 15710-SP
Sucrose Sigma-Aldrich S-2395
Triton-X Sigma-Aldrich T9284
Fluo-2  TEF Labs #0200
DMSO
B27 Gibco 17504044
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1500
Anti-acetylated a-tubulin antibody Sigma-Aldrich T7451  clone 6-11B1
FITC Anti-mouse antibody Vector Labs FI-2000
Cell Culture plate VWR Vista Vision 30-2041
Cover Slip (18 x 18) VWR Vista Vision 16004.326
Vibratome Leica Biosystems Leica VT1200S
Cryostat Leica Biosystems Leica CM1860
Inverted Fluorescence Microscope Nikon  Nikon TE2000 60X oil 
Microscope cover glass 24 x 60 mm2 VWR Vista Vision 16004-312
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1500
DAPI filter cube Chroma Technology

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
  2. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  3. Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
  4. Delbigio, M. R. The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
  5. Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
  6. Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
  7. Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
  8. Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
  9. Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
  10. Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
  11. Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  12. Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
  13. AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
  14. AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
  15. Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
  16. Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
  17. Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).

Tags

Neuroscience גיליון 100 cilia ניע חדר לרוחב נוזל השדרתי הדמיה לחיות הידרוצפלוס.
הדמיה חיה של צילה Ependymal בחדרים לרוחב של מוח העכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Al Omran, A. J., Saternos, H. C.,… More

Al Omran, A. J., Saternos, H. C., Liu, T., Nauli, S. M., AbouAlaiwi, W. A. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (100), e52853, doi:10.3791/52853 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter